Name: probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Forfatter bidrag: YLL og MSD designet projekt; MSD samlet nucleosomes. MSD og ZS udført AFM eksperimenter og data analyser. Alle forfattere skrev og redigeres håndskriftet.

1. løbende fortynding forsamling af Mono-nucleosomes
<ol><li>Generere og rense en ca 400 bp DNA substrat, der indeholder en off-centreret Widom 601 nucleosome positionering sekvens. 55 Bemærk: For at begrænse uønskede dannelsen af di-nucleosomes, hver 'arm' flankerende positionering rækkefølgen bør ikke overstige ~ 150 bp.<ol>
<li>Bruge plasmidet pGEM3Z-601 sammen med de designede primere og forstærke substrat DNA ved hjælp af PCR. 423 bp bærematerialet med 122 og 154 bp arm længde...

Den protokol, der er beskrevet ovenfor er temmelig ligetil og give meget reproducerbare resultater, selv om et par vigtige spørgsmål kan fremhæves. Functionalized APS-glimmer er en nøglen substrat for at få pålidelige og reproducerbare resultater. En høj stabilitet af APS-glimmer er en af de vigtige elementer i dette substrat, der gør det muligt at forberede den billeddiagnostiske substrat i forvejen for brug, der kan bruges i mindst to uger efter at være forberedt. 59 , <sup c...

