Name: probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Författare bidrag: YLL och MSD utformade projektet. MSD monterade nucleosomes. MSD och ZS utförs AFM experiment och data analyser. Alla författare skrev och redigerade manuskriptet.

1. kontinuerlig utspädning montering av Mono-nucleosomes
<ol><li>Generera och rena en ungefärligt 400 bp DNA substrat som innehåller en off-centrerad Widom 601 nukleosomens positionering sekvens. 55 Obs: För att begränsa oönskade bildandet av di-nucleosomes, varje 'arm' flankerande positionering sekvensen bör inte överstiga ~ 150 bp.<ol>
<li>Använd plasmiden pGEM3Z-601 tillsammans med designade primers och förstärka substrat DNA med PCR. För 423 bp underlaget med 122 och 154 bp ar...

Protokollet beskrivs ovan är ganska enkelt och ge mycket reproducerbara resultat, även om några viktiga frågor kan understrykas. Functionalized APS-mica är viktiga substrat för att få tillförlitliga och reproducerbara resultat. En hög stabilitet av APS-glimmer är en av de viktigaste inslagen i detta substrat som gör att man kan förbereda imaging underlaget i förväg för användning som kan användas minst två veckor efter förbereds. 59 , 61 dock y...

I eukaryota celler är DNA mycket komprimerad och organiserade i kromosomer. 1 den första nivån av DNA organisation inom en kromosom är montering av nucleosomes i vilka 147 bp DNA är tätt lindade runt en Histon octamer kärna. 2 , 3 nucleosome partiklar montera på en lång DNA-molekyl som bildar en kromatin-matris som organiseras sedan tills en mycket kompakt kromosom enhet bildas. 4 disassemblyen av kromatin ger tillgången till fri DNA som krävs av kritiska cellulära processer såsom gen transkription och arvsmassan replikering, vilket tyder på att kromatin är ett mycket dynamiskt system. 5 , 6 , 7 förstå de dynamiska egenskaperna hos DNA på olika kromatin nivåer är kritiskt viktigt klarlägga genetiska processer på molekylär nivå där misstag kan leda till celldöd eller utvecklingen av sjukdomar som cancer. 8 en kromatin egenskap av stor betydelse är dynamiken i nucleosomes. 9 , 10 , 11 , 12 hög stabilitet av dessa partiklar har möjliggjort strukturella karakterisering av kristallografiska tekniker. 2 vad dessa studier saknas är de dynamiska detaljerna för nucleosomes såsom mekanismen för DNA uppackning från Histon kärnan; den dynamiska vägen som krävs för transkription och replikering processer. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 vidare särskilda proteiner kallas remodeling faktorer har visat sig underlätta demonteringen av nucleosomal partiklar17; inneboende dynamiken i nucleosomes är dock den kritiska faktorn i denna process som bidrar till hela demontering processen. 14 , 16 , 18 , 19
Singel-molekyl tekniker såsom enda-molekyl fluorescens19,20,21, optiska svällning (pincett)13,18,22,23 och AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 har varit avgörande för att förstå dynamiken i nucleosomes. Bland dessa metoder, AFM förmåner från flera unika och attraktiva funktioner. AFM gör att man kan visualisera och karaktärisera enskilda nucleosomes samt de längsta matriser27. Från AFM bilder, kan viktiga egenskaper hos nukleosomens struktur såsom längden av DNA lindad runt Histon kärnan vara uppmätta 10,14,26,28. en parameter som är central för karakterisering av nukleosomens uppackning dynamics. Studier har visat nucleosomes vara mycket dynamiska system och att DNA kan spontant packa från Histon core14förbi AFM. Den spontana uppackning av DNA från nucleosomes var direkt visualiseras av AFM verksamma i time-lapse läget när bildtagning sker i vattenlösningar 14,26,29.
Tillkomsten av höghastighetståg time-lapse AFM (HS-AFM) instrumenteringen gjort det möjligt att visualisera nukleosomens uppackning processen på millisekund tidsskala 14,15,24. Senaste HS-AFM 16,30 studier av centromer specifika nucleosomes avslöjade flera nya funktioner i de nucleosomes jämfört med den kanoniska typ. Centromer nucleosomes utgör av en centromer, en liten del av kromosomen kritiskt viktigt för kromosom segregation31. Till skillnad från canonical nucleosomes i bulk kromatin innehåller Histon kärnan i Centromeren nucleosomes CENP-A Histon istället för Histon H332,33. Till följd av detta Histon substitution, DNA inslagning i Centromeren nucleosomes är ~ 120 bp i stället för de ~ 147 bp för kanoniska nucleosomes; en skillnad som kan leda till olika morfologier Centromeren och kanoniska nucleosomes kedjor34, tyder på att centromer kromatin genomgår högre dynamics jämfört med huvuddelen en. Den nya dynamik som visas av centromer nucleosomes i HS-AFM16,30 studier exemplifiera en unik möjlighet som tillhandahålls av denna enda-molekyl teknik att direkt visualisera den strukturella och dynamiska egenskaper för nucleosomes. Exempel på dessa funktioner kort och diskuteras illustreras i slutet av uppsatsen. Detta gjordes framsteg på grund av utvecklingen av nya protokoll för AFM avbildning av nucleosomes samt ändringarna av befintliga metoder. Målet med det protokoll som beskrivs här är att göra dessa spännande framsteg i singel-molekyl AFM nukleosomens studier tillgänglig för alla som vill utnyttja dessa tekniker i sina kromatin-undersökningar. Många av de tekniker som beskrivs är tillämpliga på problem utanför studien av nucleosomes och kan användas för undersökningar av andra protein och DNA system av intresse. Några exempel på sådana program kan hittas i publikationer35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 och utsikterna för AFM studier av olika Biomolekylär system ges i recensioner29,50,51,53,54.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1229px;" width="1229">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmid pGEM3Z-601</td>
