Name: probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00
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Beiträge Autor: YLL und MSD entwickelt das Projekt; MSD montiert Nukleosomen. MSD und ZS durchgeführt AFM-Experimente und Daten-Analysen. Alle Autoren schrieb und das Manuskript bearbeitet.

1. kontinuierliche Verdünnung Montage von Mono-Nukleosomen
<ol><li>Generieren und reinige ein ca. 400 bp DNA Substrat, das ein-zentrierten Widom 601 Nukleosom Positionierung Sequenz enthält. 55 Hinweis: Um die unerwünschten Bildung von di-Nukleosomen beschränken, jede 'Arm' flankieren die Positioniervorgang sollte nicht mehr als ~ 150 bp.<ol>
<li>Verwenden Sie Plasmid pGEM3Z-601 sowie die gestalteten Primer und verstärken Sie die Substrat-DNA mittels PCR. Für die 423 bp-Substrat mit 122...

Das oben beschriebene Protokoll ist eher einfach und hoch reproduzierbare Ergebnisse liefern, obwohl ein paar wichtige Themen hervorgehoben werden können. Funktionalisierten APS-Glimmer ist ein wichtiger Substrat für immer zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse. Eine hohe Stabilität der APS-Glimmer ist eines der wichtigsten Merkmale dieses Substrat, das ermöglicht eine bildgebende Substrat für den Einsatz vorbereiten, die mindestens zwei Wochen nach Zubereitung verwendet werden können. 59</s...

