Name: probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Forfatter bidrag: YLL og MSD utformet for prosjektet. MSD samlet nucleosomes. MSD og ZS utført AFM eksperimenter og data analyser. Alle forfattere skrev og redigeres manuskriptet.

1. kontinuerlig fortynning montering av Mono-nucleosomes
<ol><li>Generere og rense en ca 400 bp DNA substrat som inneholder en off-sentrert Widom 601 nucleosome posisjonering sekvens. 55 Merk: For å begrense uønsket dannelsen av di-nucleosomes, hver arm flankert posisjonering sekvensen bør ikke overstige ~ 150 bp.<ol>
<li>Bruk plasmider pGEM3Z-601 sammen med designet primerne og forsterke substrat DNA bruker PCR. 423 bp underlaget med 122 og 154 bp lengder brukt her, bruke frem (5'-CAGTGAA...

Protokollen beskrevet ovenfor er ganske enkel og gir svært reproduserbar resultater, men noen viktige saker kan vektlegges. Functionalized APS-glimmer er et viktig medium for å få pålitelige og reproduserbar. En høy stabilitet av APS-glimmer er en av de viktigste funksjonene i dette underlaget som tillater en å forberede tenkelig underlaget på forhånd for bruk som kan brukes i minst to uker etter forberedes. 59 , 61 imidlertid overflaten kan bli skadet av...

