Name: probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

الكاتب الاشتراكات: سنوات العمر المفقودة و MSD تصميم المشروع؛ نوكليوسوميس MSD تجميعها. MSD وزينب صالح إجراء تحليلات فؤاد التجارب والبيانات. وكتب جميع المؤلفين وتحرير المخطوطة.

1. الجمعية تمييع المستمر من nucleosomes مونو
<ol><li>توليد وتنقية bp حوالي 400 الركازة الحمض النووي الذي يحتوي على نوكليوسومي 601 اضعيه قبالة محورها التسلسل لتحديد المواقع. 55 ملاحظة: للحد من تشكيل دي-نوكليوسوميس غير المرغوب فيها، كل 'الذراع' المرافقة تسلسل المواقع لا ينبغي أن تتجاوز ~ 150 ?...

مباشرة بدلاً من ذلك البروتوكول، المذكورة أعلاه وتقديم النتائج استنساخه بدرجة عالية، على الرغم من أن يمكن التركيز على عدد قليل من القضايا الهامة. وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا فونكتيوناليزيد ركيزة رئيسية للحصول على نتائج موثوقة واستنساخه. استقرار عالية لوكالة الأنباء الجزائرية-ميكا هي و?...

في الخلايا حقيقية النواة، والحمض النووي مكثف للغاية ومنظم في الكروموسومات. 1 هو المستوى الأول للمنظمة الحمض النووي داخل كروموسوم جمعية نوكليوسوميس في أي 147 شركة بريتيش بتروليوم للحمض النووي هو محكم ملفوفة حول نواة أوكتامير هيستون. 2 , 3 تجميع جزيئات نوكليوسومي في جزيء الحمض النووي طويلة تشكيل مجموعة الكروماتين ثم تنظيمها حتى يتم تشكيل وحدة كروموسوم ضغط عالية. 4 تفكيك الكروماتين وصولاً إلى مجاناً الحمض النووي تتطلبها العمليات الخلوية الحرجة مثل النسخ المتماثل النسخ والجينوم الجينات، مما يوحي بأن الكروماتين نظام شديد حيوية. 5 , 6 , 7 فهم الخصائص الدينامية للحمض النووي الكروماتين على مختلف المستويات من الأهمية بمكان لتوضيح العمليات الوراثية على المستوى الجزيئي حيث الأخطاء يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا أو تطور الأمراض مثل السرطان. 8 خاصية الكروماتين أهمية كبيرة هي ديناميات نوكليوسوميس. 9 , 10 , 11 , 12 الثبات العالي لهذه الجسيمات أتاح لتوصيف الهيكلية بتقنيات بلورية. 2 ما هي الافتقار إلى دراسات هذه هي تفاصيل ديناميكية nucleosomes مثل إليه الحمض النووي إزالة التغليف من صميم هيستون؛ المسار الحيوي الذي مطلوب لعمليات النسخ والنسخ المتماثل. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 وعلاوة على ذلك، خاصة البروتينات ووصف العوامل يعيد أظهرت تيسيرا لتفكيك17من الجسيمات نوكليوسومال؛ غير الجوهرية ديناميات nucleosomes عاملاً حاسما في هذه العملية التي من شأنها أن تساهم في عملية التفكيك الكامل. 14 , 16 , 18 , 19
تقنيات جزيء واحد مثل الأسفار جزيء واحد19،،من2021والبصرية الملائمة (الملقط)13،،من1822،23 وفؤاد 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 كان لها دور أساسي في فهم ديناميات نوكليوسوميس. من بين هذه الأساليب، وفؤاد يستفيد من العديد من ميزات فريدة وجذابة. فؤاد يسمح أحد لتصور وتميز nucleosomes الفردية فضلا عن صفائف أطول27. من صور فؤاد، الخصائص الهامة لهيكل nucleosome مثل طول الحمض النووي ملفوفة حول نواة هيستون يمكن أن يقاس 10،14،،من2628؛ معلمة أساسي لوصف ديناميات إزالة التغليف نوكليوسومي. وأظهرت الدراسات الماضي فؤاد نوكليوسوميس أن تكون نظم ديناميكية للغاية، وأن الحمض النووي يمكن بسط عفويا من هستون الأساسية14. إزالة التغليف عفوية من الحمض النووي من nucleosomes كان تصور مباشرة من فؤاد التشغيل في وضع الوقت الفاصل بين عندما يتم التصوير في المحاليل 14،،من2629.
ظهور الأجهزة فؤاد (HS-فؤاد) الوقت الفاصل بين عالية السرعة جعلت من الممكن تصور عملية إزالة التغليف nucleosome في15،،مقياس الوقت 14مللي ثانية24. وكشفت الدراسات30 16،HS-فؤاد مؤخرا من nucleosomes السنترومير محددة عن العديد من الميزات الجديدة من nucleosomes مقارنة مع نوع متعارف عليه. وتشكل nucleosomes السنترومير من السنترومير، جزء صغير من الكروموسوم ذات أهمية حاسمة كروموسوم الفصل31. على عكس المتعارف عليه نوكليوسوميس في معظم الكروماتين، يتضمن جوهر nucleosomes السنترومير هيستون هيستون سينب-أ بدلاً من هستون H332،33. ونتيجة لهذا الاستبدال هستون، هو التفاف الدنا في nucleosomes السنترومير ~ 120 بي بي بدلاً من ~ 147 bp ل nucleosomes المتعارف عليه؛ فرق يمكن أن تؤدي إلى مورفولوجيس متميزة من السنترومير و nucleosomes الكنسي صفائف34، مما يوحي بأن الكروماتين السنترومير يخضع ديناميات أعلى بالمقارنة مع معظم أحد. ديناميات الرواية المعروضة بواسطة nucleosomes السنترومير في الدراسات30 16،HS-فؤاد مثالاً فرصة فريدة تقدمها هذه التقنية جزيء واحد لتصور الخصائص الهيكلية والديناميكية لمباشرة نوكليوسوميس. ستناقش أمثلة من هذه الميزات بإيجاز ويتضح في نهاية الورقة. هذا التقدم بسبب وضع بروتوكولات جديدة لتصوير فؤاد من nucleosomes، فضلا عن التعديلات المدخلة على الأساليب القائمة. وهدف البروتوكول هو موضح هنا هو جعل هذه التطورات المثيرة في جزيء واحد فؤاد nucleosome الدراسات متاحة لأي شخص الذين يرغبون في الاستفادة من هذه التقنيات في تحقيقاتهم الكروماتين. العديد من التقنيات الموضحة قابلة للتطبيق لمشاكل ما بعد دراسة نوكليوسوميس، ويمكن استخدامها لإجراء تحقيقات أخرى البروتين ونظم الحمض النووي للفائدة. ويمكن الاطلاع على أمثلة لمثل هذه التطبيقات في المنشورات35،36،37،،من3839،،من4041، 42،43،44،45،،من4647،،من4849 وآفاق الدراسات فؤاد يتم إعطاء النظم الجزيئية البيولوجية المختلفة في استعراضات29،،من5051،،من5354.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1229px;" width="1229">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmid pGEM3Z-601</td>
