Name: probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Auteur bijdragen: YLL en MSD ontworpen het project; MSD gemonteerd nucleosomes. MSD en ZS uitgevoerd AFM experimenten en data analyses. Alle auteurs schreef en het manuscript bewerkt.

1. continu verdunning vergadering van Mono-nucleosomes
<ol><li>Genereren en zuiveren van een ongeveer 400 bp DNA substraat dat een af-gecentreerde Widom 601 nucleosoom positionering van de reeks bevat. 55 Opmerking: Als u wilt beperken de ongewenste vorming van di-nucleosomes, elke 'arm' flankerend de positionering volgorde mag niet meer dan ~ 150 bp.<ol>
<li>Gebruik van de plasmide pGEM3Z-601 samen met de ontworpen inleidingen en versterken van het substraat-DNA met PCR. Voor de 423 bp subst...

Het protocol dat hierboven beschreven is vrij eenvoudig en bieden zeer reproduceerbare resultaten, hoewel een paar belangrijke kwesties kunnen worden benadrukt. Matiemaatschappij APS-mica is een belangrijk substraat voor het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbare resultaten. Een hoge stabiliteit van APS-mica is een van de belangrijke kenmerken van dit substraat waarmee men het imaging substraat van tevoren gereedmaakt voor gebruik dat kan worden gebruikt ten minste twee weken na voorbereid. 59</s...