I eukaryote celler er DNA svært komprimert og organisert i kromosomer. 1 det første nivået av DNA organisasjonen i et kromosom er samlingen av nucleosomes i hvilke 147 bp DNA er tett pakket rundt en histone octamer kjerne. 2 , 3 nucleosome partikler montere på en lang DNA-molekyl som danner en chromatin matrise som er så organisert til en svært kompakt kromosom enhet er dannet. 4 demontering av chromatin gir tilgang til gratis DNA kreves av kritiske cellulære prosesser som gene transkripsjon og genom replikering, antyder at chromatin er et svært dynamisk system. 5 , 6 , 7 forstå de dynamiske egenskapene til DNA på ulike chromatin nivåer er kritisk viktig for Klargjørende genetisk prosesser på molekylært nivå hvor feil kan føre til celledød eller utvikling av sykdommer som kreft. 8 chromatin egenskap av stor betydning er dynamikken i nucleosomes. 9 , 10 , 11 , 12 høy stabilitet disse partiklene er tillatt for strukturelle karakterisering av krystallografisk teknikker. 2 hva disse studier mangel er dynamisk detaljer om nucleosomes som mekanismen av DNA pakke dem ut fra histone kjernen; dynamisk veien som kreves for transkripsjon og replikering. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 videre spesielle proteiner kalt remodeling faktorer har blitt vist å lette demontering av nucleosomal partikler17; iboende dynamikken i nucleosomes er imidlertid den avgjørende faktoren i denne prosessen som bidrar til hele demontering prosessen. 14 , 16 , 18 , 19
Single-molekylet teknikker som enkelt-molekylet fluorescens19,20,21og optisk overlapping (pinsett)13,18,22,23 AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 har vært medvirkende i å forstå dynamikken i nucleosomes. Blant disse metodene, AFM har flere enestående og attraktiv funksjoner. AFM gjør det mulig å visualisere og karakterisere personlige nucleosomes samt de lengre matriser27. Fra AFM bilder, kan viktige egenskaper av nucleosome struktur som DNA pakket rundt histone kjernen være målt 10,14,26,28; en parameter som er sentrale for karakterisering av nucleosome unwrapping dynamics. Forbi AFM har undersøkelser avdekket nucleosomes svært dynamiske systemer og at DNA kan spontant pakke fra histone kjernen14. Den spontane pakke dem ut av DNA fra nucleosomes ble direkte visualisert ved AFM opererer i time-lapse modus når avbilding gjøres i vandige løsninger 14,26,29.
Ankomsten av høyhastighets time-lapse AFM (HS-AFM) instrumentering gjort det mulig å visualisere nucleosome unwrapping prosessen på millisekund tidsskala 14,15,24. HS-AFM 16,30 studier av centromere bestemte nucleosomes avdekket flere nye funksjoner i nucleosomes sammenlignet med den kanoniske typen. Centromere nucleosomes utgjør av en centromere, en liten del av kromosomet kritisk viktig for kromosom segregering31. I motsetning til kanoniske nucleosomes i bulk chromatin inneholder histone kjernen i centromere nucleosomes CENP-A histone i stedet for histone H332,33. Som følge av denne histone substitusjon, DNA innpakning i centromere nucleosomes er ~ 120 bp i stedet for ~ 147 bp for kanoniske nucleosomes; en forskjell som kan føre til forskjellige morphologies av centromere og Kanonisk nucleosomes matriser34, antyder at centromere chromatin gjennomgår høyere dynamics sammenlignet med meste ett. Romanen dynamikken vises ved centromere nucleosomes i HS-AFM16,30 studier eksemplifiserer den unike muligheten av denne single-molekylet teknikken direkte visualisere egenskapene strukturelle og dynamisk nucleosomes. Eksempler på disse funksjonene er kort beskrevet og illustrert på slutten av papiret. Denne utviklingen ble gjort utbygging av romanen protokoller for AFM avbildning av nucleosomes, samt modifikasjoner av eksisterende metoder. Målet med protokollen beskrevet her er å gjøre disse spennende fremskritt i enkelt-molekylet AFM nucleosome studier tilgjengelig for alle som ønsker å benytte disse teknikkene i sine chromatin undersøkelser. Mange av teknikkene gjelder for problemer utenfor studiet av nucleosomes og kan brukes til undersøkelser av andre protein og DNA systemer rundt. Noen eksempler på slike programmer finnes i publikasjoner35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 og utsikter til AFM studier av ulike biomolecular systemer er gitt i av29,50,51,53,54.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1229px;" width="1229">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmid pGEM3Z-601</td>
			<td style="width:327px;">Addgene, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:119px;">26656</td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR Primers</td>
			<td style="width:327px;">IDT, Coralville, IA</td>
			<td style="width:119px;">Custom Order</td>
			<td>(FP) 5&#39;- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3&#39; (RP) 5&#39;-ACAGCTATGACCATGATTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DreamTaq polymerase</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">EP0701</td>
			<td>Catalog number for 200 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:327px;">Qiagen, Hilden, Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td>Catalog number for 50 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tris base</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td>Catalog number for 250 g</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">EDTA</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15576028</td>
			<td>Catalog number for 500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">(CENP-A/H4)2, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0010</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H2A/H2B, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">15-0311</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H3 Octamer, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0001</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">69574</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">S9888-500G</td>
			<td>Catalog number for 500 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Amicon Ultra-0.5&#160;mL Centrifugal Filters&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Millipore-sigma, Burlington, MO</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td>Catalog number for 8 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HCl</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>258148-25ML</td>
			<td>Catalog number for 25 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tricine</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T0377-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">SDS</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">11667289001</td>
			<td>Catalog number for 1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ammonium Persulfate (AmmPS)&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610700</td>
			<td>Catalog number for 10 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td>Catalog number for 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TEMED</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610800</td>
			<td>Catalog number for 5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610747</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">2-ME</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M6250-10ML</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">ageRuler Prestained Protein Ladder&#160;</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td>Catalog number for 500 uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bio-Safe&#8482; Coomassie Stain</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610786</td>
			<td>Catalog number for 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth&#160;</td>
			<td style="width:327px;">TexWipe, Kernersvile, NC</td>
			<td style="width:119px;">TX604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Muscovite Block Mica</td>
			<td style="width:327px;">AshevilleMica, Newport News, VA</td>
			<td style="width:119px;">Grade-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aminopropyl silatrane (APS)</td>
			<td style="width:327px;">Synthesized as described in 22</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HEPES</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">H4034-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scotch Tape</td>
			<td style="width:327px;">Scotch-3M, St. Paul, MN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TESPA-V2 afm probe (for static imaging)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aron Alpha Industrial Krazy Glue</td>
			<td style="width:327px;">Toagosei America, West Jefferson, OH</td>
			<td style="width:119px;">AA480</td>
			<td>Catalog number for 2 g tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MgCl2</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M8266-100G</td>
			<td>Catalog number for 100 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Millex-GP Filter, 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">SLGP05010</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)</td>
			<td style="width:327px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FG-3020C-20&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FS-1010S135-0.5&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MultiMode Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy</td>
			<td style="width:327px;">Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging

Chromatin, som er en lang kjede av nucleosome underenheter, er et dynamisk system som gjør at for slike kritiske prosesser som utryddelse og transkripsjon ta sted i eukaryote celler. Dynamikken i nucleosomes gir tilgang til DNA ved replikering og transkripsjon machineries og bidrar kritisk til molekylære mekanismer underliggende chromatin funksjoner. Single-molekylet studier som atomic force mikroskopi (AFM) imaging har bidratt betydelig til vår nåværende forståelse av rollen som nucleosome strukturen og dynamikken. Gjeldende protokollen beskriver trinnene slik at høyoppløselig AFM Bildeteknikker å studere strukturelle og dynamiske egenskapene til nucleosomes. Protokollen er illustrert av AFM data innhentet for centromere nucleosomes der H3 histone er erstattet med sin motpart centromere protein (CENP-A). Protokollen starter med montering av mono-nucleosomes bruker en kontinuerlig fortynning metoden. Utarbeidelse av glimmer underlaget functionalized med aminopropyl silatrane (APS-glimmer) som brukes for nucleosome avbilding er avgjørende for den AFM visualiseringen av nucleosomes beskrevet og prosedyren for å forberede underlaget er tilgjengelig. Nucleosomes satt på APS-glimmer overflaten er først fotografert med statisk AFM, som fanger et øyeblikksbilde av befolkningen nucleosome. Slike parametre som størrelsen på DNA pakket rundt nucleosomes kan måles fra analyser av disse bildene, og denne prosessen er også beskrevet. Time-lapse AFM imaging prosedyre i væsken er beskrevet for høyhastighets time-lapse AFM som kan ta flere bilder av nucleosome dynamics per sekund. Endelig er analyse av nucleosome dynamics aktivere kvantitative karakterisering av dynamisk prosessene beskrevet og illustrert.

Mono-nucleosomes ble først forberedt på AFM imaging eksperimenter ved hjelp av en kontinuerlig fortynning montering metode (figur 1). De forberedt nucleosomes ble deretter kontrollert usammenhengende SDS-siden (figur 2). En glimmer overflate ble neste functionalized bruker APS, som fanger opp nucleosomes på overflaten samtidig opprettholde en jevn bakgrunn for høyoppløselig imaging (Figur 3). Nucleosomes ble avsatt på APS-glim...

Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Her presenterer vi en protokoll for å karakterisere nucleosome partikler på enkelt-molekylet nivå bruker statisk og time-lapse atomic force mikroskopi (AFM) imaging teknikker. Overflate functionalization metoden beskrevet tillater for fangst av strukturen og dynamikken i nucleosomes i høy oppløsning på nanoskala.