			<td style="width:327px;">Addgene, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:119px;">26656</td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR Primers</td>
			<td style="width:327px;">IDT, Coralville, IA</td>
			<td style="width:119px;">Custom Order</td>
			<td>(FP) 5&#39;- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3&#39; (RP) 5&#39;-ACAGCTATGACCATGATTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DreamTaq polymerase</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">EP0701</td>
			<td>Catalog number for 200 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:327px;">Qiagen, Hilden, Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td>Catalog number for 50 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tris base</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td>Catalog number for 250 g</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">EDTA</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15576028</td>
			<td>Catalog number for 500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">(CENP-A/H4)2, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0010</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H2A/H2B, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">15-0311</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H3 Octamer, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0001</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">69574</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">S9888-500G</td>
			<td>Catalog number for 500 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Amicon Ultra-0.5&#160;mL Centrifugal Filters&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Millipore-sigma, Burlington, MO</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td>Catalog number for 8 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HCl</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>258148-25ML</td>
			<td>Catalog number for 25 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tricine</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T0377-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">SDS</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">11667289001</td>
			<td>Catalog number for 1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ammonium Persulfate (AmmPS)&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610700</td>
			<td>Catalog number for 10 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td>Catalog number for 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TEMED</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610800</td>
			<td>Catalog number for 5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610747</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">2-ME</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M6250-10ML</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">ageRuler Prestained Protein Ladder&#160;</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td>Catalog number for 500 uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bio-Safe&#8482; Coomassie Stain</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610786</td>
			<td>Catalog number for 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth&#160;</td>
			<td style="width:327px;">TexWipe, Kernersvile, NC</td>
			<td style="width:119px;">TX604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Muscovite Block Mica</td>
			<td style="width:327px;">AshevilleMica, Newport News, VA</td>
			<td style="width:119px;">Grade-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aminopropyl silatrane (APS)</td>
			<td style="width:327px;">Synthesized as described in 22</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HEPES</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">H4034-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scotch Tape</td>
			<td style="width:327px;">Scotch-3M, St. Paul, MN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TESPA-V2 afm probe (for static imaging)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aron Alpha Industrial Krazy Glue</td>
			<td style="width:327px;">Toagosei America, West Jefferson, OH</td>
			<td style="width:119px;">AA480</td>
			<td>Catalog number for 2 g tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MgCl2</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M8266-100G</td>
			<td>Catalog number for 100 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Millex-GP Filter, 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">SLGP05010</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)</td>
			<td style="width:327px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FG-3020C-20&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FS-1010S135-0.5&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MultiMode Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy</td>
			<td style="width:327px;">Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging

الكروماتين، وسلسلة طويلة من مفارز nucleosome، هو نظام ديناميكي الذي يسمح لمثل هذه العمليات الحرجة كتكرار الحمض النووي، والنسخ أخذ مكان في الخلايا حقيقية النواة. ديناميات nucleosomes يوفر الوصول إلى الحمض النووي بالأجهزة النسخ المتماثل، والنسخ، والأهمية يسهم في الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظائف الكروماتين. دراسات جزيء واحد مثل مجهر القوة الذرية (AFM) التصوير ساهمت إلى حد كبير فهمنا الحالي لدور هيكل نوكليوسومي والديناميات. البروتوكول الحالي يصف الخطوات التي تمكن تقنيات التصوير فؤاد عالي الاستبانة لدراسة الخصائص الهيكلية وديناميكية من nucleosomes. ويتجلى في البروتوكول فؤاد البيانات التي تم الحصول عليها ل nucleosomes السنترومير الذي يتم استبداله هيستون H3 نظيره السنترومير البروتين (سينب-أ). يبدأ البروتوكول مع جمعية مونو-نوكليوسوميس باستخدام أسلوب تمييع مستمر. إعداد الركيزة ميكا فونكتيوناليزيد مع سيلاتراني أمينوبروبيل (وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا) الذي يتم استخدامه للتصوير نوكليوسومي أمر حاسم للتصور فؤاد من نوكليوسوميس الموصوفة ويرد الإجراء الذي يعد الركيزة. يتم تصويرها nucleosomes المودعة على سطح APS-ميكا أولاً استخدام فؤاد ثابت، الذي يلتقط لقطة للسكان نوكليوسومي. من تحليل هذه الصور، يمكن أن تقاس هذه المعلمات كحجم الحمض النووي الملتفة حول نوكليوسوميس وهو أيضا تفاصيل هذه العملية. يتم وصف فؤاد الوقت الفاصل بين التصوير الداخلي في السائل لفؤاد الوقت الفاصل بين السرعة التي يمكن التقاط عدة إطارات لديناميات نوكليوسومي في الثانية الواحدة. وأخيراً، تحليل ديناميات nucleosome تمكن الوصف الكمي للعمليات الدينامية الموصوفة والمصور.