In eukaryote cellen is DNA zeer verkorte en georganiseerd in de chromosomen. 1 het eerste niveau van de organisatie van het DNA in een chromosoom is de vergadering van de nucleosomes in welke 147 bp van DNA is strak gewikkeld rond een kern van Histon octamer. 2 , 3 nucleosoom deeltjes monteren op een lange DNA-molecuul vormen een chromatine-array die wordt dan georganiseerd tot een zeer compact chromosoom eenheid ontstaat. 4 de demontage van de chromatine geeft de toegang tot het DNA dat vereist is door kritische cellulaire processen zoals gene transcriptie en genoom replicatie, suggereert dat chromatine is een zeer dynamisch systeem gratis. 5 , 6 , 7 inzicht in de dynamische eigenschappen van DNA op verschillende niveaus van de chromatine is uitermate belangrijk voor het ophelderen van genetische processen op moleculair niveau waar fouten tot celdood of de ontwikkeling van ziekten zoals kanker leiden kunnen. 8 is een eigenschap van de chromatine van groot belang is de dynamiek van nucleosomes. 9 , 10 , 11 , 12 de hoge stabiliteit van deze deeltjes is toegestaan voor de karakterisering van het structurele door kristallografische technieken. 2 wat deze studies ontbreken zijn de dynamische details van nucleosomes zoals het mechanisme van DNA uitpakken vanuit de kern van Histon; de dynamische route die is vereist voor replicatie en schrijffouten en andere processen. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 bovendien speciale eiwitten remodelleert factoren genoemd is gebleken om de demontage van nucleosomal deeltjes17; de intrinsieke dynamiek van nucleosomes is echter de kritieke factor in dit proces dat tot het gehele demontage proces bijdraagt. 14 , 16 , 18 , 19
Single-molecuul technieken zoals single-molecuul fluorescentie19,20,21, optische overlapping (pincet)13,18,22,23 en AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 zijn instrumentaal in het begrip van de dynamiek van nucleosomes. Tussen deze methoden, AFM profiteert van diverse unieke en aantrekkelijke functies. AFM maakt het mogelijk om te visualiseren en karakteriseren van individuele nucleosomes evenals de langere matrices27. AFM beelden, kunnen belangrijke kenmerken van nucleosoom structuur zoals de lengte van DNA de Histon kern gewikkeld worden gemeten 10,14,26,28; een parameter die centraal staat in de karakterisering van nucleosoom uitpakken dynamiek. Verleden AFM studies is nucleosomes zeer dynamische systemen en dat DNA spontaan vanuit de kern Histon14 uitpakken kuntgebleken. De spontane uitpakken van DNA van nucleosomes was direct gevisualiseerd door AFM actief zijn in de modus time-lapse wanneer de beeldvorming wordt gedaan in waterige oplossingen 14,26,29.
De komst van de snelle time-lapse instrumentatie van de AFM (HS-AFM) maakte het mogelijk om te visualiseren van het proces nucleosoom uitpakken op de milliseconde tijdschaal 14,15,24. Recente studies van de30 van HS-AFM 16,van centromeer specifieke nucleosomes geopenbaard verschillende nieuwe functies van de nucleosomes vergeleken met het canonieke type. Centromeer nucleosomes vormen van een centromeer, een klein deel van het chromosoom cruciaal voor chromosoom segregatie31. In tegenstelling tot canonieke nucleosomes in bulk chromatine bevat de kern Histon van centromeer nucleosomes RETOREN-A Histon in plaats van Histon H332,33. Als gevolg van deze substitutie Histon, is DNA inwikkeling in centromeer nucleosomes ~ 120 bp in plaats van de 147 ~ bp voor canonieke nucleosomes; een verschil dat tot verschillende morphologies van de centromeer en canonieke nucleosomes leiden kan arrays34, suggereren dat centromeer chromatine ondergaat hogere dynamiek in vergelijking met het grootste deel een. De nieuwe dynamiek weergegeven door centromeer nucleosomes HS-AFM16,30 studies illustreren de unieke kans geboden door de techniek van deze single-molecuul te visualiseren direct de structurele en dynamische eigenschappen van nucleosomes. Voorbeelden van deze functies zal kort worden besproken en geïllustreerd aan het einde van het papier. Deze vooruitgang geboekt als gevolg van de ontwikkeling van nieuwe protocollen voor AFM beeldvorming van nucleosomes, alsmede de wijzigingen van bestaande methoden. Het doel van het protocol hier beschreven is vooruitgang te boeken deze spannende in single-molecuul AFM nucleosoom studies toegankelijk voor iedereen die graag gebruik maken van deze technieken in hun onderzoek van de chromatine. Veel van de beschreven technieken zijn van toepassing op problemen buiten de studie van nucleosomes en kunnen worden gebruikt voor onderzoek van de andere eiwitten en DNA systemen van belang. Een paar voorbeelden van dergelijke toepassingen kunnen worden gevonden in publicaties35,36,,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 en vooruitzichten van AFM studies verschillende biomoleculaire systemen worden gegeven in29,50,51,53,,54Beoordelingen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1229px;" width="1229">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmid pGEM3Z-601</td>
			<td style="width:327px;">Addgene, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:119px;">26656</td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR Primers</td>
			<td style="width:327px;">IDT, Coralville, IA</td>
			<td style="width:119px;">Custom Order</td>
			<td>(FP) 5&#39;- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3&#39; (RP) 5&#39;-ACAGCTATGACCATGATTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DreamTaq polymerase</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">EP0701</td>
			<td>Catalog number for 200 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:327px;">Qiagen, Hilden, Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td>Catalog number for 50 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tris base</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td>Catalog number for 250 g</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">EDTA</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15576028</td>
			<td>Catalog number for 500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">(CENP-A/H4)2, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0010</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H2A/H2B, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">15-0311</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H3 Octamer, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0001</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">69574</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">S9888-500G</td>
			<td>Catalog number for 500 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Amicon Ultra-0.5&#160;mL Centrifugal Filters&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Millipore-sigma, Burlington, MO</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td>Catalog number for 8 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HCl</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>258148-25ML</td>
			<td>Catalog number for 25 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tricine</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T0377-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">SDS</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">11667289001</td>
			<td>Catalog number for 1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ammonium Persulfate (AmmPS)&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610700</td>
			<td>Catalog number for 10 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td>Catalog number for 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TEMED</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610800</td>
			<td>Catalog number for 5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610747</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">2-ME</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M6250-10ML</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">ageRuler Prestained Protein Ladder&#160;</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td>Catalog number for 500 uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bio-Safe&#8482; Coomassie Stain</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610786</td>
			<td>Catalog number for 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth&#160;</td>
			<td style="width:327px;">TexWipe, Kernersvile, NC</td>
			<td style="width:119px;">TX604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Muscovite Block Mica</td>
			<td style="width:327px;">AshevilleMica, Newport News, VA</td>
			<td style="width:119px;">Grade-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aminopropyl silatrane (APS)</td>
			<td style="width:327px;">Synthesized as described in 22</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HEPES</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">H4034-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scotch Tape</td>
			<td style="width:327px;">Scotch-3M, St. Paul, MN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TESPA-V2 afm probe (for static imaging)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aron Alpha Industrial Krazy Glue</td>
			<td style="width:327px;">Toagosei America, West Jefferson, OH</td>
			<td style="width:119px;">AA480</td>
			<td>Catalog number for 2 g tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MgCl2</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M8266-100G</td>
			<td>Catalog number for 100 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Millex-GP Filter, 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">SLGP05010</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)</td>
			<td style="width:327px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FG-3020C-20&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FS-1010S135-0.5&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MultiMode Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy</td>
			<td style="width:327px;">Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging

Chromatine, oftewel een lange keten van nucleosoom subeenheden, is een dynamisch systeem dat voorziet in deze kritieke processen zoals DNA replicatie en transcriptie te nemen plaats in eukaryote cellen. De dynamiek van nucleosomes toegang biedt tot de DNA van replicatie en transcriptie machineries en kritisch bijdraagt aan de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de chromatine functies. Studies van de single-molecuul zoals atomaire kracht microscopie (AFM) imaging hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons huidige begrip van de rol van nucleosoom structuur en dynamiek. Het huidige protocol beschrijft de stappen waardoor hoge resolutie beeldvormingstechnieken van de AFM te bestuderen van de structurele en dynamische eigenschappen van nucleosomes. Het protocol wordt geïllustreerd door de AFM gegevens die zijn verkregen voor de nucleosomes van de centromeer waarin H3 Histon wordt vervangen door haar tegenhanger centromeer eiwit een (RETOREN-A). Het protocol begint met de vergadering van mono-nucleosomes met behulp van een methode van continue verdunning. De voorbereiding van het mica substraat met aminopropyl silatrane (APS-mica) die wordt gebruikt voor de beeldvorming nucleosoom matiemaatschappij is van cruciaal belang voor de AFM visualisatie van nucleosomes beschreven en de procedure voor het voorbereiden van het substraat wordt verstrekt. Nucleosomes gestort op het oppervlak van de APS-mica zijn eerste beeld met behulp van statische AFM, die een momentopname van de nucleosoom bevolking vangt. Uit analyses van deze beelden, dergelijke parameters zoals de grootte van DNA gewikkeld rond de nucleosomes kunnen worden gemeten en dit proces is ook gedetailleerd. De time-lapse AFM imaging procedure in de vloeistof wordt beschreven voor de high-speed time-lapse AFM die verschillende frames kan vangen van nucleosoom dynamiek per seconde. Ten slotte is de analyse van de dynamiek van de nucleosoom waardoor de kwantitatieve karakterisering van de dynamische processen beschreven en geïllustreerd.

Mono-nucleosomes waren eerst voorbereid op AFM imaging experimenten met behulp van een continu verdunning vergadering methode (Figuur 1). De voorbereide nucleosomes werden vervolgens gecontroleerd met behulp van de discontinue SDS-pagina (Figuur 2). Een mica oppervlak werd vervolgens matiemaatschappij met APS, die nucleosomes op het oppervlak vangt met behoud van een goede achtergrond voor hoge resolutie afbeeldingen (Figuur 3). Nuc...

Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Hier presenteren we een protocol karakteriseren nucleosoom deeltjes op het niveau van de single-molecuul met behulp van statische en time-lapse atomaire kracht microscopie (AFM) beeldvormende technieken. De beschreven methode van oppervlakte functionalization zorgt voor de opname van de structuur en de dynamiek van nucleosomes in hoge resolutie op nanoschaal.