Verifiserer strukturen og dynamikken i Nucleosomes med Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Denne protokollen benytter alle viktige funksjoner i AFM, ikke-mottagelig for andre enkeltmolekylteknikker. Som et resultat er vi i stand til å løse strukturen av nukleosom på nanoskala. Viktigere, direkte visualisering av nukleosomer ble gjort ved fysiologiske forhold.Ved hjelp av vår AFM-teknikk har vi nylig avslørt unike egenskaper til centromere-nukleosomet som kan spille en rolle på funksjonen til hele centromere. Metoden som skal vises brukes for tiden i laboratoriet vårt for å undersøke selvmontering av proteiner forbundet med dannelse av amyloid aggregater. Disse proteinaggregatene utløser utviklingen av ødeleggende sykdommer som Alzheimers og Parkinsons for å nevne noen.De enkle tilberedningsmetodene gjelder også for andre protein-DNA-komplekser, inkludert store systemer som DNA-replikeringsmaskiner. Selv om noen modifikasjoner er nødvendig. For å karakterisere nukleosompartikler på enkeltmolekylnivå ved hjelp av statisk og tidsforløp atomkraftmikroskopi, begynn med å rense, montere og validere nukleosomer som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen.Deretter klargjør glimmeroverflaten for statisk AFM-avbildning. For å gjøre dette, først forberede en femti millimolar APS lagerløsning i deionisert vann. Lagre en milliliter aliquots av denne løsningen på fire grader Celsius, til det er nødvendig.Fra lagerløsningen, lag en fungerende APS-løsning for mica-modifikasjon ved å oppløse 50 mikroliter av de 50 mikromosaps-bestanden i 15 milliliter destillert deionisert vann. Bland oppløsningen og fyll deretter en cuvette med løsningen. Deretter kuttes en etter tre centimeter strimler av glimmer fra høykvalitets glimmer ark.Kontroller at stykket passer når det plasseres diagonalt i en cuvette. Deretter cleave lag av glimmeren til begge sider er nyklyst, og stykket er så tynt som 0, 1 millimeter. Plasser umiddelbart glimmerstykket i APS fylt cuvette og inkubere glimmeren i 30 minutter.Overfør glimmerstykket til en cuvette fylt med deionisert deionisert vann og suge det i 30 sekunder. Deretter bruker argon til å tørke begge sider av APS glimmerstripen helt. Påfør dobbel ansikt tape på flere magnetiske pucker og plasser dem til siden.Deretter kutter APS-glimmersubstratet til en centimeter med en centimeter firkanter, og dekker dem i en ren petriskål. Deretter forbereder du tre fortynninger av de monterte nukleosomer ved hjelp av en 0,22 mikron filtrert buffer som inneholder 10 millimolar hepes og fire millimolar magnesiumklorid ved en PH på 7,5. For å begrense tapet av nukleosomer, ved lav endelig konsentrasjon, bør fortynningen gjøres en om gangen, umiddelbart før deponering på APS-glimmeren.Deponer fem til 10 mikroliter av hver nukleosomprøve i midten av et APS-glimmerstykke og la dem inkubere i to minutter. Skyll deretter prøven forsiktig med to til tre milliliter destillert deionisert vann for å fjerne bufferkomponentene. Og tørk den avsede prøven under en lett strøm av argon.For å begynne, monter en spiss på tuppholderen for AFM-oppsettet. Monter deretter den første prøven på AFM-fasen, og vær forsiktig så du ikke kontakter prøveoverflaten. Plasser laseren over cantilever til summen er på det maksimale og juster de vertikale og laterale nedbøyningsverdiene til nær null.Deretter stiller du inn AFM-sonden for å finne resonansfrekvensen, justerer drivalituden og setter bildestørrelsen til 100 med 100 nanometer. Når du er konfigurert, klikker du på engasjereknappen for å starte tilnærmingen. Når tilnærmingen er fullført, optimaliserer du gradvis amplitudsettpunktet til overflaten av prøven er tydelig sett.Deretter øker du skannestørrelsen til ett mikron med ett mikron og oppløsningen til 512 med 512 piksler. Til slutt klikker du på opptaksknappen for å starte bildeanskaffelse. Bruk glassstangskannerlim til å feste en glassstang til AFM-skannerstadiet.La dette tørke i minst 10 minutter. I mellomtiden, gjør 0,1 millimeter tykke sirkulære biter av glimmer med en 1,5 millimeter diameter ved å slå dem fra et større glimmerark. Bruk høyhastighets AFM glimmerglasslim til å feste dette glimmerstykket til glassstangen på høyhastighets AFM, og la det forbli uberørt i minst 10 minutter mens det tørker.Deretter cleave lag fra glimmer ved hjelp av et trykkfølsom tape til et godt spaltet lag er sett på båndet. Deretter fortynner du en mikroliter på 50 millimolar APS-lager i 99 mikroliter destillert deionisert vann for å lage en 500 mikromosAPS-løsning. Deponer 2,5 mikroliter av løsningen på den nyklikkede glimmeroverflaten og la overflaten fungere i 30 minutter.Etter inkubasjonen, skyll glimmeren flere ganger med destillert deionisert vann ved å påføre tre mikroliter skyll. Fjern