			<td style="width:327px;">Addgene, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:119px;">26656</td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR Primers</td>
			<td style="width:327px;">IDT, Coralville, IA</td>
			<td style="width:119px;">Custom Order</td>
			<td>(FP) 5&#39;- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3&#39; (RP) 5&#39;-ACAGCTATGACCATGATTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DreamTaq polymerase</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">EP0701</td>
			<td>Catalog number for 200 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:327px;">Qiagen, Hilden, Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td>Catalog number for 50 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tris base</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td>Catalog number for 250 g</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">EDTA</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15576028</td>
			<td>Catalog number for 500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">(CENP-A/H4)2, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0010</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H2A/H2B, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">15-0311</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H3 Octamer, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0001</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">69574</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">S9888-500G</td>
			<td>Catalog number for 500 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Amicon Ultra-0.5&#160;mL Centrifugal Filters&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Millipore-sigma, Burlington, MO</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td>Catalog number for 8 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HCl</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>258148-25ML</td>
			<td>Catalog number for 25 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tricine</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T0377-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">SDS</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">11667289001</td>
			<td>Catalog number for 1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ammonium Persulfate (AmmPS)&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610700</td>
			<td>Catalog number for 10 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td>Catalog number for 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TEMED</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610800</td>
			<td>Catalog number for 5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610747</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">2-ME</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M6250-10ML</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">ageRuler Prestained Protein Ladder&#160;</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td>Catalog number for 500 uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bio-Safe&#8482; Coomassie Stain</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610786</td>
			<td>Catalog number for 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth&#160;</td>
			<td style="width:327px;">TexWipe, Kernersvile, NC</td>
			<td style="width:119px;">TX604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Muscovite Block Mica</td>
			<td style="width:327px;">AshevilleMica, Newport News, VA</td>
			<td style="width:119px;">Grade-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aminopropyl silatrane (APS)</td>
			<td style="width:327px;">Synthesized as described in 22</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HEPES</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">H4034-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scotch Tape</td>
			<td style="width:327px;">Scotch-3M, St. Paul, MN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TESPA-V2 afm probe (for static imaging)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aron Alpha Industrial Krazy Glue</td>
			<td style="width:327px;">Toagosei America, West Jefferson, OH</td>
			<td style="width:119px;">AA480</td>
			<td>Catalog number for 2 g tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MgCl2</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M8266-100G</td>
			<td>Catalog number for 100 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Millex-GP Filter, 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">SLGP05010</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)</td>
			<td style="width:327px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FG-3020C-20&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FS-1010S135-0.5&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MultiMode Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy</td>
			<td style="width:327px;">Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging

Kromatin, som är en lång kedja av nukleosomens subenheter, är ett dynamiskt system som möjliggör sådana kritiska processer som DNA-replikation och transkription att ta plats i eukaryota celler. Dynamiken i nucleosomes ger åtkomst till DNA av replikation och transkription maskinerier och bidrar kritiskt till de molekylära mekanismerna bakom kromatin funktioner. Singel-molekyl studier såsom atomic force microscopy (AFM) imaging har bidragit avsevärt till vår nuvarande förståelse av rollen av nukleosomens struktur och dynamik. Det nuvarande protokollet beskriver de steg som gör det möjligt för högupplösta AFM avbildningstekniker att studera den strukturella och dynamiska egenskaper för nucleosomes. Protokollet är illustrerad av AFM data erhållna för de centromer nucleosomes där Histon H3 ersätts med dess motsvarighet centromer protein A (CENP-A). Protokollet börjar med montering av mono-nucleosomes med en kontinuerlig utspädning metoden. Beredning av glimmer substratet functionalized med aminopropyl silatrane (APS-mica) som används för nukleosomens bildtagning är kritiska för AFM visualisering av nucleosomes beskrivs och förfarandet för att förbereda underlaget tillhandahålls. Nucleosomes deponeras på APS-mica ytan är först avbildas med hjälp av statiska AFM, som fångar en ögonblicksbild av nukleosomens befolkningen. Från analyser av dessa bilder, sådana parametrar som storlek av DNA lindad runt nucleosomes kan mätas och denna process är också detaljerade. Time-lapse AFM imaging förfarande i vätskan beskrivs för höghastighetståg time-lapse AFM som kan fånga flera bildrutor av nukleosomens dynamics per sekund. Slutligen är analysen av nukleosomens dynamics möjliggör kvantitativa karakterisering av de dynamiska processerna beskrivs och illustreras.

Mono-nucleosomes var först förberedda för AFM imaging experiment med en kontinuerlig utspädning montering metod (figur 1). De beredda nucleosomes kontrollerades sedan använda diskontinuerligt SDS-PAGE (figur 2). En glimmer yta var nästa functionalized använder APS, som fångar nucleosomes på ytan samtidigt som en slät bakgrund för högupplöst avbildning (figur 3). Nucleosomes sattes in på APS-mica och var därefter avbil...

Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Här presenterar vi ett protokoll för att karakterisera nukleosomens partiklar på singel-molekyl nivå använda statiska och time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging tekniker. Den beskrivna ytan funktionalisering metoden möjliggör tillfångatagandet av strukturen och dynamiken i nucleosomes i hög upplösning på nanonivå.