In eukaryotischen Zellen ist DNA hoch verdichteten und in Chromosomen organisierte. 1 die erste Ebene der DNA-Organisation innerhalb eines Chromosoms ist die Versammlung der Nukleosomen welche 147 bp DNA ist ein Histon Octamer Kern fest umwickelt. 2 , 3 Nukleosom Partikel montieren auf einem langen DNA-Molekül bilden ein Chromatin-Array, dann organisiert wird, bis eine kompakte Chromosom Einheit gebildet wird. 4 die Demontage des Chromatins Zugriff auf kostenlose DNS durch wichtige zelluläre Prozesse wie gen-Transkription und Genom-Replikation, was darauf hindeutet, dass das Chromatin ist ein sehr dynamisches System. 5 , 6 , 7 die dynamischen Eigenschaften der DNA auf verschiedenen Ebenen von Chromatin zu verstehen ist von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung der genetischen Prozesse auf molekularer Ebene, wo Fehler zu Zelltod oder die Entstehung von Krankheiten wie Krebs führen kann. 8 eine Chromatin-Eigenschaft von großer Bedeutung ist die Dynamik der Nukleosomen. 9 , 10 , 11 , 12 die hohe Stabilität dieser Teilchen hat für die strukturelle Charakterisierung von kristallographischen Techniken erlaubt. 2 was diese Studien-Mangel sind die dynamischen Details der Nukleosomen wie der Mechanismus der DNA aus dem Histon-Kern Auspacken; der dynamische weg davon ist erforderlich für die Transkription und Replikation. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 darüber hinaus sind spezielle Proteine bezeichnet umgestaltet Faktoren gezeigt worden, die Demontage der nucleosomal Partikel17zu erleichtern; die innere Dynamik der Nukleosomen ist jedoch der entscheidende Faktor in diesem Prozess, der zur gesamten Demontage beiträgt. 14 , 16 , 18 , 19
Einzelmolekül-Techniken wie Einzelmolekül-Fluoreszenz19,20,21, optische fallen (Pinzette)13,18,22,23 und AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 haben maßgeblich für das Verständnis der Dynamik der Nukleosomen. Unter diesen Verfahren profitiert AFM mehrere einzigartige und attraktive Features. AFM erlaubt es, zu visualisieren und zu charakterisieren, individuelle Nukleosomen sowie längere Arrays27. Von AFM Bilder können wichtige Merkmale der Nukleosom Struktur wie die Länge der DNA um die Histon-Kern gewickelt gemessenen 10,14,26,28; ein Parameter, der die Charakterisierung der Nukleosom Auspacken Dynamik im Mittelpunkt steht. Vorbei an AFM haben Studien ergeben Nukleosomen hochdynamische Systeme und DNA spontan aus dem Histon Kern14auspacken kann. Die spontane Auspacken der DNA von Nukleosomen wurde direkt von AFM Betrieb im Zeitraffer-Modus, wenn die Bildgebung in wässrigen Lösungen 14,26,29 erfolgtvisualisiert.
Das Aufkommen der High-Speed-Zeitraffer AFM (HS-AFM) Instrumentierung ermöglichte es den Nukleosom Auspacken Prozess um die Millisekunde Zeitskala 14,15,24zu visualisieren. HS-AFM 16,30 Studien von spezifischen Nukleosomen Zentromer offenbart einige Neuerungen die Nukleosomen im Vergleich mit den kanonischen Typ. Zentromer Nukleosomen bilden der Zentromer, ein kleiner Teil des Chromosoms für Chromosom Abtrennung31von entscheidender Bedeutung. Im Gegensatz zu kanonischen Nukleosomen in loser Schüttung Chromatin enthält der Histon-Kern des Centromers Nukleosomen CENP-A Histon statt Histon H332,33. Als Folge dieser Histon-Substitution ist DNA-Verpackung in Zentromer Nukleosomen ~ 120 bp statt der ~ 147 bp für kanonische Nukleosomen; ein Unterschied, der zu verschiedenen Morphologien der Zentromer und kanonische Nukleosomen führen kann arrays34, was darauf hindeutet, dass das Zentromer Chromatin höhere Dynamik im Vergleich mit der Masse eines erfährt. Die neuartige Dynamik angezeigt durch Zentromer Nukleosomen in HS-AFM16,30 Studien veranschaulichen die einmalige Gelegenheit von dieser Einzelmolekül-Technik zur Verfügung gestellt, die strukturelle und dynamische Eigenschaften direkt sichtbar zu machen Nukleosomen. Beispiele für diese Features werden kurz diskutiert und am Ende des Papiers dargestellt. Diese Fortschritte wurden durch die Entwicklung von neuartigen Protokolle für AFM Bildgebung der Nukleosomen sowie Änderungen bestehender Methoden. Das Ziel des hier beschriebenen Protokolls soll diese spannende Fortschritte in Einzelmolekül-AFM Nukleosom Studien für jedermann zugänglich zu machen, die diese Techniken in ihrer Chromatin-Untersuchungen nutzen möchten. Viele der beschriebenen Techniken gelten für Probleme über das Studium der Nukleosomen und eignet sich für Untersuchungen von anderen Proteinen und DNA-Systeme von Interesse. Ein paar Beispiele für solche Anwendungen finden Sie in Publikationen35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 und Perspektiven von AFM Studien verschiedene Biomolekulare Systeme gegeben in29,50,51,53,54Bewertungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1229px;" width="1229">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmid pGEM3Z-601</td>