vannet helt etter hver skylling ved å plassere en ikke-vevd klut på kanten av glimmeren. Etter den siste skyllingen legger du tre mikroliter destillert deionisert vann på overflaten, og la det sitte i minst fem minutter for å fjerne eventuelle ikke-spesifikt bundne APS.Plasser deretter sonden i afm-holderen med høy hastighet, og plasser holderen på AFM-scenen med spissen vendt opp. Skyll holderen med 100 mikroliter destillert deionisert vann, etterfulgt av to 100 mikroliters skyll på 0,22 mikronfiltrert nukleosom bildebuffer. Når skyllene er gjort, fyll kammeret med 100 mikroliter nukleosom bildebuffer, senk spissen.Juster cantilever-posisjonen til den treffer med laseren. Skyll deretter APS-glimmeren fem ganger med filtrert nukleosom bildebuffer, ved hjelp av fire mikroliter per skylling. Fortynn en mikroliter av nukleosomenheten i 250 mikroliter filtrert nukleosom bildebuffer for en endelig nukleosom konsentrasjon av en nanomolar.Deponer 2,5 mikroliter av denne fortynningen på overflaten og la den sitte i to minutter. Skyll overflaten to ganger med fire mikroliter nukleosom bildebuffer for å unngå over trengsel. Etter den siste skyllingen, la overflaten være dekket av bildebuffer.Still skanneren og prøven oppå tuppholderen slik at prøven er med forsiden ned. For å begynne tilnærmingen, bruk auto tilnærmingsfunksjonen med set point amplitude nær den frie svingningsalitlituden. Juster innstillingspunktet til overflaten spores godt.Deretter setter du bildeområdet rundt 150 med 150 nanometer til 200 med 200 nanometer med datainnsamlingshastighet på rundt 300 millisekunder per bilderamme. Som en kontroll for montering og deponering ble H3 mononukleosomer forberedt og avbildet ved hjelp av statisk AFM. Dette bildet gir et øyeblikksbilde av den nukleosompopulasjonen som det eksisterte øyeblikk før deponering som bekrefter at nucelosomer ble montert.Med H3 kontrollmontering en suksess, ble de presenterte metodene neste brukt på studien av CENP-A nukleosomer. Statisk AFM-avbildning av denne prøven avslørte at samlingen var en suksess. Fra de statiske AFM-bildene kan høyden og dreietallet mononukleosomer karakteriseres.Både vinkelen mellom de frie DNA-armene og lengden på de frie DNA-armene brukes til å bestemme antall DNA-svinger i den enkelte nukleosom. I motsetning kan tidsforløpende AFM-avbildning av nukleosomer brukes til å visualisere den generelle spontane utkopningsoppførselen til nukleosomer. Etter hvert som kjernetallet reduseres, observeres også en tilsvarende reduksjon i kjernevolumet.I tillegg til regelmessig tidsforløp kan høyhastighetstid forfalle AFM brukes til å sondere den mer intrikate nukleosomdynamikken som ikke går glipp av ved hjelp av bildebehandling av normal tid. Evnen til denne teknikken for å fange dynamikken over en lang periode var avgjørende for visualiseringen av en langdistansetranslokasjon av en CENP-A nukleosom kjerne, som ble fanget i løpet av 1200 rammer. Denne teknikken var også avgjørende for å fange den sjeldne overføringen av en CENP-A nukleosomkjerne fra ett DNA-substrat til et annet.Den raske bildeopptakshastigheten gjorde visualisering av denne dynamiske hendelsen mulig, da det bare tok flere rammer å fullføre. I det brede kromatinfeltet er det et sett med viktige spørsmål knyttet til rollene til liger histoner og histoneforstørrelse av kromatindynamikken. Alle disse spørsmålene kan besvares ved hjelp av vår teknikk.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biochemistry

Unit 1

Diagnostic Imaging Techniques

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Undersøkelse av protein-sekvens-struktur-dynamikk Relasjoner med Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Tvinge spektroskopi enkelt Protein molekyler med en Atomic Force mikroskopet

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse av β-Amyloid-indusert unormalt Fibrin Clot struktur av spektroskopi og skanning elektronmikroskop

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Strukturen løsning av fluorescerende Protein Cerulean bruker MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imaging av ekstracellulære blemmer av Atomic Force mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-cell reseptor Dynamics firedimensjonalt ved hjelp av gitter lysark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriserer individuelle protein aggregater av infrarød Nanospectroscopy og Atomic Force mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produksjon av Dynein og Kinesin motor ensembler på DNA Origami nanostrukturer for single molekyl observasjon

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisere diffus dynamikk av gull nanorods på cellemembran ved hjelp av enkelt nanopartikkel Darkfield mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...