Name: assaying for inorganic polyphosphate in bacteria
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00
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Este proyecto fue apoyado por la Universidad de Alabama en Birmingham Departamento de Microbiología Inicio fondos y NIH subsidio R35GM124590 (MJG) y NIH subsidio R01AI121364 (FW).

1. purificación de levadura Exopolyphosphatase (ScPPX)
<ol><li>Transformar la tensión de sobreexpresión de proteína de e. coli BL21(DE3)31 con el plásmido pScPPX26 por electroporación32 o33de la transformación química.</li>
	<li>Inocular 1 L de caldo de lisogenia (LB) que contiene 100 ampicilina de μg mL-1 en un matraz de 2 L unbaffled con una sola Colonia de BL21(DE3) que contienen pScPPX2 e inc...

El protocolo descrito aquí simplifica y acelera la cuantificación de los niveles de pólipo en diversas bacterias, con un conjunto típico de 24 muestras tomando aproximadamente 1,5 h a totalmente proceso. Esto permite la detección rápida de muestras y análisis de bibliotecas mutantes y simplifica experimentos cinéticos miden la acumulación de pólipo en el tiempo. Hemos demostrado que el protocolo funcione eficazmente a los representantes de tres filos diferentes: proteobacteria, firmicutes y actinobacteria, que ...

Polifosfato inorgánico (pólipo) es un biopolímero lineal de unidades de fosfato phosphoanhydride-ligado que se encuentra en todos los ámbitos de la vida1,2,3. En diversas bacterias, pólipo es esencial para la respuesta de estrés, motilidad, formación de biopelículas, control del ciclo celular, resistencia antibiótica y virulencia4,5,6,7,8 ,9,10,11. Estudios de metabolismo del polyP en bacterias por lo tanto tienen el potencial para producir penetraciones fundamentales en la capacidad de las bacterias que causan enfermedad y prosperan en ambientes diversos. En muchos casos, sin embargo, los métodos disponibles para cuantificación de pólipo en las células bacterianas son un factor limitante en estos estudios.
Hay varios métodos usados actualmente para medir los niveles de pólipo en materiales biológicos. Estos métodos generalmente involucran dos pasos distintos: extracción de pólipos y cuantificar el pólipo presentes en esos extractos. El método estándar de oro actual, desarrollado para la levadura Saccharomyces cerevisiae por Bru y colaboradores12, pólipo extractos junto con ADN y ARN con fenol y cloroformo, seguido por la precipitación del etanol, el tratamiento con Desoxirribonucleasa (DNasa) y ribonucleasa (Rnasa) y digestión del pólipo purificado resultante con la S. cerevisiae degradantes pólipo enzima exopolyphosphatase (ScPPX)13 fosfato libre, que luego se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico basados en verde malaquita. Este procedimiento es altamente cuantitativa pero que requieren mucho trabajo, limitar el número de muestras que puede procesar en un solo experimento y no está optimizado para las muestras bacterianas. Otras personas han reportado extracción de pólipo de una variedad de células y tejidos utilizando granos de sílice "(glassmilk del) o silicona membrana columnas6,14,15,16,17, 18. Estos métodos no extraer eficientemente pólipo (menos de 60 unidades de fosfato) de cadena corta12,14,15, aunque esto está de menos preocupación por las bacterias, que generalmente se cree que sintetizan principalmente Pólipo de cadena larga3. Los métodos antiguos de extracción de pólipo usando ácidos fuertes19,20 se ya no utilizan, ya que el pólipo es inestable bajo condiciones ácidas12.
También hay una variedad de métodos reportados para la cuantificación del pólipo. Entre las más comunes es 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), un colorante fluorescente más típicamente usado para teñir ADN. Complejos de DAPI-pólipo tienen maxima de excitación y de emisión de fluorescencia diferentes a DAPI-ADN complejos21,22, pero hay considerable interferencia de otros componentes celulares, incluyendo el ARN, nucleótidos y inositol los fosfatos12,15,16,23, reducción de la especificidad y sensibilidad de las mediciones de pólipo realizadas con este método. Alternativamente, se pueden convertir en trifosfato de adenosina (ATP) mediante purificada Escherichia coli pólipo y Adenosín difosfato (ADP) cinasa de pólipo (PPK) y el ATP resultante cuantificadas usando luciferasa14,17 ,18. Esto permite la detección de cantidades muy pequeñas de pólipo, pero requiere dos pasos de la reacción enzimática y luciferin y ADP muy puro, que son reactivos caros. ScPPX específicamente resúmenes de pólipo de fosfato libre6,12,13,24, que pueden detectarse mediante métodos más simple, pero ScPPX es inhibida por el DNA y el RNA12, necesidad tratamiento de DNasa y Rnasa de pólipo que contiene extractos. Ni PPK ni ScPPX están comercialmente disponibles, y purificación de PPK es relativamente complejo25,26.
Pólipo en lysates de la célula o extractos también puede ser visualizado en geles de poliacrilamida por negativo27,28,29,30, un método que permite la evaluación de la longitud de la cadena, pero es la coloración de DAPI bajo rendimiento y mal cuantitativa.
Ahora divulgamos un ensayo rápido, barato, medio rendimiento pólipo que permite la cuantificación rápida de pólipo niveles en diversas especies bacterianas. Este método comienza por lisis de las células bacterianas a 95 ° C de (GITC) el isotiocianato de guanidina 4 M14 para inactivar fosfatasas celulares, seguidas por una extracción de columna de membrana de sílice optimizada para el procesamiento rápido de múltiples muestras. El extracto que contiene el pólipo resultante luego se digiere con un exceso de ScPPX, eliminando la necesidad para el tratamiento de DNasa y Rnasa. Incluimos un protocolo para la purificación de afinidad níquel directa de cantidades de mg de ScPPX. Finalmente, derivado de pólipo libre fosfato es cuantificado con un ensayo colorimétrico simple, sensible, basada en el ácido ascórbico24 y normalizado a la proteína celular total. Este método optimiza la medición del polyP en células bacterianas, y demostrar su uso con especies representativas de las bacterias Gram negativas, bacterias Gram-positivas y micobacterias.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pScPPX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112877</td>
			<td>available to academic and other non-profit institutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-2</td>
			<td>E. coli growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP176025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>H-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250500</td>
			<td>for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6070106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Universal Nuclease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI88700</td>
			<td>Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 120 Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-120</td>
			<td>other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL HiTrap chelating HP column</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17040901</td>
			<td>any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nickel(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC415611000</td>
			<td>for charging HiTrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 &#181;m pore size cellulose acetate syringe filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-302-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-667B</td>
			<td>other dialysis membranes with MWCO &#60; 30,000 Da should also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>for adjusting the pH of Tris-buffered solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS medium mixture</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td>E. coli growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic potassium phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0886-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M113-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine isothiocyanate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP221-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (protease-free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear flat bottom 96-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0812-100EA</td>
			<td>any clear 96-well plate will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan M1000 Infinite plate reader</td>
			<td>Tecan, Inc.</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silica membrane spin columns</td>
			<td>Epoch Life Science</td>
			<td>1910-050/250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9580154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A637-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antimony potassium tartrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1088922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 N sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium heptamolybdate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1376630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC401471000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying for inorganic polyphosphate in bacteria

