Name: probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

מחבר תרומות: YLL ו- MSD תוכנן הפרויקט; MSD התאספו נוקליאוזומים. MSD, נמנום לבצע ניתוחים ניסויים ונתוני AFM. כל המחברים כתב וערך את כתב היד.

1. רציף דילול הרכבה של מונו-נוקליאוזומים
<ol><li>לייצר ולטהר המצע דנ א כ- 400 של bp המכיל את ממורכז ווידום 601 נוקלאוזום מיצוב רצף. 55 הערה: כדי להגביל את היווצרות di-נוקליאוזומים לא רצויים, כל 'זרוע' איגוף הרצף המיקום לא יעלה על ~ 150 bp.<ol>
<li>השתמש פלסמיד pGEM3Z-601 יחד עם תחל תוכנן ומגבירים את ה...

הפרוטוקול המתואר לעיל היא פשוטה למדי, מספקים תוצאות מאוד לשחזור, למרות כמה נושאים חשובים יכול להדגיש. Functionalized APS-מיכה הוא מצע מפתח להשגת תוצאות אמין לשחזור. יציבות גבוהה של APS-מיכה היא אחת התכונות החשובות של סובסטרט זה המאפשר אחד כדי להכין את המצע הדמיה מראש לשימוש שיכול לשמש לפחות שבועיים ?...

