Name: probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Автор взносы: ГУС и MSD разработал проект; MSD собрал нуклеосом. MSD и ZS исполнили AFM экспериментов и анализа данных. Все авторы писали и редактировать рукописи.

1. непрерывное разбавление Ассамблеи моно нуклеосом
<ol><li>Создавать и очистить примерно 400 субстрат ДНК bp, содержащий вне центру видом 601 нуклеосома позиционирования последовательности. 55 Примечание: Чтобы ограничить нежелательные формирования ди нуклеосом, каждый «рука...

Протокол, в описанный выше довольно прост и обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, хотя можно отметить несколько важных вопросов. Функционализированных APS-слюда является ключевым субстрат для получения надежных и воспроизводимых результатов. Высокая стабильность APS-слю...

В эукариотических клетках ДНК сильно уплотняется и организованы в хромосомы. 1 первый уровень ДНК Организации в пределах хромосомы является Ассамблея нуклеосом в которых 147 bp ДНК плотно обернутые вокруг гистона octamer ядро. 2 , 3 нуклеосома частицы собираются на длинные молекулы ДНК, образуя хроматина массив, который затем проводится до тех пор, пока блок весьма компактный Хромосома образуется. 4 Разборка хроматина обеспечивает доступ к свободной ДНК требует критического клеточных процессов, например ген транскрипции и генома репликации, предполагая, что хроматина является весьма динамичная система. 5 , 6 , 7 понимание динамических свойств ДНК на различных уровнях хроматина является критически важным для выяснения генетических процессов на молекулярном уровне, где ошибки могут привести к смерти клетки или развитие таких заболеваний, как рак. 8 хроматина свойство большое значение является Динамика нуклеосом. 9 , 10 , 11 , 12 структурных характеристик кристаллографических методами позволило высокой стабильности этих частиц. 2 какие эти отсутствие исследования являются динамические детали нуклеосом как механизм ДНК развертки от гистона ядра; динамичный путь которого необходим для процессов транскрипции и репликации. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 Кроме того, специальные белки, называют ремоделирования факторов было показано для облегчения разборки nucleosomal частиц17; Однако встроенные динамики нуклеосом является критическим фактором в этом процессе, который способствует процессу всей разборки. 14 , 16 , 18 , 19
Одноместный молекула методы, такие как сингл молекула флуоресценции19,20,21, оптических треппинга (пинцет)13,18,,2223 и AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 сыграли важную роль в понимании динамики нуклеосом. Среди этих методов AFM выгоды от нескольких уникальных и привлекательных особенностей. АСМ позволяет визуализировать и характеризуют отдельные нуклеосом, а также более массивы27. От АСМ изображения важные характеристики нуклеосома структуры, такие как длина ДНК, обернутые вокруг гистона ядро может быть измеренной 10,14,,2628; параметр, который является центральным для характеризации нуклеосома распаковки динамики. В прошлом AFM исследования показали нуклеосом высокодинамичных систем и что ДНК может спонтанно развернуть ядро гистона14. Спонтанное разверток ДНК от нуклеосом непосредственно визуализированное AFM, работающих в режиме покадровой, когда изображения делается в водных растворах 14,26,29.
Появление высокоскоростной покадровой инструментария AFM (HS-AFM) сделало возможным для визуализации процесса распаковки нуклеосома миллисекунды шкалы времени 14,15,24. Недавние исследования30 16,HS-AFM центромер конкретных нуклеосом показали несколько новизну нуклеосом, по сравнению с типом канонической. Центромер нуклеосом составляют центромер, небольшая часть критически важное значение для хромосома сегрегации31хромосомы. В отличие от канонических нуклеосом в массовых хроматина гистонов ядро центромер нуклеосом содержит гистона CENP-A вместо гистонов H332,33. В результате этой замены гистон, перенос ДНК в центромер нуклеосом составляет ~ 120 bp вместо ~ 147 bp для канонических нуклеосом; разница, которая может привести к собственный морфологии центромер и канонические нуклеосом массивов34, предполагая, что центромер хроматина проходит выше динамика, по сравнению с навалом, один. Роман динамика, проявленную центромер нуклеосом в HS-AFM16,30 исследования иллюстрируют уникальную возможность непосредственно визуализировать структурных и динамических свойств предоставляемый этот сингл молекула техника нуклеосом. Примеры этих функций будут кратко обсуждены и иллюстрированные в конце документа. Этот прогресс был достигнут благодаря разработке новых протоколов для AFM изображений нуклеосом, а также изменения существующих методов. Цель Протокола, описанные здесь, чтобы этих захватывающих достижений в одной молекулы AFM нуклеосома исследования доступны для всех, кто хотел бы использовать эти методы в своих расследованиях хроматина. Многие из методов, описанных применимы к проблем за изучение нуклеосом и может использоваться для исследования других белков и ДНК систем, представляющих интерес. Несколько примеров таких приложений можно найти в публикации35,36,37,,3839,40,41, 42,,4344,45,46,47,,4849 и перспективы исследований AFM приводятся различные биомолекулярных систем в обзоры29,50,51,,5354.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1229px;" width="1229">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmid pGEM3Z-601</td>