Polifosfato inorgánico (pólipo) es un polímero biológico encontrado en las células de todos los dominios de la vida y es necesaria para la virulencia y la respuesta de estrés en muchas bacterias. Hay una gran variedad de métodos para la cuantificación polyP en materiales biológicos, muchos de los cuales son mano de obra intensiva o insensible, limitando su utilidad. Aquí presentamos un método optimizado para la cuantificación de pólipo en bacterias, usando una extracción de columna de membrana de silicona optimizada para el procesamiento rápido de múltiples muestras, digestión de pólipo con el específico de pólipo exopolyphosphatase ScPPX y detección de la fosfato libre resultante con un sensible análisis colorimétrico basado en ácido ascórbico. Este procedimiento es sencillo, barato y permite la cuantificación confiable de pólipo en diversas especies bacterianas. Se presenta la cuantificación de pólipo representativo de la bacteria gram-negativa (Escherichia coli), la bacteria del ácido láctico Gram-positivas (Lactobacillus reuteri) y las especies de micobacterias (Mycobacterium smegmatis). También incluimos un protocolo simple para la purificación de la afinidad del níquel de cantidades de mg de ScPPX, que no está actualmente disponible en el mercado.

Los pasos del Protocolo se muestra un diagrama en forma simplificada en la figura 1.
Para demostrar el uso de este protocolo con bacterias Gram-negativas, tipo salvaje de e. coli MG165539 fue crecido en fase logarítmica media en rico medio LB a 37 ° C con agitación (200 rpm), luego enjuagar e incubado por un adicional 2 h en morpholinopropanesulfonate-buffered (MO...

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Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

Describimos un método simple para la rápida cuantificación de polifosfato inorgánico en diversas bacterias, incluyendo especies gramnegativas, grampositivas y micobacterias.