התאים האיקריוטים, ה-DNA הוא מאוד מרוכז ומאורגן לתוך כרומוזומים. 1 הרמה הראשונה של ארגון ה-DNA בתוך כרומוזום הוא ההרכבה של נוקליאוזומים ב 147 אילו bp של ה-DNA הוא מתאמץ יותר סביב ליבה octamer היסטון. 2 , 3 נוקלאוזום חלקיקים להרכיב על מולקולה DNA ארוך יוצרים מערך כרומטין אשר מאורגן אז עד יחידה קומפקטית מאוד כרומוזום נוצר. 4 פירוק של כרומטין מאפשר גישה חינם דנ א הנדרש על-ידי תהליכים תאיים קריטיים כגון שכפול שעתוק ו גנום של ג'ין, רומז שכרומטין הזה הוא מערכת דינמי מאוד. 5 , 6 , 7 להבנת מאפייני ה-DNA ברמות שונות של כרומטין דינמי הוא חשוב ביותר עבור שחקרתי תהליכים גנטיים ברמה המולקולרית בו טעויות עלולות להוביל מוות של תאים או ההתפתחות של מחלות כמו סרטן. 8 מאפיין כרומטין חשיבות רבה הוא הדינמיקה של נוקליאוזומים. 9 , 10 , 11 , 12 ליציבות גבוהה של חלקיקים אלה אפשרה עבור אפיון מבניים על-ידי טכניקות לחקר הגבישים. 2 . איזה חוסר מחקרים אלה הם הפרטים דינמי של נוקליאוזומים כגון מנגנון ה-DNA הסרת העטיפה מן הליבה היסטון; מסלול דינמי אשר נדרשת עבור תהליכי שעתוק ושכפול. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 . בנוסף, חלבונים מיוחדים כינה גורמים שיפוץ הוכחו להקל את פירוק של חלקיקים nucleosomal17; אולם, הדינמיקה הפנימית של נוקליאוזומים הוא הגורם הקריטי בתהליך זה תורם לתהליך פירוק כולו. 14 , 16 , 18 , 19
מולקולה בודדת טכניקות כגון מולקולה בודדת פלורסצנטיות19,20,21,22,18,13,אופטי השמנה (פינצטה)23 ו AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 סייעו להבין את הדינמיקה של נוקליאוזומים. בין השיטות, נהנה AFM מספר תכונות ייחודי ואטרקטיבי. AFM מאפשר לנו להמחיש ולאפיין נוקליאוזומים בודדים, כמו גם את מערכי עוד27. AFM תמונות, המאפיינים החשובים של נוקלאוזום מבנה כגון אורך DNA סביב ליבת היסטון יכול להיות נמדדו 10,14,26,28; פרמטר זה הוא מרכזי האפיון של דינמיקה unwrapping נוקלאוזום. מעבר AFM מחקרים גילו נוקליאוזומים להיות דינמי מאוד ומערכות ה-DNA תוכל לפתוח באופן ספונטני מן הליבה היסטון14. ספונטנית הסרת העטיפה של ה-DNA של נוקליאוזומים היה דמיינו ישירות על ידי AFM לפעול במצב זמן לשגות כאשר ההדמיה נעשית פתרונות מימית 14,26,29.
כניסתו של מכשור מיקרוסקופ כוח אטומי (HS-AFM) במהירות גבוהה זמן לשגות אפשרו להמחיש את התהליך unwrapping נוקלאוזום אלפיות השנייה סרגל זמן 14,15,24. HS-AFM 16,30 המחקרים האחרונים נוקליאוזומים ספציפי צנטרומר גילה מספר תכונות הרומן של נוקליאוזומים לעומת הסוג הקנוני. צנטרומר נוקליאוזומים מהווים של צנטרומר, חלק קטן של כרומוזום חשוב ביותר עבור כרומוזום סגרגציה31. בניגוד נוקליאוזומים הקנוני של כרומטין בתפזורת, ליבת היסטון צנטרומר נוקליאוזומים מכיל CENP-A היסטון במקום היסטון H332,33. החלפה זו היסטון, גלישת ה-DNA של נוקליאוזומים צנטרומר היא ~ 120 bp במקום 147 ~ bp נוקליאוזומים הקנוני; הבדל זה יכול להוביל מורפולוגיות שונות של צנטרומר, נוקליאוזומים הקנוני מערכים34, רומז שכרומטין צנטרומר הזה עובר dynamics גבוה יותר לעומת הנפח אחד. הדינמיקות הרומן מוצג על ידי צנטרומר נוקליאוזומים במחקרים30 16,HS-AFM להדגים הזדמנות ייחודית שסופקו על-ידי טכניקה זו מולקולה בודדת ישירות להמחיש את המאפיינים דינמי מבניים של נוקליאוזומים. דוגמאות לתכונות ניתן בקצרה שנדונו ואת מאויר בסוף העיתון. התקדמות זו נעשתה עקב ההתפתחות של פרוטוקולים הרומן AFM הדמיה של נוקליאוזומים, כמו גם את השינויים של שיטות קיימות. המטרה של הפרוטוקול המתואר כאן היא להפוך את ההתפתחויות הללו מרגש במחקרים נוקלאוזום AFM מולקולה בודדת נגישה לכל מי שרוצה לנצל את טכניקות האלה החקירות שלהם כרומטין. רבים אחת מהטכניקות שתוארו החלות על בעיות מעבר המחקר של נוקליאוזומים, יכול לשמש עבור חקירות אחרות חלבון ומערכות ה-DNA של עניין. ניתן למצוא כמה דוגמאות של יישומים כגון פרסומים35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 ועתידה של AFM מחקרים של מערכות למערכות ביולוגיות שונות ניתנות ב דעת29,50,51,53,54.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1229px;" width="1229">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmid pGEM3Z-601</td>
			<td style="width:327px;">Addgene, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:119px;">26656</td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR Primers</td>
			<td style="width:327px;">IDT, Coralville, IA</td>
			<td style="width:119px;">Custom Order</td>
			<td>(FP) 5&#39;- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3&#39; (RP) 5&#39;-ACAGCTATGACCATGATTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DreamTaq polymerase</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">EP0701</td>