			<td style="width:327px;">Addgene, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:119px;">26656</td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR Primers</td>
			<td style="width:327px;">IDT, Coralville, IA</td>
			<td style="width:119px;">Custom Order</td>
			<td>(FP) 5&#39;- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3&#39; (RP) 5&#39;-ACAGCTATGACCATGATTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DreamTaq polymerase</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">EP0701</td>
			<td>Catalog number for 200 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:327px;">Qiagen, Hilden, Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td>Catalog number for 50 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tris base</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td>Catalog number for 250 g</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">EDTA</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15576028</td>
			<td>Catalog number for 500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">(CENP-A/H4)2, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0010</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H2A/H2B, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">15-0311</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H3 Octamer, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0001</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">69574</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">S9888-500G</td>
			<td>Catalog number for 500 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Amicon Ultra-0.5&#160;mL Centrifugal Filters&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Millipore-sigma, Burlington, MO</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td>Catalog number for 8 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HCl</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>258148-25ML</td>
			<td>Catalog number for 25 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tricine</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T0377-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">SDS</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">11667289001</td>
			<td>Catalog number for 1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ammonium Persulfate (AmmPS)&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610700</td>
			<td>Catalog number for 10 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td>Catalog number for 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TEMED</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610800</td>
			<td>Catalog number for 5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610747</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">2-ME</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M6250-10ML</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">ageRuler Prestained Protein Ladder&#160;</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td>Catalog number for 500 uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bio-Safe&#8482; Coomassie Stain</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610786</td>
			<td>Catalog number for 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth&#160;</td>
			<td style="width:327px;">TexWipe, Kernersvile, NC</td>
			<td style="width:119px;">TX604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Muscovite Block Mica</td>
			<td style="width:327px;">AshevilleMica, Newport News, VA</td>
			<td style="width:119px;">Grade-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aminopropyl silatrane (APS)</td>
			<td style="width:327px;">Synthesized as described in 22</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HEPES</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">H4034-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scotch Tape</td>
			<td style="width:327px;">Scotch-3M, St. Paul, MN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TESPA-V2 afm probe (for static imaging)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aron Alpha Industrial Krazy Glue</td>
			<td style="width:327px;">Toagosei America, West Jefferson, OH</td>
			<td style="width:119px;">AA480</td>
			<td>Catalog number for 2 g tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MgCl2</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M8266-100G</td>
			<td>Catalog number for 100 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Millex-GP Filter, 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">SLGP05010</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)</td>
			<td style="width:327px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FG-3020C-20&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FS-1010S135-0.5&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MultiMode Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy</td>
			<td style="width:327px;">Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging

Хроматина, который является длинная цепь нуклеосома субблоков, является динамической системы, что позволяет для таких критических процессов репликации ДНК и транскрипции занять место в эукариотических клеток. Динамика нуклеосом предоставляет доступ к ДНК, механизмы репликации и транскрипции и критически способствует молекулярных механизмов, лежащих в основе функции хроматина. Сингл молекулярных исследований, таких как атомно-силовой микроскопии (АСМ) изображений значительно способствовали нашего нынешнего понимания роли нуклеосома структуры и динамики. Текущий протокол описывает шаги, позволяя разрешением AFM методы визуализации для изучения структурных и динамических свойств нуклеосом. Протокол иллюстрируется AFM данные, полученные для центромер нуклеосом, в которых гистонов H3 заменяется его коллегой центромер белков (CENP-A). Протокол начинается с Ассамблеей моно нуклеосом методом непрерывного разбавления. Подготовка подложки слюды, функционализированных с аминопропил silatrane (APS-слюда), которая используется для визуализации нуклеосома имеет решающее значение для AFM визуализации нуклеосом описал и процедура для подготовки субстрата. Нуклеосом на хранение на поверхности APS-слюда сначала отражаются с помощью статических AFM, который захватывает снимок населения нуклеосома. Из анализа этих изображений такие параметры, как размер ДНК, обернутые вокруг нуклеосом может быть измерена, и этот процесс также подробно. Покадровой AFM изображений процедура в жидкости описан для высокоскоростной покадровой AFM, которые могут захватить несколько кадров нуклеосома динамики в секунду. Наконец анализ динамики нуклеосома включение количественной характеристики динамических процессов описаны и проиллюстрированы.

Моно нуклеосом были впервые подготовлены для AFM изображений эксперименты с использованием метода Ассамблеи непрерывной разрежения (рис. 1). Подготовленные нуклеосом затем были проверены с использованием разрывных SDS-PAGE (рис. 2). Слюда поверхность была сле...

Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Здесь мы представляем протокол характеризовать нуклеосома частиц на уровне одной молекулы, используя статические и time-lapse атомно-силовой микроскопии (АСМ) методы визуализации. Функционализация поверхности метод, описанный позволяет для захвата структуры и динамики нуклеосом в с высоким разрешением на наноуровне.

Проверка структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии изображений