I eukaryote celler er DNA meget komprimeret og organiseret i kromosomer. 1 det første niveau af DNA organisation inden for et kromosom er forsamlingen af nucleosomes i hvilke 147 bp DNA er tæt pakket omkring en Histon octamer kerne. 2 , 3 nucleosome partikler samle på et langt DNA molekyle danner en kromatin array, som er så organiseret indtil en meget kompakt kromosom enhed er dannet. 4 demonteringen af kromatin giver adgang til gratis DNA, der kræves af kritiske cellulære processer såsom gen transskription og genom replikering, tyder på, at kromatin er et meget dynamisk system. 5 , 6 , 7 forståelse de dynamiske egenskaber af DNA på forskellige kromatin niveauer er kritisk vigtigt belyse genetiske processer på det molekylære niveau, hvor fejl kan føre til celledød eller udvikling af sygdomme såsom kræft. 8 en kromatin egenskab af stor betydning er dynamikken i nucleosomes. 9 , 10 , 11 , 12 den høje stabilitet af disse partikler har tilladt for en strukturel karakterisering af krystallografiske teknikker. 2 hvad disse undersøgelser mangler er de dynamiske detaljer af nucleosomes såsom mekanismen for DNA udpakning af Histon kerne; den dynamiske pathway der er påkrævet ved processer, transskription og replikering. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 endvidere særlige proteiner kaldes remodeling faktorer har vist sig at lette demonteringen af nucleosomal partikler17; nucleosomes iboende dynamik er imidlertid den afgørende faktor i denne proces, der bidrager til hele demontering proces. 14 , 16 , 18 , 19
Enkelt-molekyle teknikker som enkelt-molekyle fluorescens19,20,21, optisk diffusering (pincet)13,18,22,23 og AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 har været medvirkende til at forstå dynamikken i nucleosomes. Blandt disse metoder, AFM fordele fra flere unikke og attraktive funktioner. AFM gør det muligt at visualisere og karakterisere individuelle nucleosomes samt den længere arrays27. Fra AFM billeder, kan vigtige egenskaber af nucleosome struktur som længden af DNA svøbt omkring Histon kernen være målt 10,14,26,28; en parameter, der er centrale for karakterisering af nucleosome udpakning dynamics. Forbi AFM har undersøgelser afsløret nucleosomes at være stærkt dynamiske systemer og at DNA spontant kan udpakke fra Histon core14. Den spontane udpakning af DNA fra nucleosomes var direkte visualiseret af AFM opererer i tilstanden time-lapse når billeddannelse sker i vandige opløsninger 14,26,29.
Fremkomsten af højhastighedstog time-lapse AFM (HS-AFM) instrumenteringen gjort det muligt at visualisere nucleosome udpakning proces på millisekund tidsskala 14,15,24. Seneste HS-AFM 16,30 undersøgelser af centromer specifikke nucleosomes afslørede flere nye funktioner i nucleosomes sammenlignet med den kanoniske form. Centromer nucleosomes udgør af en centromer, en lille del af den kritisk vigtige til kromosom segregation31kromosom. I modsætning til kanoniske nucleosomes i bulk kromatin indeholder Histon kernen af centromer nucleosomes CENP-A Histon i stedet for Histon H332,33. Som følge af denne Histon substitution, DNA indpakning i centromer nucleosomes er ~ 120 bp i stedet for ~ 147 bp for kanoniske nucleosomes; en forskel, der kan føre til forskellige morfologier centromer og kanoniske nucleosomes arrays34, tyder på, at centromer kromatin gennemgår højere dynamics sammenlignet med størstedelen en. Den nye dynamik vises af centromer nucleosomes i HS-AFM16,30 undersøgelser eksemplificere den enestående lejlighed leveres af denne enkelt-molekyle teknik til direkte visualisere de strukturelle og dynamiske egenskaber af nucleosomes. Eksempler på disse funktioner vil være kort drøftet og illustreret i slutningen af papiret. Dette fremskridt blev gjort på grund af udviklingen af nye protokoller til AFM billeddannelse af nucleosomes samt ændringer af eksisterende metoder. Målet med protokollen beskrevet her er at gøre disse spændende fremskridt i enkelt-molekyle AFM nucleosome undersøgelser tilgængelige for enhver, der ønsker at udnytte disse teknikker i deres kromatin undersøgelser. Mange af de teknikker beskrevet gælder for problemer ud over undersøgelsen af nucleosomes og kan bruges til undersøgelser af andre proteiner og DNA systemer af interesse. Et par eksempler på sådanne programmer kan findes i publikationer35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 og udsigterne til AFM undersøgelser af forskellige Biomolekylær systemer gives i anmeldelser29,50,51,53,54.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1229px;" width="1229">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmid pGEM3Z-601</td>
			<td style="width:327px;">Addgene, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:119px;">26656</td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR Primers</td>
			<td style="width:327px;">IDT, Coralville, IA</td>
			<td style="width:119px;">Custom Order</td>
			<td>(FP) 5&#39;- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3&#39; (RP) 5&#39;-ACAGCTATGACCATGATTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DreamTaq polymerase</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">EP0701</td>
			<td>Catalog number for 200 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:327px;">Qiagen, Hilden, Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td>Catalog number for 50 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tris base</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td>Catalog number for 250 g</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">EDTA</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15576028</td>
			<td>Catalog number for 500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">(CENP-A/H4)2, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0010</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H2A/H2B, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">15-0311</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H3 Octamer, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0001</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">69574</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">S9888-500G</td>
			<td>Catalog number for 500 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Amicon Ultra-0.5&#160;mL Centrifugal Filters&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Millipore-sigma, Burlington, MO</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td>Catalog number for 8 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HCl</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>258148-25ML</td>
			<td>Catalog number for 25 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tricine</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T0377-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">SDS</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">11667289001</td>
			<td>Catalog number for 1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ammonium Persulfate (AmmPS)&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610700</td>
			<td>Catalog number for 10 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td>Catalog number for 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TEMED</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610800</td>
			<td>Catalog number for 5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610747</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">2-ME</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M6250-10ML</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">ageRuler Prestained Protein Ladder&#160;</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td>Catalog number for 500 uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bio-Safe&#8482; Coomassie Stain</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610786</td>
			<td>Catalog number for 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth&#160;</td>
			<td style="width:327px;">TexWipe, Kernersvile, NC</td>
			<td style="width:119px;">TX604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Muscovite Block Mica</td>
			<td style="width:327px;">AshevilleMica, Newport News, VA</td>
			<td style="width:119px;">Grade-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aminopropyl silatrane (APS)</td>
			<td style="width:327px;">Synthesized as described in 22</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HEPES</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">H4034-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scotch Tape</td>
			<td style="width:327px;">Scotch-3M, St. Paul, MN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TESPA-V2 afm probe (for static imaging)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aron Alpha Industrial Krazy Glue</td>
			<td style="width:327px;">Toagosei America, West Jefferson, OH</td>
			<td style="width:119px;">AA480</td>
			<td>Catalog number for 2 g tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MgCl2</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M8266-100G</td>
			<td>Catalog number for 100 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Millex-GP Filter, 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">SLGP05010</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)</td>
			<td style="width:327px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FG-3020C-20&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FS-1010S135-0.5&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MultiMode Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy</td>
			<td style="width:327px;">Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging

Kromatin, som er en lang kæde af nucleosome subunits, er et dynamisk system, der giver mulighed for disse kritiske processer som DNA-replikation og transskription til at tage plads i eukaryote celler. Dynamikken i nucleosomes giver adgang til DNA af replikering og transskription machineries og bidrager kritisk til de molekylære mekanismer bag kromatin funktioner. Enkelt-molekyle studier såsom atomic force mikroskopi (AFM) imaging har bidraget væsentligt til vores nuværende forståelse af rollen, nucleosome struktur og dynamik. Den nuværende protokol beskrives den fremgangsmåde, der giver høj opløsning AFM Billeddannende teknikker til at studere de strukturelle og dynamiske egenskaber af nucleosomes. Protokollen er illustreret af AFM data indhentet for centromer nucleosomes hvor H3 Histon er erstattet med sit modstykke centromer protein en (CENP-A). Protokollen starter med samling af mono-nucleosomes ved hjælp af en kontinuerlig fortynding metode. Forberedelse af glimmer substrat functionalized med aminopropyl silatrane (APS-glimmer), der bruges til nucleosome imaging er kritisk for AFM visualisering af nucleosomes beskrevet og fremgangsmaade at forberede substratet. Nucleosomes deponeret på APS-glimmer overflade er først afbildet ved hjælp af statisk AFM, som indfanger et øjebliksbillede af nucleosome befolkningen. Fra analyser af disse billeder, sådanne parametre som størrelsen af DNA snoet omkring nucleosomes kan måles, og denne proces er også detaljeret. Time-lapse AFM imaging procedure i væsken er beskrevet for højhastighedstog time-lapse AFM, der kan indfange flere billeder af nucleosome dynamics pr. sekund. Endelig, analyse af nucleosome dynamics aktivering kvantitative karakterisering af de dynamiske processer er beskrevet og illustreret.

Mono-nucleosomes blev første gang forberedes til AFM imaging eksperimenter ved hjælp af en kontinuerlig fortynding forsamling metode (figur 1). Rede nucleosomes blev derefter kontrolleres ved hjælp af diskontinuert SDS-PAGE (figur 2). En glimmer overflade var næste functionalized ved hjælp af APS, som indfanger nucleosomes på overfladen samtidig bevare en jævn baggrund for høj opløsning imaging (figur 3). Nucleosomes blev d...

Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Vi præsenterer her, en protokol til at karakterisere nucleosome partikler på enkelt-molekyle niveau ved hjælp af statisk og time-lapse atomic force mikroskopi (AFM) imaging teknikker. Den beskrevne overflade functionalization metode giver mulighed for opsamling af strukturen og dynamikken i nucleosomes i høj opløsning på nanoplan.