			<td>Catalog number for 200 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:327px;">Qiagen, Hilden, Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td>Catalog number for 50 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tris base</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td>Catalog number for 250 g</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">EDTA</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15576028</td>
			<td>Catalog number for 500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">(CENP-A/H4)2, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0010</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H2A/H2B, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">15-0311</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H3 Octamer, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0001</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">69574</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">S9888-500G</td>
			<td>Catalog number for 500 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Amicon Ultra-0.5&#160;mL Centrifugal Filters&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Millipore-sigma, Burlington, MO</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td>Catalog number for 8 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HCl</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>258148-25ML</td>
			<td>Catalog number for 25 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tricine</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T0377-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">SDS</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">11667289001</td>
			<td>Catalog number for 1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ammonium Persulfate (AmmPS)&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610700</td>
			<td>Catalog number for 10 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td>Catalog number for 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TEMED</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610800</td>
			<td>Catalog number for 5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610747</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">2-ME</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M6250-10ML</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">ageRuler Prestained Protein Ladder&#160;</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td>Catalog number for 500 uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bio-Safe&#8482; Coomassie Stain</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610786</td>
			<td>Catalog number for 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth&#160;</td>
			<td style="width:327px;">TexWipe, Kernersvile, NC</td>
			<td style="width:119px;">TX604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Muscovite Block Mica</td>
			<td style="width:327px;">AshevilleMica, Newport News, VA</td>
			<td style="width:119px;">Grade-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aminopropyl silatrane (APS)</td>
			<td style="width:327px;">Synthesized as described in 22</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HEPES</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">H4034-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scotch Tape</td>
			<td style="width:327px;">Scotch-3M, St. Paul, MN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TESPA-V2 afm probe (for static imaging)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aron Alpha Industrial Krazy Glue</td>
			<td style="width:327px;">Toagosei America, West Jefferson, OH</td>
			<td style="width:119px;">AA480</td>
			<td>Catalog number for 2 g tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MgCl2</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M8266-100G</td>
			<td>Catalog number for 100 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Millex-GP Filter, 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">SLGP05010</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)</td>
			<td style="width:327px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FG-3020C-20&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FS-1010S135-0.5&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MultiMode Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy</td>
			<td style="width:327px;">Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging

כרומטין, אשר שרשרת ארוכה של נוקלאוזום subunits, היא מערכת דינמית המאפשרת עבור תהליכים קריטיים כאלה כמו שכפול ה-DNA, תמלול לקחת למקם את התאים האיקריוטים. הדינמיקה של נוקליאוזומים מספקת גישה אל ה-DNA על ידי שעתוק ושכפול machineries, ותורמת באופן ביקורתי המנגנונים המולקולריים שבבסיס כרומטין פונקציות. מולקולה בודדת מחקרים כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הדמיה תרמו באופן משמעותי את ההבנה הנוכחית שלנו התפקיד של מבנה נוקלאוזום ואת הדינמיקה. בפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים הפעלת טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה של AFM ללמוד את המאפיינים דינמי מבניים של נוקליאוזומים. הפרוטוקול מודגם על ידי AFM נתונים שהושגו עבור נוקליאוזומים צנטרומר שבו H3 היסטון מוחלף עם עמיתו שלה, צנטרומר חלבונים (CENP-A). הפרוטוקול מתחיל עם ההרכבה של מונו-נוקליאוזומים באמצעות שיטה דילול רציפה. הכנת המצע נציץ functionalized עם aminopropyl silatrane (APS-מיכה) המשמשת עבור ההדמיה נוקלאוזום הוא קריטי עבור הפריט החזותי AFM של נוקליאוזומים תיאר וסיפק ההליך כדי להכין את המצע. נוקליאוזומים שהופקדו על פני השטח APS-מיכה הם קודם עם תמונה באמצעות AFM סטטיים, אשר לוכדת תמונה של האוכלוסייה נוקלאוזום. מניתוחי בתמונות אלו, ניתן למדוד פרמטרים כגון כמו הגודל של DNA העוטפת את נוקליאוזומים, תהליך זה גם מפורט. AFM זמן לשגות הדמיה הליך בנוזל מתואר עבור AFM בצילום מואץ במהירות גבוהה כי יכול ללכוד מספר פריימים של נוקלאוזום דינמיקה לשניה. לבסוף, הניתוח של דינמיקה נוקלאוזום המאפשרים אפיון כמותי תהליכים דינאמיים תיאר, מאויר.