Ensayando para el polifosfato inorgánico en bacterias

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

El polifosfato inorgánico es un elemento clave en la respuesta al estrés bacteriano. Pero los métodos más antiguos para extraer y medir el pólipo en bacterias son complejos e intensivos en mano de obra. La principal ventaja de esta técnica es que permite una cuantificación rápida, sensible y económica de los niveles de pólipo en una variedad de diferentes especies bacterianas.El procedimiento será demostrado por Arya Pokhrel, una estudiante de pregrado de mi laboratorio. Para empezar, crecer lactobacillus reuteri bacterias en el medio de inducción de enzimas málicas sin cistina a 37 grados celsius durante la noche sin agitar. Centrifugar un mililitro de este cultivo nocturno en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cosechar suficientes células para producir un total de 50 a 100 microgramos de proteína celular.Retire el sobrenadante del pellet celular por completo, y luego agregue 250 microlitros de ni búfer de lísis GITC y resuspend por vórtice. Incubar a 95 grados centígrados durante 10 minutos para anlicer las células. Almacene ellysate a 80 grados centígrados.En primer lugar, prepare los estándares de BSA que contengan cero, 1, 2 y 4 miligramos por mililitro de BSA en el búfer de lelisis GITC. Aliquot cinco microlitros de licadadas de células bien mezcladas y cinco microlitros de estándares BSA para separar pozos en una placa clara de 96 pozos. Agregue 195 microlitros de reactivo Bradford a cada pozo y mida la absorbancia a 595 nanómetros en un lector de placas.Calcular la cantidad de proteína en cada pozo en comparación con la curva estándar de BSA como se describe en el manuscrito. Para determinar la cantidad total de proteína en cada muestra, multiplique el valor resultante por 05. Para iniciar la extracción de polifosfato, agregue 250 microlitros de 95% de etanol a cada muestra de lesed GITC, y vórtice para mezclar.Pipetear esta mezcla a una columna de espín de membrana de sílice colocada en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Centrifugar a 16, 100 g durante 30 segundos. Deseche el flujo y agregue 750 microlitros de la mezcla de trishidloruro, cloruro de sodio, EDTA y etanol.Centrifugar a 16, 100 gs durante 30 segundos. Deseche el flujo a través y centrifugar la columna de giro a 16, 100 gs durante dos minutos. Coloque la columna en un tubo de microfugo limpio de 1,5 mililitros.Añadir 150 microlitros de 50 mililitros de pH ocho trishidloruro, e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Elute polyP por centrifugar a 8.000 g durante dos minutos. Comience por preparar normas que contengan cero, cinco, 50 o 200 fosfato de potasio micromolar en 50 pH mililalos ocho trishidloruro.Aliquot 100 microlitros de cada estándar de fosfato y 100 microlitros de muestras de poliP extraídos en pozos separados de una placa de 96 pozos transparente. Preparar una mezcla maestra que contenga, por muestra, 30 microlitros de tampón de reacción 5X ScPPX, 19 microlitros de agua y un microlitro de ScPPX purificado.E incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados. El día de la detección, prepare un nuevo stock de trabajo de solución de detección mezclando a 9,12 mililitros de base de solución de detección con 88 mililitros de un ácido ascórbico molar, y permita que llegue a temperatura ambiente antes de su uso. Agregue 50 microlitros de solución de detección a cada muestra y estándares en la placa de 96 pozos.Para permitir el desarrollo del color, incubar la placa a temperatura ambiente durante aproximadamente dos minutos. Utilice un lector de placas para medir la absorbancia a 882 nanómetros y calcular la concentración de fosfato de cada muestra en comparación con la curva estándar de fosfato de potasio. A continuación, convierta las concentraciones de fosfato en nanomoles de fosfato derivado de poliP en cada litorilla celular y normalice el contenido de pólipo celular en proteína celular total, como se describe en el manuscrito.E.coli de tipo salvaje, una bacteria gramnegativa, cultivada en LB no produjo pólipos. Pero cuando se cultiva en MOPS, produjo alrededor de 192 nanomoles poliP por miligramo de proteína total. Un mutante de E.coli delta ppk, que carece de polip quinasa, no produjo ningún pólipo en ninguno de los medios.Un mutante de ppx delta, que carece de exopolifosfatasa, produjo aproximadamente la misma cantidad de pólipo que el tipo salvaje. Y el mutante delta phoB, que es defectuoso en el transporte de fosfato, produjo significativamente menos pólipo que el tipo salvaje. L.reuteri de tipo salvaje, una bacteria grampositiva cultivada durante la noche en medio MEIC acumulada alrededor de 51 nanomoles poliP por miligramo de proteína total.Un mutante nulo L.reuteri ppk1 que carecía de quinasa polip contenía menos de la mitad de esta cantidad. Esta presencia de pólipo en el mutante nulo ppk1 se debe probablemente a L.reuteri que contiene una segunda polip quinasa. Mycobacterium smegmatis cepa SMR cinco, cultivada en el medio Hartmans-de Bont en ausencia de etanol acumulado alrededor de 141 nanomoles poliP por miligramo de proteína total.Mientras que el tratamiento con etanol dio lugar a un aumento triple. Después de este procedimiento, se puede realizar electroforesis de gel de acrilamida para evaluar las diferencias en la longitud de la cadena poliP. Al intentar este procedimiento, evite errores comunes.Recuerde evitar que las burbujas en los pozos de placas de microtíteres, y tenga cuidado de transferir sus muestras al tubo apropiado al cambiar de la columna al tubo de microfugo. No olvide que trabajar con GITC y ácidos fuertes puede ser peligroso, y siempre se debe usar el equipo de protección adecuado durante la realización de este procedimiento.

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