تعد نوكليوسوميس مونو أولاً لفؤاد التصوير تجارب باستخدام أسلوب الجمعية تمييع مستمر (الشكل 1). تم فحص nucleosomes استعداد ثم استخدام متقطع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الشكل 2). وكان فونكتيوناليزيد على سطح ميكا التالية استخدام وكالة الأنباء الجزائرية، الذي يلتقط ...

Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

نقدم هنا، بروتوكولا لوصف الجسيمات نوكليوسومي على مستوى جزيء مفرد باستخدام مجهر القوة الذرية ثابتة والوقت الفاصل بين (فؤاد) تقنيات التصوير. يسمح أسلوب الروغان السطحية ووصف للقبض على بنية وديناميات nucleosomes في الاستبانة في النانو.

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

يستخدم هذا البروتوكول جميع الميزات الرئيسية لـ AFM ، غير قابل لتقنيات جزيء واحد أخرى. ونتيجة لذلك، نحن قادرون على حل هيكل النوكلوزومات على نطاق نانو. الأهم من ذلك، تم التصور المباشر للنيوكليوسومات في الظروف الفسيولوجية.باستخدام تقنية AFM لدينا، كشفنا مؤخرًا عن خصائص فريدة من نوعها لنوية السنترومير التي يمكن أن تلعب دورًا في وظيفة سنتيرومير بأكملها. يتم تطبيق الطريقة التي سيتم عرضها حاليًا في مختبرنا للتحقيق في التجميع الذاتي للبروتينات المرتبطة بتشكيل مجاميع الأميلويد. هذه المجاميع البروتين تؤدي إلى تطوير الأمراض المدمرة مثل مرض الزهايمر وباركنسون على سبيل المثال لا الحصر.كما تنطبق طرق الإعداد البسيطة على مجمعات أخرى من البروتين والحمض النووي، بما في ذلك النظم الكبيرة مثل آلات تكرار الحمض النووي. على الرغم من أن هناك حاجة إلى بعض التعديلات. من أجل توصيف جزيئات النوكليوس في مستوى جزيء واحد باستخدام المجهر القوة الذرية ثابتة وفاصل زمني، تبدأ من خلال تنقية وتجميع والتحقق من صحة النوى كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق.المقبل، وإعداد سطح الميكا للتصوير AFM ثابت. للقيام بذلك، أولاً إعداد محلول مخزون APS 50 ملليمولار في المياه الأيونية. تخزين aliquots ملليلتر واحد من هذا الحل في أربع درجات مئوية، حتى أن تكون هناك حاجة.من حل الأسهم، وإعداد حل APS العمل لتعديل الميكا عن طريق حل 50 ميكرولترات من مخزون 50 اPS micromolar في 15 ملليلتر من المياه المقطرة الأيونية. اخلط الحل ثم املأ cuvette بالمحل. المقبل، وقطع واحد في ثلاثة شرائط سنتيمتر من الميكا من أوراق الميكا عالية الجودة.تحقق من أن قطعة تناسبها عندما وضعت قطريا في cuvette. ثم، طبقات مشقوق من الميكا حتى يتم شق الجانبين حديثا، وقطعة رقيقة كما 0.1 ملليمتر. وضع على الفور قطعة الميكا في CUVette مملوءة APS واحتضان الميكا لمدة 30 دقيقة.نقل قطعة الميكا إلى cuvette مليئة بالمياه المقطرة deionized ونقعه لمدة 30 ثانية. ثم، استخدام الأرجون لتجف تماما كلا الجانبين من قطاع الميكا APS. تطبيق مزدوج وجه شريط لاصق على عدة الصولجانات المغناطيسية ووضعها على الجانب.ثم، وقطع الركيزة الميكا APS إلى سنتيمتر واحد في المربعات سنتيمتر واحد، وتغطيتها في طبق بيتري نظيفة. المقبل, إعداد ثلاثة تخفيفات من النيوكلوزومات المجمعة باستخدام 0.22 ميكرون تصفية العازلة التي تحتوي على 10 ملليمتر hepes وأربعة كلوريد المغنيسيوم ميليمولار في PH من 7.5. للحد من فقدان النيوكلوزومات، في التركيز النهائي المنخفض، وينبغي أن يتم تخفيف واحد في وقت واحد، مباشرة قبل ترسب على الميكا APS.