Sondering struktur og dynamik af Nucleosomes ved hjælp af Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Denne protokol udnytter alle de vigtigste funktioner i AFM, ikke-modtagelige for andre enkelt molekyle teknikker. Som følge heraf er vi i stand til at løse strukturen af nukleosom på nano skala. Vigtigere, direkte visualisering af nukleosomer blev udført på fysiologiske betingelser.Ved hjælp af vores AFM teknik, har vi for nylig afsløret unikke egenskaber centromere nukleosom, der kan spille en rolle på funktionen af hele centromere. Den metode, der skal vises, anvendes i øjeblikket i vores laboratorium til at undersøge selvsamling af proteiner forbundet med dannelse af amyloid aggregater. Disse protein aggregater udløse udviklingen af ødelæggende sygdomme som Alzheimers og Parkinsons for at nævne nogle få.De enkle tilberedningsmetoder gælder også for andre protein-DNA-komplekser, herunder store systemer såsom DNA replikation maskiner. Selv om nogle ændringer er nødvendige. For at karakterisere nukleosom partikler på det enkelte molekyle niveau ved hjælp af statisk og time-lapse atomare kraft mikroskopi, begynde med at rense, samle og validere nukleosomer som beskrevet i den ledsagende tekst protokol.Derefter forberedes glimmeroverfladen til statisk AFM-billeddannelse. For at gøre dette, først forberede en halvtreds millimolar APS lager løsning i deioniseret vand. Opbevar en milliliter aliquots af denne løsning ved fire grader Celsius, indtil det er nødvendigt.Fra lageropløsningen skal der udarbejdes en fungerende APS-løsning til glimmerændring ved at opløse 50 mikroliter af 50 mikromolar APS-lageret i 15 milliliter destilleret deioniseret vand. Bland opløsningen og fyld derefter en kuvette med opløsningen. Dernæst skæres en med tre centimeter strimler af glimmer fra høj kvalitet glimmer plader.Kontroller, at stykket passer, når det placeres diagonalt i en kuvette. Derefter kløve lag af glimmer, indtil begge sider er frisk kløvet, og stykket er så tynd som 0,1 millimeter. Straks placere glimmer stykke i APS fyldt cuvette og inkubere glimmer i 30 minutter.Overfør glimmerstykket til en kuvette fyldt med destilleret deioniseret vand og læg det i blød i 30 sekunder. Brug derefter argon til helt at tørre begge sider af APS glimmerbånd. Påfør dobbelt står tape til flere magnetiske pucks og placere dem til siden.Derefter skæres APS glimmer substrat til en centimeter med en centimeter firkanter, og dække dem i en ren petriskål. Dernæst forberedes tre fortyndinger af de samlede kerneosomer ved hjælp af en 0,22 mikronfiltreret buffer indeholdende 10 millimolar hepes og fire millimolar magnesiumchlorid ved en PH på 7,5. For at begrænse tabet af nukleosomer skal fortyndingen ved den lave slutkoncentration foretages én ad gangen umiddelbart før aflejring på APS-glimmer.Aflejr fem til 10 mikroliter af hver nukleosom prøve i midten af en APS glimmer stykke og lad dem inkubere i to minutter. Skyl derefter forsigtigt prøven med to til tre milliliter destilleret deioniseret vand for at fjerne bufferkomponenterne. Og tør den deponerede prøve under en let strøm af argon.Til at begynde, montere en spids på spidsen indehaveren af AFM setup. Derefter monteres den første prøve på AFM-scenen, og pas på ikke at komme i kontakt med prøveoverfladen. Placer laseren over kantileveren, indtil summen er på maksimum, og juster de lodrette og laterale afbøjningsværdier til næsten nul.Derefter tune AFM sonden for at finde sin resonans frekvens, justere drevet amplitude, og indstille billedstørrelsen til 100 af 100 nanometer. Når du er konfigureret, skal du klikke på knappen Engage for at starte tilgangen. Når indflyvningen er færdig, optimeres amplitudesættet gradvist, indtil prøvens overflade er tydeligt set.Derefter øges scanningsstørrelsen til en mikron med en mikron og opløsningen til 512 med 512 pixel. Klik til sidst på hentningsknappen for at starte billedopkøb. Brug glasstangscannerlim til at fastgøre en glasstang til AFM-scannerstadiet.Lad dette tørre i mindst 10 minutter. I mellemtiden gør 0,1 millimeter tykke cirkulære stykker glimmer med en 1,5 millimeter diameter ved at slå dem fra en større glimmer ark. Brug den høje hastighed AFM glimmer glas stang lim til at fastgøre denne glimmer stykke til glassang på høj hastighed AFM, og lad det forblive uberørt i mindst 10 minutter, mens det tørrer.Derefter kløve lag fra glimmer ved hjælp af et trykfølsomt bånd, indtil et godt kløvet lag ses på båndet. Dernæst fortyndes en mikroliter på 50 millimolar APS lager i 99 mikroliter af destilleret deioniseret vand til at gøre en 500 mikromolar APS løsning. Aflejr 2,5 mikroliter af opløsningen på den nykløverede glimmeroverflade og lad overfladen fungere i 30 minutter.Efter