			<td style="width:327px;">Addgene, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:119px;">26656</td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR Primers</td>
			<td style="width:327px;">IDT, Coralville, IA</td>
			<td style="width:119px;">Custom Order</td>
			<td>(FP) 5&#39;- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3&#39; (RP) 5&#39;-ACAGCTATGACCATGATTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DreamTaq polymerase</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">EP0701</td>
			<td>Catalog number for 200 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:327px;">Qiagen, Hilden, Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td>Catalog number for 50 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tris base</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td>Catalog number for 250 g</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">EDTA</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15576028</td>
			<td>Catalog number for 500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">(CENP-A/H4)2, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0010</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H2A/H2B, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">15-0311</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H3 Octamer, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0001</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">69574</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">S9888-500G</td>
			<td>Catalog number for 500 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Amicon Ultra-0.5&#160;mL Centrifugal Filters&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Millipore-sigma, Burlington, MO</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td>Catalog number for 8 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HCl</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>258148-25ML</td>
			<td>Catalog number for 25 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tricine</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T0377-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">SDS</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">11667289001</td>
			<td>Catalog number for 1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ammonium Persulfate (AmmPS)&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610700</td>
			<td>Catalog number for 10 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td>Catalog number for 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TEMED</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610800</td>
			<td>Catalog number for 5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610747</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">2-ME</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M6250-10ML</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">ageRuler Prestained Protein Ladder&#160;</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td>Catalog number for 500 uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bio-Safe&#8482; Coomassie Stain</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610786</td>
			<td>Catalog number for 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth&#160;</td>
			<td style="width:327px;">TexWipe, Kernersvile, NC</td>
			<td style="width:119px;">TX604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Muscovite Block Mica</td>
			<td style="width:327px;">AshevilleMica, Newport News, VA</td>
			<td style="width:119px;">Grade-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aminopropyl silatrane (APS)</td>
			<td style="width:327px;">Synthesized as described in 22</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HEPES</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">H4034-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scotch Tape</td>
			<td style="width:327px;">Scotch-3M, St. Paul, MN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TESPA-V2 afm probe (for static imaging)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aron Alpha Industrial Krazy Glue</td>
			<td style="width:327px;">Toagosei America, West Jefferson, OH</td>
			<td style="width:119px;">AA480</td>
			<td>Catalog number for 2 g tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MgCl2</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M8266-100G</td>
			<td>Catalog number for 100 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Millex-GP Filter, 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">SLGP05010</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)</td>
			<td style="width:327px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FG-3020C-20&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FS-1010S135-0.5&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MultiMode Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy</td>
			<td style="width:327px;">Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging

Chromatin, die eine lange Kette von Nukleosom Untereinheiten ist, ist ein dynamisches System, das für solche kritischen Prozesse ermöglicht, als DNA-Replikation und Transkription, nehmen in eukaryotischen Zellen. Die Dynamik der Nukleosomen ermöglicht den Zugriff auf die DNA von Replikation und Transkription Maschinen und kritisch zu den molekularen Mechanismen Chromatin Funktionen trägt. Einzelmolekül-Studien wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) imaging trugen erheblich zur unser gegenwärtiges Verständnis der Rolle der Nukleosom Struktur und Dynamik. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Schritte, die es ermöglicht hochauflösende AFM bildgebende Verfahren, die strukturelle und dynamische Eigenschaften der Nukleosomen zu studieren. Das Protokoll wird illustriert durch AFM Daten für das Zentromer Nukleosomen bei denen Histon H3 mit seinen Amtskollegen Zentromer Protein A (CENP-A) ersetzt wird. Das Protokoll beginnt mit der Montage der Mono-Nukleosomen mit einer kontinuierlichen Verdünnungsmethode. Die Vorbereitung des Glimmer Substrats funktionalisiert mit Aminopropyl Silatrane (APS-Glimmer), die für das Nukleosom-Bildgebung verwendet wird ist von entscheidender Bedeutung für die AFM-Visualisierung von Nukleosomen beschrieben und das Verfahren, das Substrat vorzubereiten wird erläutert. Nukleosomen hinterlegt auf der APS-Glimmer-Oberfläche werden zuerst abgebildet mit statischen AFM, die eine Momentaufnahme der Nukleosom Bevölkerung erfasst. Aus Analysen dieser Bilder Parameter wie die Größe der DNA umwickelt die Nukleosomen gemessen werden und dieser Prozess ist auch detailliert. Die Time-Lapse AFM bildgebende Verfahren in der Flüssigkeit ist für die High-Speed-Zeitraffer-AFM, die mehrere Frames erfassen können beschrieben Nukleosom Dynamik pro Sekunde. Schließlich ist die Analyse der Nukleosom Dynamik ermöglicht die quantitative Charakterisierung der dynamischen Prozesse beschrieben und illustriert.

Mono-Nukleosomen wurden zunächst für AFM vorbereitet bildgebende Untersuchungen mit einer kontinuierlichen Verdünnungsmethode der Montage (Abbildung 1). Die vorbereiteten Nukleosomen wurden dann überprüft mit diskontinuierlichen SDS-PAGE (Abbildung 2). Eine Glimmer-Oberfläche wurde als nächstes funktionalisiert mit APS, die Nukleosomen an der Oberfläche erfasst und gleichzeitig einen reibungslosen Hintergrund für hochauflösende Bildgebung (<strong clas...