De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Dit protocol maakt gebruik van alle belangrijke kenmerken van de AFM, niet vatbaar voor andere single molecule technieken. Als gevolg hiervan zijn we in staat om de structuur van het nucleosoom op nanoschaal op te lossen. Belangrijk is dat directe visualisatie van nucleosomen werd gedaan onder fysiologische omstandigheden.Met behulp van onze AFM-techniek hebben we onlangs unieke eigenschappen van het centromere nucleosome onthuld die een rol kunnen spelen in de functie van de hele centromere. De getoonde methode wordt momenteel toegepast in ons lab om zelfassemblage van eiwitten in verband met de vorming van amyloïde aggregaten te onderzoeken. Deze eiwitaggregaten leiden tot de ontwikkeling van verwoestende ziekten zoals Alzheimer en Parkinson om er een paar te noemen.De eenvoudige bereidingsmethoden zijn ook van toepassing op andere eiwit-DNA complexen, waaronder grote systemen zoals DNA-replicatiemachines. Hoewel sommige wijzigingen nodig zijn. Om nucleosoomdeeltjes op het niveau van één molecuul te karakteriseren met behulp van statische en time-lapse atoomkrachtmicroscopie, begint u met het zuiveren, assembleren en valideren van de nucleosomen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Bereid vervolgens het mica-oppervlak voor op statische AFM-beeldvorming. Om dit te doen, eerst een vijftig millimolar APS voorraad oplossing in gedeïmiseerd water. Bewaar een milliliter aliquots van deze oplossing op vier graden Celsius, totdat het nodig is.Bereid uit de voorraadoplossing een werkende APS-oplossing voor mica-modificatie door 50 microliter van de 50 micromolar APS-voorraad op te lossen in 15 milliliter gedestilleerd water. Meng de oplossing en vul vervolgens een cuvette met de oplossing. Snijd vervolgens een bij drie centimeter stroken mica van hoogwaardige mica-platen.Controleer of het stuk past wanneer diagonaal geplaatst in een cuvette. Dan, kloven lagen van de mica totdat beide zijden zijn vers gespleten, en het stuk is zo dun als 0,1 millimeter. Plaats onmiddellijk het micastuk in de APS gevulde cuvette en broed de mica gedurende 30 minuten uit.Breng het mica-stuk over op een cuvette gevuld met gedestilleerd gedeïsized water en geniet het gedurende 30 seconden. Gebruik vervolgens argon om beide zijden van de APS mica strip volledig te drogen. Breng dubbel geconfronteerd plakband op verschillende magnetische pucks en plaats ze aan de zijkant.Snijd vervolgens het APS mica-substraat tot een centimeter bij één centimeter en bedek ze in een schone petrischaal. Bereid vervolgens drie verdunningen van de geassembleerde nucleosomen met behulp van een 0,22 micron gefilterde buffer met 10 millimolar hepes en vier millimolar magnesiumchloride bij een PH van 7,5. Om het verlies van nucleosomen te beperken, moet bij de lage eindconcentratie de verdunning één voor één worden uitgevoerd, onmiddellijk voorafgaand aan de afzetting op het APS-mica.Deponeren vijf tot 10 microliter van elk nucleosoom monster in het midden van een APS mica stuk en laat ze incubeer voor twee minuten. Spoel vervolgens het monster voorzichtig af met twee tot drie milliliter gedestilleerd water om de buffercomponenten te verwijderen. En droog het gedeponeerde monster onder een lichte stroom argon.Om te beginnen, monteer een tip op de tip houder van de AFM setup. Monteer vervolgens het eerste monster op het AFM-podium, waarbij u voorzichtig bent om geen contact op te nemen met het monsteroppervlak. Plaats de laser over de cantilever totdat de som op het maximum is en pas de verticale en laterale afbuigingswaarden aan op bijna nul.Stem vervolgens de AFM-sonde af om de resonerende frequentie te vinden, pas de aandrijfamplitude aan en stel de beeldgrootte in op 100 bij 100 nanometer. Klik op de knop Engage om de aanpak te starten. Wanneer de aanpak is voltooid, optimaliseert u geleidelijk het ingestelde amplitudepunt totdat het oppervlak van het monster duidelijk zichtbaar is.Verhoog vervolgens de scangrootte tot één micron bij één micron en de resolutie naar 512 bij 512 pixels. Klik tot slot op de opnameknop om te beginnen met het verwerven van afbeeldingen. Gebruik lijm van de glazen staafscanner om een glazen staaf aan de AFM-scannerfase te bevestigen.Laat dit minimaal 10 minuten drogen. Maak ondertussen 0,1 millimeter dikke ronde stukjes mica met een diameter van 1,5 millimeter door ze uit een grotere micaplaat te ponsen. Gebruik de hoge snelheid AFM mica glazen staaf lijm om dit mica stuk te bevestigen aan de glazen staaf op de hoge snelheid AFM, en laat het onaangeroerd blijven voor een minimum van 10 minuten, terwijl het droogt.Dan, kloven lagen van de mica met behulp van een drukgevoelige tape tot een goed gespleten laag is te zien op de tape. Verdun vervolgens een microliter van 50 millimolar APS-voorraad in 99 microliter gedestilleerd water om een 500 micromolar APS-oplossing te maken. Deponeer 2,5 microliter van de oplossing op