إيداع خمسة إلى 10 ميكرولترات من كل عينة من النيوكليوس في وسط قطعة الميكا APS والسماح لهم احتضان لمدة دقيقتين. ثم شطف بلطف العينة مع 2-3 ملليلتر من الماء المقطر deionized لإزالة مكونات العازلة. وجفف العينة المودعة تحت تدفق الضوء من الأرجون.للبدء، قم بتركيب طرف على حامل تلميح إعداد AFM. ثم، قم بتركيب العينة الأولى على مرحلة AFM، مع الحرص على عدم الاتصال بسطح العينة. ضع الليزر فوق الـ cantilever حتى يصبح مجموعه في الحد الأقصى وضبط قيم الانحراف الرأسي والاتني إلى ما يقرب من الصفر.ثم، ضبط مسبار AFM للعثور على تردده الرنان، وضبط سعة محرك الأقراص، وتعيين حجم الصورة إلى 100 في 100 نانومتر. بمجرد الإعداد، انقر على زر المشاركة لبدء النهج. عندما يكون النهج كاملا، تدريجيا تحسين نقطة مجموعة السعة حتى ينظر بوضوح سطح العينة.ثم، زيادة حجم المسح الضوئي إلى ميكرون واحد من ميكرون واحد والقرار إلى 512 من قبل 512 بكسل. وأخيراً، انقر فوق زر الالتقاط لبدء الحصول على الصورة. استخدام الزجاج قضيب الماسح الضوئي الغراء لإرفاق قضيب الزجاج لمرحلة الماسح الضوئي AFM.السماح لهذا أن يجف لمدة 10 دقائق على الأقل. في غضون ذلك، جعل 0.1 ملليمتر قطعة دائرية سميكة من الميكا مع 1.5 ملليمتر القطر عن طريق اللكم لهم من ورقة أكبر الميكا. استخدام عالية السرعة AFM مايكا الزجاج قضيب الغراء لإرفاق هذه القطعة الميكا إلى قضيب الزجاج على AFM عالية السرعة، والسماح لها بالبقاء بمنأى عن الحد الأدنى من 10 دقائق في حين يجف.ثم، طبقات مشقوق من الميكا باستخدام شريط حساس للضغط حتى ينظر إلى طبقة مشقوق جيدا على الشريط. المقبل، وتمييع واحد microliter من 50 ملليمولار APS المخزون في 99 ميكرولترات من المياه المقطرة deionized لجعل حل 500 ميكرومولار APS. إيداع 2.5 ميكرولترات من الحل على سطح الميكا مشقوق حديثا والسماح للسطح وظيفية لمدة 30 دقيقة.بعد الحضانة ، شطف الميكا عدة مرات مع المياه المقطرة deionized عن طريق تطبيق ثلاثة microliters يشطف. إزالة الماء تماما بعد كل شطف عن طريق وضع مسح غير المنسوجة على حافة الميكا. بعد الشطف النهائي ، ضع ثلاثة ميكرولترات من الماء المقطر على السطح ، واتركه يجلس لمدة لا تقل عن خمس دقائق لإزالة أي وكالة الأنباء الجزائرية غير المقيدة على وجه التحديد.المقبل، وضع التحقيق في حامل AFM عالية السرعة، ووضع حامل على مرحلة AFM مع طرف تواجه ما يصل. شطف حامل باستخدام 100 ميكرولترات من المياه المقطرة deionized، تليها اثنين من 100 ميكرولتر شطف من 0.22 ميكرون تصفية النيوكلوزوم العازلة التصوير. مع الشطف القيام به، وملء الغرفة مع 100 ميكرولترات من عازلة التصوير النووي، وغمر الطرف.ضبط موقف cantilever حتى يتم ضرب مع الليزر. ثم، شطف الميكا APS خمس مرات مع تصفية عازلة التصوير النوى، وذلك باستخدام أربعة ميكرولترات لكل شطف. تخفيف ميكرولتر واحد من مخزون تجميع النيوكلوزومات في 250 ميكرولترات من مخزون التصوير النوويات المصفاة لتركيز نويوزوم نهائي من نانومولار واحد.