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Этот протокол использует все основные особенности AFM, не податные другим методам одной молекулы. В результате мы можем разрешить структуру нуклеосомы в наномасштабе. Важно отметить, что прямая визуализация нуклеосом была сделана в физиологических условиях.Используя нашу технику AFM, мы недавно выявили уникальные свойства центромерной нуклеосомы, которые могут играть определенную роль в функции всего центромера. Метод, который будет показан в настоящее время применяется в нашей лаборатории для исследования самосборки белков, связанных с образованием амилоидных агрегатов. Эти белковые агрегаты вызывают развитие разрушительных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, чтобы назвать несколько.Простые методы подготовки применимы и к другим белково-ДНК-комплексам, включая крупные системы, такие как механизм репликации ДНК. Хотя некоторые изменения необходимы. Для того, чтобы охарактеризовать нуклеосомные частицы на уровне одной молекулы с помощью статической и замедленной атомной микроскопии силы, начните с очистки, сборки и проверки нуклеосом, описанных в сопроводительном текстовом протоколе.Затем подготовь поверхность слюды для статического изображения AFM. Для этого сначала подготовь пятьдесят миллимолярдов APS фондового раствора в деионизированной воде. Храните один миллилитр aliquots этого решения при четырех градусах по Цельсию, пока это не необходимо.Из фондового раствора подготовьй рабочий раствор APS для модификации слюды, растворив 50 микролитров 50 микромоляных АПС в 15 миллилитров дистионизированной воды. Смешайте раствор, а затем заполнить cuvette с раствором. Далее вырежьте одну на три сантиметра полоски слюды из высококачественных листов слюды.Убедитесь, что кусок подходит при размещении по диагонали в кювет. Затем расщепляются слои слюды до тех пор, пока обе стороны не будут свежевыжаты, а кусок тонкий, как 0,1 миллиметра. Немедленно поместите кусок слюды в заполненный APS кюветт и инкубировать слюду в течение 30 минут.Перенесите кусочек слюды в кюветт, наполненный дистиллированной деионизированной водой, и замочите его в течение 30 секунд. Затем используйте аргон, чтобы полностью высушить обе стороны полосы Слюды APS. Нанесите двойную клейкую ленту на несколько магнитных шайб и поместите их в сторону.Затем разрежьте субстрат APS mica до одного сантиметра на один сантиметр квадрата и накройте их чистой чашкой Петри. Затем приготовьте три разбавления собранных нуклеосом с помощью фильтрованного буфера 0,22 микрона, содержащего 10 миллимолярновых гепов и четыре миллимолярных хлорида магния при PH 7,5. Чтобы ограничить потерю нуклеосом, при низкой конечной концентрации, разбавление должно быть сделано по одному, непосредственно перед осаждением на слюде APS.Депозит от пяти до 10 микролитров каждого нуклеосомы образца в центре части Mica APS и пусть инкубировать в течение двух минут. Затем аккуратно промойте образец двумя-тремя миллилитров дистиллированной деионизированной воды для удаления буферных компонентов. И высушить отложенный образец под легким потоком аргона.Для начала смонтировать наконечник на кончике держателя установки AFM. Затем смонтировать первый образец на сцене AFM, будьте осторожны, чтобы не связаться с поверхностью образца. Распоить лазер над кантилевером до тех пор, пока его сумма не будет на максимуме, и отрегулируйте вертикальные и боковое значения отклонения почти до нуля.Затем настройте зонд AFM, чтобы найти его резонансную частоту, отрегулируйте амплитуду привода и установите размер изображения до 100 на 100 нанометров. После настройки нажмите кнопку engage, чтобы начать подход. Когда подход будет завершен, постепенно оптимизируйте точку амплитуды до тех пор, пока поверхность образца не будет хорошо видны.Затем увеличьте размер сканирования до одного микрона на один микрон и разрешение до 512 на 512 пикселей. Наконец, нажмите кнопку захвата, чтобы начать захват изображения. Используйте клей сканера стеклянных стержней, чтобы прикрепить стеклянный стержень к этапу сканера AFM.Дайте этому высохнуть в течение как минимум 10 минут. В то же время, сделать 0,1 миллиметра толщиной круглые кусочки слюды с диаметром 1,5 миллиметра, пробивая их из большего листа слюды. Используйте высокоскоростной AFM слюды стеклянный стержень клей, чтобы прикрепить этот кусок слюды на стеклянный стержень на высокой скорости AFM, и позволить ему оставаться нетронутым в течение как минимум 10 минут, пока он высыхает.Затем расщепляйте слои из слюды с помощью чувствительной к давлению ленты до тех пор, пока на ленте не будет виден хорошо расщепленный слой. Затем разбавьте один микролитр из 50 миллимолярной АПС в 99 микролитров дистиллированной деионизированной воды, чтобы сделать 500 микромолярный раствор APS. Депозит 2,5 микролитров раствора на свежевыжатой поверхности слюды и дайте поверхности функционировать в течение 30 минут.После инкубации, промыть слюду несколько раз дистиллированной деионизированной водой, применяя три микролитров полоскания. Удалите воду полностью после каждого полоскания, поместив нетканые салфетки на краю слюды. После окончательного полоскания поместите три микролитера дистиллированной деионизированной воды на поверхность, и дайте ему сидеть в течение как минимум пяти минут, чтобы удалить любые не специально связанные APS.