het vers gespleten mica-oppervlak en laat het oppervlak 30 minuten functionaliseren.Na de incubatie spoelt u de mica meerdere malen af met gedestilleerd gedeïsiseerd water door drie microliter spoelingen aan te brengen. Verwijder het water volledig na elke spoeling door het plaatsen van een niet-geweven doekje aan de rand van de mica. Na de laatste spoeling, plaats drie microliters van gedestilleerd gedeïmiseerd water op het oppervlak, en laat het zitten voor een minimum van vijf minuten om niet-specifiek gebonden APS te verwijderen.Plaats vervolgens de sonde in de hoge snelheid AFM-houder en plaats de houder op het AFM-podium met de punt naar boven gericht. Spoel de houder af met 100 microliters gedestilleerd gedeïmiseerd water, gevolgd door twee 100 microliter spoelingen van 0,22 micron gefilterd nucleosoom beeldvorming buffer. Vul met de spoelingen de kamer met 100 microliters van nucleosoom beeldvormingsbuffer, onderdompel de punt.Pas de cantilever positie aan totdat deze met de laser wordt geraakt. Spoel vervolgens de APS mica vijf keer met gefilterde nucleosoom imaging buffer, met behulp van vier microliters per spoeling. Verdun een microliter van de nucleosoom assemblagevoorraad in 250 microliter van gefilterde nucleosoom beeldvormingsbuffer voor een definitieve nucleosoomconcentratie van één nanomolar.Deponeren 2,5 microliter van deze verdunning op het oppervlak en laat het zitten voor twee minuten. Spoel het oppervlak twee keer met vier microliters van nucleosoom imaging buffer om te voorkomen dat over verdringing. Laat na de laatste spoeling het oppervlak bedekt met beeldbuffer.Stel de scanner en het monster op de top van de tiphouder in, zodat het monster naar beneden wordt geselt. Gebruik de automatische benaderingsfunctie met de ingestelde puntamplitude dicht bij de vrije oscillatieamplitude om te beginnen. Pas het ingestelde punt aan totdat het oppervlak goed wordt bijgehouden.Stel vervolgens het beeldgebied in van ongeveer 150 bij 150 nanometer op 200 bij 200 nanometer met de gegevensverwervingssnelheid van ongeveer 300 milliseconden per beeldvormend frame. Als controle voor de assemblage en depositie werden H3 mononucleosomen voorbereid en afgebeeld met behulp van statische AFM. Deze afbeelding biedt een momentopname van de nucleosoom populatie zoals deze bestond vlak voor de afzetting bevestigt dat nucelosomen met succes werden geassembleerd.Met de H3 controle assemblage een succes, werden de gepresenteerde methoden vervolgens toegepast op de studie van CENP-A nucleosomen. Statische AFM beeldvorming van dit monster bleek de montage was een succes. Uit de statische AFM-beelden kon het hoogte- en draaiaantal mononucleosomen worden gekarakteriseerd.Zowel de hoek tussen de vrije DNA-armen als de lengte van de vrije DNA-armen worden gebruikt om het aantal DNA-bochten in het individuele nucleosoom te bepalen. Daarentegen kan time lapse AFM-beeldvorming van de nucleosomen worden gebruikt om het algehele spontane uitpakgedrag van de nucleosomen te visualiseren. Naarmate het draaiaantal van het nucleosoom afneemt, wordt ook een overeenkomstige afname van het nucleosoom kernvolume waargenomen.Naast de reguliere time lapse imaging, hoge snelheid time lapse AFM kan worden gebruikt om de meer ingewikkelde nucleossome dynamiek die wordt gemist met behulp van standaard time lapse imaging sonde. Het vermogen van deze techniek om de dynamiek vast te leggen over een lange periode van tijd was essentieel voor de visualisatie van een lange afstand translocatie van een CENP-A nucleosoom kern, die werd vastgelegd in de loop van 1200 frames. Deze techniek was ook van cruciaal belang bij het vastleggen van de zeldzame overdracht van een CENP-A nucleosoom kern van het ene DNA-substraat naar het andere.De snelle beeldopnamesnelheid maakte visualisatie van deze dynamische gebeurtenis mogelijk omdat er slechts meerdere frames nodig waren om te voltooien. In het brede chromatineveld zijn er een reeks belangrijke vragen met betrekking tot de rol van liger histonen en histonvergroting van de chromatinedynamica. Al deze vragen kunnen worden beantwoord met behulp van onze techniek.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biochemistry

Unit 1

Diagnostic Imaging Techniques

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Onderzoek naar eiwitsequentie-structuur-dynamiek Relaties met Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Oplossing van de structuur van de Fluorescent Protein Cerulean met behulp van MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imaging van extracellulaire vesicles door Atoom kracht microscopie

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriseren van individuele eiwit aggregaten door infrarood nano spectroscopie en Atoom kracht microscopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Diffusional Dynamics of Gold Nanorods visualiseren op celmembraan met behulp van Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...