מונו-נוקליאוזומים שהוכנו קודם עבור AFM הדמיה ניסויים באמצעות שיטת הרכבה רציפה דילול (איור 1). נוקליאוזומים מוכן ואז נבדקו באמצעות מרחביות מקוטע-דף (איור 2). משטח מישה היה functionalized הבא באמצעות APS, אשר לוכדת נוקליאוזומים על פני השטח תוך שמירה על רקע חלקה עבור הדמי?...

Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפיון חלקיקים נוקלאוזום ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי ו בצילום מואץ (AFM) טכניקות הדמיה. שיטת functionalization פני השטח המתואר מאפשרת לכידתו של המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים ב ברזולוציה גבוהה ב הננומטרי.

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

פרוטוקול זה משתמש בכל התכונות העיקריות של AFM, שאינו נוח לטכניקות אחרות של מולקולה אחת. כתוצאה מכך, אנו מסוגלים לפתור מבנה של גרעין בקנה מידה ננו. חשוב לציין, הדמיה ישירה של נוקלאוזומים נעשתה בתנאים פיזיולוגיים.באמצעות טכניקת AFM שלנו, חשפנו לאחרונה תכונות ייחודיות של גרעין centromere שיכול לשחק תפקיד על הפונקציה של centromere כולו. השיטה המוצגת מיושמת כיום במעבדה שלנו כדי לחקור הרכבה עצמית של חלבונים הקשורים להיווצרות אגרגטים עמילואיד. אגרגטים חלבון אלה לעורר את ההתפתחות של מחלות הרסניות כגון אלצהיימר ופרקינסון שם כמה.שיטות ההכנה הפשוטות חלות גם על מתחמי חלבון-DNA אחרים, כולל מערכות גדולות כגון מכונות שכפול DNA. למרות שיש צורך בשינויים מסוימים. על מנת לאפיין חלקיקי גרעין ברמת המולקולה הבודדת באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי סטטי וזמן לשגות, להתחיל בטיהור, הרכבה ואימות של הנוקלאוזומים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.לאחר מכן, הכינו את משטח הנציץ להדמיית AFM סטטית. כדי לעשות זאת, תחילה להכין פתרון מלאי APS חמישים מילימולר במים deionized. יש לאחסן מיליליטר אחד של פתרון זה בארבע מעלות צלזיוס, עד שיידרש.מפתרון המלאי, הכינו פתרון APS עובד לשינוי נציץ על ידי המסת 50 מיקרוליטרים של מלאי APS 50 מיקרומולרים ב-15 מיליליטר של מים מזוקקים. מערבבים את הפתרון ולאחר מכן למלא cuvette עם הפתרון. לאחר מכן, חותכים אחד על שלושה סנטימטרים רצועות של נציץ מסדינים נציץ באיכות גבוהה.בדוק כי החתיכה מתאימה כאשר ממוקם באלכסון ב cuvette. לאחר מכן, לחשוף שכבות של נציץ עד שני הצדדים הם מחשוף טרי, ואת היצירה היא דקה כמו 0.1 מילימטר. מיד מניחים את חתיכת נציץ לתוך CUVETTE מלא APS ולה הדגירה נציץ במשך 30 דקות.מעבירים את חתיכת הנציץ לקעקה מלאה במים מזוקקים ומשרים אותה במשך 30 שניות. לאחר מכן, השתמש בארגון כדי לייבש לחלוטין את שני הצדדים של רצועת נציץ APS. החל סרט דבק כפול פנים על כמה דיסקיות מגנטיות ולהמקם אותם בצד.לאחר מכן, חותכים את מצע נציץ APS לס"מ אחד על ידי ריבועים של סנטימטר אחד, ומכסים אותם בצלחת פטרי נקייה. לאחר מכן, להכין שלושה דילולים של נוקלאוזומים התאספו באמצעות חיץ מסונן 0.22 מיקרון המכיל 10 קיפ מילימולר וארבעה מילימולר מגנזיום כלורי ב PH של 7.5. כדי להגביל את אובדן נוקלאוזומים, בריכוז הסופי הנמוך, הדילול צריך להיעשות אחד בכל פעם, מיד לפני התצהיר על נציץ APS.להפקיד חמישה עד 10 microliters של כל דגימת גרעין במרכז חתיכת נציץ APS ולתת להם דגירה במשך שתי דקות. לאחר מכן, לשטוף בעדינות את המדגם עם שניים עד שלושה מיליליטר של מים מזוקקים deionized כדי להסיר את רכיבי החיץ. ולייבש את הדגימה שהופקדה תחת זרימת אור של ארגון.כדי להתחיל, תן עצה על מחזיק הקצה של מערך AFM. לאחר מכן, לטעון את המדגם הראשון על שלב AFM, נזהר לא ליצור קשר עם פני השטח מדגם. מקם את הלייזר מעל cantilever עד הסכום שלה הוא לכל היותר ולהתאים את ערכי הסטה אנכית צדדית קרוב לאפס.לאחר מכן, לכוון את החללית AFM כדי למצוא את התדר תהודה שלה, להתאים את משרעת הכונן, ולהגדיר את גודל התמונה ל 100 על ידי 100 ננומטר. לאחר הגדרתו, לחץ על לחצן המעורבות כדי להתחיל בגישה. כאשר הגישה הושלמה, בהדרגה לייעל את נקודת הגדרת משרעת עד פני השטח של המדגם נראה בבירור.לאחר מכן, הגדל את גודל הסריקה למיקרון אחד במיקרון אחד ואת הרזולוציה ל- 512 על 512 פיקסלים. לבסוף, לחץ על לחצן הלכידה כדי להתחיל ברכישת תמונה. השתמש בדבק סורק מוט זכוכית כדי לחבר מוט זכוכית לשלב הסורק AFM.