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Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Charakterisierung von Nukleosom Partikel auf der Einzelmolekül-Ebene mit statischen und Zeitraffer Rasterkraftmikroskopie (AFM) bildgebende Verfahren. Die Oberfläche Funktionalisierung beschriebene Methode ermöglicht die Erfassung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen in hoher Auflösung im Nanobereich.

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Dieses Protokoll nutzt alle wichtigen Funktionen von AFM, nicht zugänglich für andere Einzelmolekül-Techniken. Dadurch sind wir in der Lage, die Struktur des Nukleosoms im Nanomaßstab zu lösen. Wichtig ist, dass die direkte Visualisierung von Nukleosomen unter physiologischen Bedingungen durchgeführt wurde.Mit unserer AFM-Technik haben wir vor kurzem einzigartige Eigenschaften des Zentromosonats entdeckt, die eine Rolle auf der Funktion des gesamten Zentrimerosen spielen können. Die zu zeigende Methode wird derzeit in unserem Labor angewendet, um die Selbstmontage von Proteinen zu untersuchen, die mit der Bildung von Amyloid-Aggregaten verbunden sind. Diese Proteinaggregate lösen die Entwicklung von verheerenden Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson aus, um nur einige zu nennen.Die einfachen Zubereitungsmethoden sind auch auf andere Protein-DNA-Komplexe anwendbar, einschließlich großer Systeme wie DNA-Replikationsmaschinen. Obwohl einige Änderungen erforderlich sind. Um Nukleosomenpartikel auf Einzelmolekülebene mittels statischer und zeitrafferischer Atomkraftmikroskopie zu charakterisieren, beginnen Sie mit der Reinigung, Montage und Validierung der Nukleosomen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.Als Nächstes bereiten Sie die Glimmeroberfläche für die statische AFM-Bildgebung vor. Um dies zu tun, bereiten Sie zunächst eine fünfzig Millimolar APS-Lagerlösung in entionisiertem Wasser vor. Lagern Sie einen Milliliter Aliquots dieser Lösung bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt wird.Aus der Lagerlösung eine funktionierende APS-Lösung für die Glimmermodifikation vorzubereiten, indem Sie 50 Mikroliter des 50 Mikromolaren APS-Bestands in 15 Milliliter destilliertem deionisiertem Wasser auflösen. Mischen Sie die Lösung und füllen Sie dann eine Küvette mit der Lösung. Als nächstes schneiden Sie einen mal drei Zentimeter Streifen Glimmer aus hochwertigen Glimmerplatten.Prüfen Sie, ob das Stück diagonal in eine Küvette passt. Dann spalten Schichten des Glimmers, bis beide Seiten frisch gespaltet sind, und das Stück ist so dünn wie 0,1 Millimeter. Legen Sie das Glimmerstück sofort in die APS-gefüllte Küvette und inkubieren Sie den Glimmer 30 Minuten lang.Das Glimmerstück auf eine mit destilliertem deionisiertem Wasser gefüllte Küvette übertragen und 30 Sekunden einweichen. Verwenden Sie dann Argon, um beide Seiten des APS-Glimmerstreifens vollständig zu trocknen. Tragen Sie doppelt Gesicht Klebeband auf mehrere magnetische Pucks und legen Sie sie auf die Seite.Dann schneiden Sie das APS-Glimmersubstrat auf einen Zentimeter um einen Zentimeter Quadrate und bedecken Sie es mit einer sauberen Petrischale. Als nächstes bereiten Sie drei Verdünnungen der zusammengesetzten Nukleosomen mit einem 0,22 Mikrometer gefilterten Puffer vor, der 10 Millimolarhepes und vier Millimolar-Magnesiumchlorid mit einem PH von 7,5 enthält. Um den Verlust von Nukleosomen bei der geringen Endkonzentration zu begrenzen, sollte die Verdünnung unmittelbar vor der Ablagerung auf dem APS-Glimmer nacheinander erfolgen.Legen Sie fünf bis zehn Mikroliter jeder Nukleosomprobe in der Mitte eines APS-Glimmerstücks ab und lassen Sie sie zwei Minuten lang brüten. Dann spülen Sie die Probe vorsichtig mit zwei bis drei Milliliterdem destilliertem entionisiertem Wasser ab, um die Pufferkomponenten zu entfernen. Und trocknen Sie die abgelagerte Probe unter einem leichten Fluss von Argon.Um zu beginnen, montieren Sie eine Spitze auf dem Spitzenhalter des AFM-Setups. Montieren Sie dann die erste Probe auf der AFM-Stufe, wobei Sie darauf achten, nicht mit der Probenoberfläche in Kontakt zu treten. Positionieren Sie den Laser über dem Ausleger, bis seine Summe am Maximum liegt, und stellen Sie die vertikalen und seitlichen Umlenkwerte auf nahe Null ein.Stimmen Sie dann die AFM-Sonde so ab, dass sie ihre Resonanzfrequenz findet, passen Sie die Antriebsamplitude an und stellen Sie die Bildgröße auf 100 mal 100 Nanometer ein. Nachdem Sie die Einrichtung vorgenommen haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Einbinden", um den Ansatz zu beginnen. Wenn der Ansatz abgeschlossen ist, optimieren Sie schrittweise den Amplituden-Sollwert, bis die Oberfläche der Probe klar sichtbar ist.Erhöhen Sie dann die Scangröße um einen Mikron auf ein Mikron und die Auflösung auf 512 x 512 Pixel. Klicken Sie schließlich auf die Aufnahmeschaltfläche, um mit der Bildaufnahme zu beginnen. Verwenden Sie Glasstabscannerkleber, um eine Glasstange an der AFM-Scannerstufe zu befestigen.Lassen Sie dies für mindestens 10 Minuten trocknen. In der Zwischenzeit 0,1 Millimeter dicke kreisförmige Glimmerstücke mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern herstellen, indem man sie aus einem größeren Glimmerblech stanzt. Verwenden Sie den Hochgeschwindigkeits-AFM Glimmer-Glasstabkleber, um dieses Glimmerstück an der Glasstange des Hochgeschwindigkeits-AFM zu befestigen und es mindestens 10 Minuten lang unberührt zu lassen, während es trocknet.Dann spalten Sie Schichten aus dem Glimmer mit einem druckempfindlichen Band, bis eine gut gespaltete Schicht auf dem Band zu sehen ist. Als nächstes verdünnen Sie einen Mikroliter 50 Millimolar APS Lager in 99 Mikroliter destilliertem deionisiertem Wasser, um eine 500 Mikromolar APS Lösung zu machen. 