inkubationen skylles glimmer flere gange med destilleret deioniseret vand ved at påføre tre mikroliter skylninger. Fjern vandet helt efter hver skylning ved at placere en ikke-vævet tørre på kanten af glimmer. Efter den endelige skylning, placere tre mikroliter af destilleret deioniseret vand på overfladen, og lad det sidde i mindst fem minutter for at fjerne enhver ikke-specifikt bundet APS.Dernæst placeres sonden i højhastigheds-AFM-holderen, og placer holderen på AFM-scenen med spidsen opad. Skyl holderen med 100 mikroliter destilleret deioniseret vand efterfulgt af to 100 mikroliter skylninger af 0,22 mikron filtreret nukleosom billedbuffer. Med skylninger gjort, fylde kammeret med 100 mikroliter af nukleosom billeddannelse buffer, nedsænkning spidsen.Juster cantilever position, indtil det er ramt med laseren. Skyl derefter APS-glimmer fem gange med filtreret nukleosom billedbuffer ved hjælp af fire mikroliter pr. skylning. En mikroliter af nukleosomsamlingsbestanden fortyndes til 250 mikroliter filtreret nukleosombilledbuffer for en endelig nukleosomkoncentration af en nanomolar.Aflejr 2,5 mikroliter af denne fortynding på overfladen og lad det sidde i to minutter. Skyl overfladen to gange med fire mikroliter nukleosom billedbuffer for at undgå over fortrængning. Efter den endelige skylning skal overfladen være dækket af billedbuffer.Sæt scanneren og prøven oven på spidsholderen, så prøven vender nedad. For at starte indflyvningen skal du bruge den automatiske indflyvningsfunktion med sætpunktets amplitude tæt på den frie oscillationsforlydningsforlydning. Juster indstilletpunktet, indtil overfladen er godt sporet.Derefter indstille billedområdet omkring 150 med 150 nanometer til 200 ved 200 nanometer med dataindsamlingshastigheden på omkring 300 millisekunder pr billeddannelsesramme. Som en kontrol for samling og deposition, H3 mononukleosomer blev udarbejdet og afbildet ved hjælp af statisk AFM. Dette billede giver et øjebliksbillede af den nukleosom befolkning, som det eksisterede øjeblikke før deposition bekræfter, at nucelosomes blev samlet.Med H3 kontrol forsamling en succes, de præsenterede metoder blev næste anvendes til studiet af CENP-A nukleosomer. Statisk AFM billeddannelse af denne prøve afslørede sin samling var en succes. Fra de statiske AFM billeder, kan højden og vende antallet af mononukleosomer karakteriseres.Både vinklen mellem de frie DNA-arme og længden af de frie DNA-arme bruges til at bestemme antallet af DNA-sving i de enkelte nukleosom. I modsætning hertil kan tid bortfalder AFM billeddannelse af nukleosomer bruges til at visualisere den samlede spontane udpakning adfærd nukleosomer. Da nukleosomets svingnummer falder, observeres der også et tilsvarende fald i kernevolumenet.Ud over regelmæssig tid bortfalder imaging, kan høj hastighed bortfalder AFM bruges til at sonde de mere indviklede nukleosome dynamik, der er savnet ved hjælp af standard tid bortfalder billeddannelse. Denne tekniks evne til at indfange dynamikken over en lang periode var afgørende for visualiseringen af en langdistancetranslokation af en CENP-A nukleosom kerne, som blev fanget i løbet af 1200 billeder. Denne teknik var også afgørende for at opfange den sjældne overførsel af en CENP-A nukleosom kerne fra et DNA-substrat til et andet.Den hurtige billedoptagelseshastighed gjorde visualisering af denne dynamiske begivenhed mulig, da det kun tog flere billeder at fuldføre. I det brede kromatinfelt er der en række vigtige spørgsmål vedrørende liger histoners roller og histonforstørrelse af kromatindynamikken. Alle disse spørgsmål kan besvares ved hjælp af vores teknik.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biochemistry

Unit 1

Diagnostic Imaging Techniques

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Undersøgelse Proteinsekvens-struktur-dynamik Forhold med Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse af β-Amyloid-induceret afvigelser Fibrin blodprop strukturen af spektroskopi og Scanning elektronmikroskopi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Struktur løsning af fluorescerende proteiner Cerulean ved hjælp af MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Billeddannelse af ekstracellulære vesikler ved atomkraften mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-Cell Receptor Dynamics Fire-Dimensionelt Ved hjælp af gitter light-sheet mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisering af individuelle protein aggregater ved infrarød Nanospektroskopi og atomkraften mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisering af Diffusional Dynamics of Gold Nanorods på cellemembran ved hjælp af Single Nanoparticle Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...