Затем поместите зонд в держатель AFM на высокой скорости и поместите держатель на сцене AFM с наконечником вверх. Промыть держатель с помощью 100 микролитров дистиллированной деионизированной воды, а затем два 100 микролитров полоскания 0,22 микрона фильтруется нуклеосомы изображения буфера. С промывки сделано, заполнить камеру с 100 микролитров нуклеосомы изображения буфера, погружая кончик.Отрегулируйте положение кантилевера до тех пор, пока он не будет поражен лазером. Затем смойте APS mica пять раз с помощью фильтрованного нуклеосомного буфера изображения, используя четыре микролитров на полоскание. Разбавить один микролитер нуклеосомного сборочного запаса в 250 микролитров фильтрованного нуклеосомного буфера изображения для окончательной нуклеосомной концентрации одного наномоляра.Депозит 2,5 микролитров этого разбавления на поверхность и дайте ему сидеть в течение двух минут. Промыть поверхность дважды с четырьмя микролитров нуклеосомы изображения буфера, чтобы избежать более скученной. После окончательного полоскания оставьте поверхность, покрытую буфером изображений.Установите сканер и образец поверх держателя наконечника так, чтобы образец был лицом вниз. Для начала подхода используйте функцию автоматического подхода с амплитудой точки набора, близкой к свободной амплитуде колебаний. Отрегулируйте установленную точку до тех пор, пока поверхность не будет хорошо отслеживаться.Затем установите площадь изображения около 150 на 150 нанометров до 200 на 200 нанометров со скоростью сбора данных около 300 миллисекунд на кадр изображения. В качестве управления для сборки и осаждения, H3 мононуклеозомы были подготовлены и изображены с помощью статических AFM. Это изображение обеспечивает снимок нуклеосомы населения, как она существовала моменты до осаждения, подтверждающие, что nucelosomes были успешно собраны.С успешной сборкой управления H3 представленные методы были затем применены к изучению нуклеосом CENP-A. Статические изображения AFM этого образца показали, что его сборка была успешной. Из статических изображений AFM можно охарактеризовать высоту и число поворотов мононуклеосом.Для определения количества поворотов ДНК в индивидуальной нуклеосоме используется как угол между свободными руками ДНК, так и длина свободных рук ДНК. В отличие от этого, промежуток времени AFM изображения нуклеосомы могут быть использованы для визуализации общего спонтанного разворачивания поведение нуклеосом. По мере уменьшения числа нуклеосомы наблюдается соответствующее уменьшение нуклеосомного объема ядра.В дополнение к обычной визуализации промежуток времени, высокая скорость промежуток времени AFM может быть использован для зондирования более сложной нуклеосомы динамики, которая пропущена с помощью стандартной визуализации промежуток времени. Способность этого метода захвата динамики в течение длительного периода времени была необходима для визуализации дальнего транслокации нуклеосомного ядра CENP-A, которое было захвачено в течение 1200 кадров. Этот метод также имеет решающее значение для захвата редкой передачи нуклеосомного ядра CENP-A из одного субстрата ДНК в другой.Быстрая скорость захвата изображения сделала визуализацию этого динамического события возможной, так как для этого потребовалось всего несколько кадров. В широком поле хроматина есть ряд важных вопросов, связанных с ролями лигерных гистонов и гистонового увеличения хроматиновой динамики. На все эти вопросы можно ответить с помощью нашей техники.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biochemistry

Unit 1

Diagnostic Imaging Techniques

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Исследование последовательности протеинов-структуры-динамики Отношения с Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Спектроскопия силы одного белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Анализ отклонений β-амилоид индуцированной фибринового сгустка структуры спектроскопии и растровая электронная микроскопия

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Структура решения Cerulean флуоресцентный белок, используя MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Изображение внеклеточных пузырьков с помощью атомной микроскопии силы

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Визуализация поверхности T-клеточного рецептора динамики четыре-Dimensionally использование решетки светлист микроскопии

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Характеристика индивидуальных белковых агрегатов с помощью инфракрасной наноспектроскопии и микроскопии атомной силы

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Производство динамовских и кинезинских моторных ансамблей на наноструктурах ДНК оригами для наблюдения за одной молекулой

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Визуализация диффузной динамики золотых нанородов на клеточной мембране с помощью одной наночастицы Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...