إيداع 2.5 ميكرولترات من هذا التخفيف على السطح والسماح لها الجلوس لمدة دقيقتين. شطف السطح مرتين مع أربعة ميكرولترات من عازلة التصوير النووي لتجنب أكثر من الازدحام. بعد الشطف النهائي، وترك السطح مغطاة في العازلة التصوير.قم بتعيين الماسح الضوئي وعينة فوق حامل التلميح بحيث تكون العينة مُواجهة لأسفل. لبدء النهج، استخدم وظيفة النهج التلقائي مع اتساع نقطة مجموعة قريبة من السعة التذبذب الحرة. ضبط نقطة مجموعة حتى يتم تعقب جيدا السطح.ثم، تعيين منطقة الصورة حوالي 150 في 150 نانومتر إلى 200 في 200 نانومتر مع معدل الحصول على البيانات من حوالي 300 مللي ثانية لكل إطار التصوير. كتحكم للتجميع والترسب، تم إعداد أحادية النواة H3 وصور باستخدام AFM ثابت. تقدم هذه الصورة لمحة عن عدد النيوكليوسات كما كانت موجودة قبل لحظات من الترسب تؤكد أن النويلوسومات تم تجميعها بنجاح.مع الجمعية التحكم H3 نجاح, وقدم أساليب تم تطبيقها بعد ذلك لدراسة CENP-A نوىوزومات. كشفت التصوير AFM ثابت من هذه العينة تجميعها كان ناجحا. من الصور AFM ثابتة، يمكن أن يتميز ارتفاع وعدد بدوره من أحادية النواة.يتم استخدام كل من زاوية بين الأسلحة الحمض النووي الحرة وطول الأسلحة الحمض النووي الحرة لتحديد عدد من يتحول الحمض النووي في النوى الفردية. في المقابل، يمكن استخدام تصوير AFM الفاصل الزمني للنيات لتصور السلوك غير المفكك التلقائي العام للنيوكلوزومات. كما انخفض عدد بدوره من النوى، ويلاحظ أيضا انخفاض المقابلة في حجم نواة النياتيوس.بالإضافة إلى التصوير الزمني المنتظم، يمكن استخدام هفوة الوقت عالية السرعة AFM للتحقيق في ديناميات النويات الأكثر تعقيدًا التي يتم تفويتها باستخدام التصوير القياسي للفاصل الزمني. كانت قدرة هذه التقنية على التقاط الديناميات على مدى فترة طويلة من الزمن ضرورية لتصور نقل مسافة طويلة من نواة CENP-A النوى، والتي تم التقاطها على مدى 1200 إطار. وكان هذا الأسلوب أيضا حاسما في التقاط النقل النادر لب CENP-A نوات من ركيزة الحمض النووي واحد إلى آخر.جعل معدل التقاط الصور السريع مرئيًا لهذا الحدث الديناميكي ممكنًا لأنه استغرق عدة إطارات فقط لإكماله. في حقل الكروماتين واسعة هناك مجموعة من الأسئلة الهامة المتعلقة بأدوار liger histones والتكبير هيستون من ديناميات الكروماتين. كل هذه الأسئلة يمكن الإجابة عليها باستخدام أسلوبنا.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biochemistry

Unit 1

Diagnostic Imaging Techniques

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

التحقيق البروتين تسلسل-هيكل-ديناميات العلاقات مع Bio3D على شبكة الإنترنت

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

بنية حل أزرق نيون البروتين باستخدام ميشاندكوليكت

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

تصوير الحويصلات خارج الخلية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

تصور ديناميات الانتشار من نانورود الذهب على غشاء الخلية باستخدام جسيمات نانوية واحدة Darkfield المجهرية

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...