Sondera strukturen och dynamiken i Nucleosomes med hjälp av Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Detta protokoll utnyttjar alla viktiga funktioner i AFM, icke-mottagliga för andra enstaka molekyl tekniker. Som ett resultat kan vi lösa strukturen av nukleosomen i nanoskalas. Viktigt, direkt visualisering av nukleosomer gjordes vid fysiologiska förhållanden.Med hjälp av vår AFM-teknik har vi nyligen avslöjat unika egenskaper hos centromere nukleosomen som kan spela en roll på funktionen av hela centromere. Den metod som ska visas tillämpas för närvarande i vårt labb för att undersöka självmontering av proteiner i samband med bildandet av amyloid aggregat. Dessa protein aggregat utlösa utvecklingen av förödande sjukdomar som Alzheimers och Parkinsons för att nämna några.De enkla preparationsmetoderna är också tillämpliga på andra protein-DNA-komplex, inklusive stora system som DNA-replikeringsmaskiner. Även om vissa ändringar behövs. För att karakterisera nukleosompartiklar på enmolekylnivå med hjälp av statisk och tidsfördärva atomkraftmikroskopi, börja med att rena, montera och validera nukleosomerna enligt beskrivningen i det medföljande textprotokollet.Därefter förbereda glimmer ytan för statisk AFM avbildning. För att göra detta, först förbereda en femtio millimolar APS stamlösning i avjoniserat vatten. Förvara en milliliter alikvoter av denna lösning vid fyra grader Celsius, tills det behövs.Från stamlösningen, förbereda en fungerande APS-lösning för glimmermodifiering genom att lösa upp 50 mikroliter av 50 mikromolar APS-lagret i 15 milliliter destillerat avjoniserat vatten. Blanda lösningen och fyll sedan en cuvette med lösningen. Därefter skär en av tre centimeter remsor av glimmer från högkvalitativa glimmer ark.Kontrollera att stycket passar när det placeras diagonalt i en cuvette. Sedan klyver du skikten av glimmern tills båda sidor är nyklade, och biten är så tunn som 0,1 millimeter. Placera omedelbart glimmer bit i APS fyllda cuvette och inkubera glimmer i 30 minuter.Överför glimmerbiten till en cuvette fylld med destillerat avjoniserat vatten och blötlägg den i 30 sekunder. Använd sedan argon för att helt torka båda sidor av APS glimmerremsan. Applicera dubbel inför självhäftande tejp på flera magnetiska puckar och placera dem åt sidan.Därefter skär APS glimmersubstratet till en centimeter med en centimeter rutor, och täck dem i en ren Petriskål. Därefter förbereda tre utspädningar av de monterade nukleosomer med hjälp av en 0,22 mikron filtrerad buffert som innehåller 10 millimolar hepes och fyra millimolar magnesiumklorid vid en PH på 7,5. För att begränsa förlusten av nukleosomer, vid den låga slutkoncentrationen, bör spädningen göras en i taget, omedelbart före nedfall på APS glimmer.Deponera fem till 10 mikroliter av varje nukleosom prov i mitten av en APS glimmer bit och låt dem inkubera i två minuter. Skölj sedan försiktigt provet med två till tre milliliter destillerat avjoniserat vatten för att avlägsna buffertkomponenterna. Och torka det avsatta provet under ett lätt flöde av argon.Till att börja med montera en spets på tipphållaren på AFM-setup. Montera sedan det första provet på AFM-scenen, var noga med att inte kontakta provytan. Placera lasern över cantilever till dess summa är på det maximalt och justera de vertikala och laterala avböjningsvärdena till nära noll.Sedan, tune afm-sonden för att hitta dess resonansfrekvens, justera enheten amplitud, och ställa in bildstorleken till 100 av 100 nanometer. När du har konfigurerat, klicka på knappen engagera för att börja närma sig. När inflygningen är klar, optimera gradvis amplitudens börpunkt tills provets yta tydligt ses.Sedan öka skanningsstorleken till en mikron med en mikron och upplösningen till 512 med 512 pixlar. Klicka slutligen på hämtningsknappen för att påbörja bildförvärv. Använd glasstavsskannerlim för att fästa en glasstav på AFM-skannerstadiet.Låt detta torka i minst 10 minuter. Under tiden gör 0,1 millimeter tjocka cirkulära bitar av glimmer med en 1,5 millimeter diameter genom att stansa dem från en större glimmer ark. Använd hög hastighet AFM glimmer glas stav lim för att fästa denna glimmer bit till glasstaven på hög hastighet AFM, och låt den förbli orörd i minst 10 minuter medan den torkar.Sedan klyver lager från glimmer med hjälp av ett tryckkänsligt band tills en väl klyvd lager ses på bandet. Därefter späd en mikroliter på 50 millimolar APS lager i 99 mikroliter av destillerat dejoniserat vatten för att göra en 500 mikromolar APS-lösning. Deponera 2,5 mikroliter av lösningen på den nyklyvade glimmerytan och låt ytan funktionsdugliga i 30 minuter.Efter