2,5 Mikroliter der Lösung auf die frisch gespaltete Glimmeroberfläche ablagern und die Oberfläche 30 Minuten funktionalisieren lassen.Nach der Inkubation spülen Sie den Glimmer mehrmals mit destilliertem entionisiertem Wasser, indem Sie drei Mikroliter Spülungen auftragen. Entfernen Sie das Wasser nach jeder Spülung vollständig, indem Sie ein Vliesamperam am Rand des Glimmers platzieren. Legen Sie nach der endgültigen Spülung drei Mikroliter destilliertes deionisiertes Wasser auf die Oberfläche und lassen Sie es mindestens fünf Minuten sitzen, um alle nicht spezifisch gebundenen APS zu entfernen.Als nächstes legen Sie die Sonde in den Hochgeschwindigkeits-AFM-Halter und positionieren Sie den Halter auf der AFM-Bühne mit der Spitze nach oben. Spülen Sie den Halter mit 100 Mikroliter destilliertem entionisiertem Wasser, gefolgt von zwei 100-Mikroliter-Spülungen mit 0,22 Mikron gefiltertem Nukleosom-Bildgebungspuffer. Mit den Spülungen, füllen Sie die Kammer mit 100 Mikroliter Nukleosom Bildgebung Puffer, untertauchen die Spitze.Passen Sie die Auslegerposition an, bis sie mit dem Laser getroffen wird. Spülen Sie dann die APS Glimmer fünfmal mit gefiltertem Nukleosom-Bildgebungspuffer mit vier Mikrolitern pro Spülung. Verdünnen Sie einen Mikroliter des Nukleosom-Montagebestands in 250 Mikroliter gefilterten Nukleosom-Bildgebungspuffers für eine endgültige Nukleosomenkonzentration von einem Nanomolar.2,5 Mikroliter dieser Verdünnung auf die Oberfläche legen und zwei Minuten sitzen lassen. Spülen Sie die Oberfläche zweimal mit vier Mikrolitern Nukleosom-Bildgebungspuffer, um über Dassamezuberg zu vermeiden. Lassen Sie nach dem letzten Spülen die Oberfläche mit einem Bildpuffer bedeckt.Stellen Sie den Scanner und die Probe auf den Spitzenhalter, sodass die Probe verdeckt ist. Um den Ansatz zu beginnen, verwenden Sie die Auto-Anflug-Funktion mit der Sollwertamplitude in der Nähe der freien Schwingungsamplitude. Passen Sie den Sollwert an, bis die Oberfläche gut verfolgt wird.Legen Sie dann den Bildbereich um 150 mal 150 Nanometer auf 200 mal 200 Nanometer bei der Datenerfassungsrate von etwa 300 Millisekunden pro Bildbildrahmen fest. Als Steuerung für die Montage und Ablagerung wurden H3-Mononukleosomen mit statischem AFM hergestellt und abgebildet. Dieses Bild liefert eine Momentaufnahme der Nukleosompopulation, wie sie momente vor der Ablagerung existierte und bestätigte, dass Nukelosome erfolgreich zusammengesetzt wurden.Mit dem Erfolg der H3-Kontrollbaugruppe wurden die vorgestellten Methoden als nächstes auf die Untersuchung von CENP-A-Nukleosomen angewendet. Statische AFM-Bildgebung dieser Probe zeigte, dass ihre Montage ein Erfolg war. Aus den statischen AFM-Bildern konnte die Höhe und Wendezahl der Mononukleosomen charakterisiert werden.Sowohl der Winkel zwischen den freien DNA-Armen als auch die Länge der freien DNA-Arme werden verwendet, um die Anzahl der DNA-Drehungen im einzelnen Nukleosom zu bestimmen. Im Gegensatz dazu kann die Zeitraffer-AFM-Bildgebung der Nukleosomen verwendet werden, um das spontane Entpackverhalten der Nukleosomen zu visualisieren. Wenn die Wendezahl des Nukleosoms abnimmt, wird auch eine entsprechende Abnahme des Nukleosom-Kernvolumens beobachtet.Zusätzlich zur regelmäßigen Zeitraffer-Bildgebung kann High-Speed-Zeitraffer AFM verwendet werden, um die kompliziertere Nukleosomendynamik zu untersuchen, die mit Der Standardzeitraffer-Bildgebung übersehen wird. Die Fähigkeit dieser Technik, die Dynamik über einen langen Zeitraum zu erfassen, war entscheidend für die Visualisierung einer Ferntranslokation eines CENP-A-Nukleosomkerns, der im Laufe von 1200 Frames erfasst wurde. Diese Technik war auch entscheidend bei der Erfassung des seltenen Transfers eines CENP-A-Nukleosomkerns von einem DNA-Substrat zum anderen.Die schnelle Bildaufnahmerate ermöglichte die Visualisierung dieses dynamischen Ereignisses, da nur mehrere Frames zu absolvieren waren. Im breiten Chromatinfeld gibt es eine Reihe wichtiger Fragen zu den Rollen von Liger-Histones und der Histonvergrößerung der Chromatindynamik. All diese Fragen können mit unserer Technik beantwortet werden.

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

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Untersuchung der Proteinsequenz-Struktur-Dynamik Beziehungen zu Bio3D-Web

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Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

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