אפשר לזה להתייבש לפחות 10 דקות. בינתיים, לעשות 0.1 מילימטר עבה חתיכות עגולות של נציץ עם קוטר 1.5 מילימטר על ידי אגרוף אותם מתוך גיליון נציץ גדול יותר. השתמש דבק מוט זכוכית AFM נציץ במהירות גבוהה כדי לחבר את חתיכת נציץ זה מוט זכוכית על AFM במהירות גבוהה, ולאפשר לו להישאר ללא פגע במשך מינימום של 10 דקות בזמן שהוא מתייבש.לאחר מכן, לחשוף שכבות מן הנציצה באמצעות סרט רגיש ללחץ עד שכבה מחשוף היטב נראה על הקלטת. לאחר מכן, לדלל microliter אחד של 50 מילימולר מניית APS ב 99 microliters של מים מזוקקים deionized כדי להפוך את פתרון APS מיקרומולר 500. הפקידו 2.5 מיקרוליטרים של הפתרון על משטח הנציץ הטרי ותנו לפני השטח לתפקד במשך 30 דקות.לאחר הדגירה, לשטוף את נציץ מספר פעמים עם מים מזוקקים deionized על ידי החלת שלוש שטיפות microliters. הסר את המים לחלוטין בעקבות כל שטיפה על ידי הנחת לנגב לא ארוג בקצה הנציץ. לאחר שטיפה סופית, מניחים שלושה microliters של מים מזוקקים deionized על פני השטח, ולתת לו לשבת לפחות חמש דקות כדי להסיר כל APS שאינו קשור במיוחד.לאחר מכן, מניחים את החללית במחזיק AFM במהירות גבוהה, וממקם את המחזיק על הבמה AFM עם הקצה פונה כלפי מעלה. לשטוף את המחזיק באמצעות 100 microliters של מים מזוקקים deionized, ואחריו שתי 100 שטיפות microliter של 0.22 מיקרון מסונן חיץ הדמיה גרעינים. עם שטיפות נעשה, למלא את התא עם 100 microliters של מאגר הדמיה נוקלאואז, שקוע את הקצה.כוונן את המיקום cantilever עד שהוא נפגע עם הלייזר. לאחר מכן, לשטוף את נציץ APS חמש פעמים עם מאגר הדמיה נוקלאוזום מסונן, באמצעות ארבעה microliters לכל שטיפה. לדלל מיקרוליטר אחד של מלאי הרכבה נוקלאואז לתוך 250 microliters של מאגר הדמיה נוקליאום מסונן עבור ריכוז גרעין סופי של ננו-מולר אחד.הפקד 2.5 microliters של דילול זה על פני השטח ולתת לו לשבת במשך שתי דקות. יש לשטוף את פני השטח פעמיים בארבעה מיקרוליטרים של חיץ הדמיה גרעיני כדי להימנע מצפיפות יתר. לאחר שטיפה הסופית, להשאיר את פני השטח מכוסים במאגר הדמיה.הגדר את הסורק והדגימה מעל מחזיק הקצה כך שהדגימה תעמוד עם הפנים כלפי מטה. כדי להתחיל את הגישה, השתמש בפונקציית הגישה האוטומטית עם משרעת נקודתית קרובה משרעת תנודות חינם. התאם את נקודת הסט עד למעקב אחר פני השטח.לאחר מכן, הגדר את אזור התמונה סביב 150 על ידי 150 ננומטר ל 200 על ידי 200 ננומטר עם קצב רכישת נתונים של סביב 300 אלפיות שנייה לכל מסגרת הדמיה. כפקד להרכבה ותצהיר, מונונוקלאומים H3 הוכנו ודמיין באמצעות AFM סטטי. תמונה זו מספקת תמונת מצב של אוכלוסיית הגרעין כפי שהייתה קיימת רגעים לפני התצהיר המאשר כי nucelosomes הורכבו בהצלחה.עם הרכבת הבקרה H3 הצלחה, השיטות שהוצגו יושם הבא על המחקר של נוקלאוזומים CENP-A. הדמיית AFM סטטית של מדגם זה חשפה שהרכבתה הייתה הצלחה. מתוך תמונות AFM סטטיות, ניתן לאפיין את הגובה והתהפכות של מונונוקלאוזומים.הן הזווית בין זרועות הדנ"א החופשיות והן אורך זרועות הדנ"א החופשיות משמשות לקביעת מספר פניות הדנ"א בגרעין הבודד. לעומת זאת, דימות AFM לשגות זמן של נוקלאוזומים ניתן להשתמש כדי לדמיין את ההתנהגות הכוללת ספונטנית unwrapping של נוקלאוזומים. ככל שמספר התור של הנוקלאומוזום פוחת, נצפית גם ירידה מקבילה בנפח הליבה של הגרעין.בנוסף להדמיה לשגות זמן רגילה, ניתן להשתמש במהירות גבוהה לשגות AFM כדי לחקור את הדינמיקה נוקליאום מורכב יותר כי הוא החמיץ באמצעות הדמיה זמן לשגות זמן סטנדרטי. היכולת של טכניקה זו ללכוד את הדינמיקה על פני תקופה ארוכה של זמן היה חיוני להדמיה של טרנסלוקציה למרחקים ארוכים של ליבת גרעין CENP-A, אשר נתפס במהלך 1200 מסגרות. טכניקה זו הייתה גם קריטית בלכידת ההעברה הנדירה של ליבת גרעין CENP-A ממצע דנ"א אחד לאחר.קצב לכידת התמונה המהיר הפך את ההדמיה של אירוע דינמי זה לאפשרית מכיוון שנדרשו רק מספר מסגרות להשלמתו. בתחום הכרומטין הרחב יש קבוצה של שאלות חשובות הנוגעות לתפקידי היסטונים של ליגר והגדלת היסטון של דינמיקת הכרומטין. כל השאלות האלה ניתן לענות באמצעות הטכניקה שלנו.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biochemistry

Unit 1

Diagnostic Imaging Techniques

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

חקירת חלבון רצף-מבנה-דינמיקה יחסים עם Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

מבנה תמיסת Cerulean חלבון פלואורסצנטי באמצעות MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

הדמיה של דינמיקה דיפוזיונית של ננו-ירדס זהב על קרום התא באמצעות מיקרוסקופיה אחת של ננו-חלקיקים בדארקפילד

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...