inkubationen sköljer du glimmern flera gånger med destillerat avjoniserat vatten genom att applicera tre mikrolitersköljningar. Ta bort vattnet helt efter varje sköljning genom att placera en fiberdukad torka vid kanten av glimmern. Efter den sista sköljningen, placera tre mikroliter av destillerat avjoniserat vatten på ytan, och låt den sitta i minst fem minuter för att ta bort alla icke-specifikt bundna APS.Därefter placera sonden i hög hastighet AFM hållare, och placera hållaren på AFM-scenen med spetsen uppåt. Skölj hållaren med hjälp av 100 mikroliter av destillerat avjoniserat vatten, följt av två 100 mikrolitersköljningar av 0,22 mikron filtrerad kärnbehandlingsbuffert. Med sköljningar gjort, fyll kammaren med 100 mikroliter av nukleosom bildframställning buffert, dränka spetsen.Justera cantilever position tills den träffas med lasern. Skölj sedan APS glimmer fem gånger med filtrerad nukleosom avbildningsbuffert, med hjälp av fyra mikroliter per sköljning. Späd ut en mikroliter av nukleosomens monteringslager till 250 mikroliter av filtrerad nukleosomavbildningsbuffert för en slutlig nukleosomkoncentration av en nanomolar.Deponera 2,5 mikroliter av denna utspädning på ytan och låt den sitta i två minuter. Skölj ytan två gånger med fyra mikroliter av nukleosom bildframställning buffert för att undvika över trängsel. Efter den slutliga sköljningen, lämna ytan täckt av bildframställningsbuffert.Ställ in skannern och provet ovanpå tipshållaren så att provet är nedåt. För att börja närma dig, använd funktionen auto inflygning med börpunkt amplitud nära den fria svängningsampituden. Justera börpunkten tills ytan är väl spårad.Ställ sedan in bildytan runt 150 med 150 nanometer till 200 med 200 nanometer med dataanskaffningsgraden på cirka 300 millisekunder per bildruta. Som en kontroll för montering och nedfall, H3 mononucleosomes var beredda och avbildas med hjälp av statiska AFM. Denna bild ger en ögonblicksbild av nukleosom befolkningen som det fanns ögonblick innan nedfall bekräftar att nucelosomes framgångsrikt monteras.Med H3 kontroll församlingen en framgång, var de presenterade metoderna nästa tillämpas på studien av CENP-A nukleosomer. Statisk AFM imaging av detta prov visade dess församling var en framgång. Från de statiska AFM-bilderna kunde höjden och turtalet mononukleosomer karakteriseras.Både vinkeln mellan de fria DNA-armarna och längden på de fria DNA-armarna används för att bestämma antalet DNA-varv i den enskilda nukleosomen. Däremot kan tidsförlopp AFM bildframställning av nukleosomerna användas för att visualisera den övergripande spontana uppackning beteende nukleosomerna. Då nukleosomens turnummer minskar, observeras också en motsvarande minskning av kärnvolymen för nukleosom.Förutom regelbunden time lapse imaging, kan hög hastighet tid förfaller AFM användas för att sondera de mer invecklade nukleosom dynamik som missas med hjälp av standard time lapse imaging. Förmågan hos denna teknik att fånga dynamiken under en lång tid var avgörande för visualisering av en långväga flyttning av en CENP-A nukleosom kärna, som fångades under loppet av 1200 ramar. Denna teknik var också avgörande för att fånga den sällsynta överföringen av en CENP-A nukleosom kärna från ett DNA-substrat till en annan.Den snabba bildupptagningshastigheten gjorde visualiseringen av denna dynamiska händelse möjlig eftersom det bara tog flera ramar att slutföra. I det breda kromatinfältet finns en uppsättning viktiga frågor som rör rollerna för liger histoner och histonförstoring av kromatin dynamiken. Alla dessa frågor kan besvaras med hjälp av vår teknik.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biochemistry

Unit 1

Diagnostic Imaging Techniques

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Undersökande Proteinsekvens-struktur-dynamik Förhållanden med Bio3D-webben

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi av enda proteinmolekyler genom en Atomic Force Mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analys av β-Amyloid-inducerad avvikelser på Fibrin Clot struktur av spektroskopi och svepelektronmikroskopi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Struktur lösning av den fluorescerande Protein Cerulean använder MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Avbildning av extracellulära blåsor med atomkraft mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisera enskilda protein aggregat med infraröd Nanospektroskopi och atomkraft mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisera diffusionell dynamik av guldnanroder på cellmembran med hjälp av en nanopartikel Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...