Name: probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Yazar Katkıları: YLL ve MSD tasarlanan proje; MSD oluşturarlar toplandı. MSD ve ZS AFM deneyleri ve veri analizleri yapılır. Tüm yazarları yazdı ve el yazması düzenlenebilir.

1. Mono-oluşturarlar Meclisi sürekli seyreltme
<ol><li>Oluşturmak ve bir kapalı merkezli Widom 601 nucleosome sıra konumlandırma içeren bir yaklaşık 400 bp DNA substrat arındırmak. 55 Not: di-oluşturarlar istenmeyen oluşumu sınırlamak için 'her kol kanat konumlandırma sıra' ~ 150 geçmemelidir bp.<ol>
<li>Plazmid pGEM3Z-601 tasarlanmış astar ile birlikte kullanın ve substrat DNA PCR kullanarak yükseltmek. Burada kullanılan 122 ve 154 bp kol uzunlukları ile 423 bp subst...

Yukarıda açıklanan iletişim kuralı oldukça basit ve son derece tekrarlanabilir sonuçlar, ancak birkaç önemli konular vurguladı sağlar. Functionalized APS-Mika güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar almak için anahtar bir substrat var. APS-Mika yüksek kararlılığını bir görüntüleme substrat önceden hazırlıklı olmak sonra en az iki hafta kullanılabilir kullanmak için hazırlamak izin verir bu substrat önemli özelliklerinden biridir. 59 , 61</...

Ökaryotik hücrelerde DNA son derece yoğun ve kromozomlar içine organize olduğunu. 1 ilk DNA organizasyon bir kromozom içinde hangi 147 oluşturarlar derlemede düzeyidir bp DNA'ın histon octamer çekirdek sıkıca sarılmış. 2 , 3 nucleosome parçacıklar son derece kompakt kromozom birimi kurdu kadar hangi sonra düzenlenen bir kromatin dizi oluşturan uzun bir DNA molekülü üzerinde topla. 4 kromatin sökme Gen transkripsiyonu ve genom çoğaltma, kritik hücresel işlemler tarafından gerekli DNA o kromatin son derece dinamik bir sistemdir öne ücretsiz erişim sağlar. 5 , 6 , 7 DNA çeşitli kromatin düzeylerde dinamik özelliklerini anlama moleküler seviyede nerede hatalar hücre ölümü veya kanser gibi hastalıkların gelişimine yol açabilir genetik işlemleri elucidating için kritik öneme sahip. 8 bir kromatin büyük önem oluşturarlar dinamikleri özelliğidir. 9 , 10 , 11 , 12 bu parçacıklar yüksek kararlılık crystallographic tekniklerle yapısal karakterizasyon için izin verdi. 2 ne bu çalışmalar eksikliği oluşturarlar DNA mekanizması gibi dinamik ayrıntılarını histon çekirdeğinden unwrapping vardır; transkripsiyon ve çoğaltma işlemleri için gerekli olan dinamik yoludur. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 Ayrıca, özel proteinler remodeling faktörler olarak adlandırdığı nucleosomal parçacıklar17sökme kolaylaştırmak gösterilmiştir; Ancak, oluşturarlar iç dinamikleri tüm sökme işleminin katkıda bu süreçte önemli faktördür. 14 , 16 , 18 , 19
Tek molekül floresans19,20,21, optik yakalama (cımbız)13,18,22,23 ve AFM gibi tek molekül teknikleri 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 oluşturarlar dinamikleri anlamakta vesile olmuştur. Bu yöntemler arasında AFM birkaç benzersiz ve çekici özelliklerinden yararlanır. AFM bir görselleştirmek ve bireysel oluşturarlar yanı sıra uzun diziler27karakterize etmek izin verir. AFM görüntülerden ölçülen 10,14,26,28nucleosome yapısı DNA buna sarılarak histon çekirdek uzunluğu gibi önemli özellikleri olabilir; nucleosome çıkartıyorum dynamics karakterizasyonu için merkezi bir parametre. AFM olması son derece dinamik sistemleri ve DNA kendiliğinden histon çekirdek14paketini oluşturarlar çalışmalar ortaya koymuştur. Spontan DNA'sı oluşturarlar unwrapping doğrudan görüntüleme sulu çözümler 14,26,29bitince hızlandırılmış modunda çalışan AFM tarafından görüntülenmiştir.
Yüksek hızlı hızlandırılmış AFM (HS-AFM) araçları gelişiyle nucleosome çıkartıyorum işleminin milisaniyelik zaman-ölçek 14,15,24görselleştirmek mümkün kıldı. HS-AFM 16,30 ile ilgili çalışmalar şeması belirli oluşturarlar kurallı türüyle karşılaştırıldığında oluşturarlar çeşitli yeni özellikler ortaya koydu. Şeması oluşturarlar bir şeması, kromozom kromozom segregasyon31için kritik düzeyde önemli küçük bir kısmını oluşturmaktadır. Toplu kromatin içinde kurallı oluşturarlar şeması oluşturarlar histon özünü CENP-A histon histon H332,33yerine içerir. Bu histon sonucu olarak, DNA kaydırma şeması oluşturarlar içinde ~ 120 ikamesidir ~ 147 yerine bp bp için kanonik oluşturarlar; farklı türleri morfoloji şeması ve kurallı oluşturarlar için neden olabilir bir fark daha yüksek dynamics toplu ile karşılaştırıldığında bu şeması kromatin uğrar düşündüren34, diziler. HS-AFM16,30 çalışmalarda şeması oluşturarlar tarafından görüntülenen roman dynamics benzersiz fırsat doğrudan yapısal ve dinamik özelliklerini görselleştirmek için bu tek molekül tekniği ile sağlanan örnekler oluşturarlar. Bu özelliklerinin örnekleri kısaca ele olacak ve kağıdın sonunda resimli. Bu ilerleme roman protokollerde oluşturarlar AFM görüntüleme gibi değişiklikler mevcut yöntemlerden gelişimi nedeniyle yapıldı. Burada açıklanan protokol amacı bu heyecan verici gelişmeler tek molekül AFM nucleosome çalışmalarda bu teknikleri onların kromatin araştırmalarda kullanmak isteyen herkes için erişilebilir hale getirmektir. Açıklanan teknikleri oluşturarlar çalışmanın ötesinde sorunlar için geçerlidir ve diğer protein ve DNA sistemleri ilgi soruşturma için kullanılabilir. Bu tür uygulamalar birkaç örnek yayınları35,36,37,38,39,40,41bulunabilir, 42,43,44,45,46,47,48,49 ve AFM çalışmaların geleceği çeşitli biyomoleküler sistemleri verilen29,50,51,53,54değerlendirmeleri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1229px;" width="1229">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmid pGEM3Z-601</td>
			<td style="width:327px;">Addgene, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:119px;">26656</td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR Primers</td>
			<td style="width:327px;">IDT, Coralville, IA</td>
			<td style="width:119px;">Custom Order</td>
			<td>(FP) 5&#39;- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3&#39; (RP) 5&#39;-ACAGCTATGACCATGATTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DreamTaq polymerase</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">EP0701</td>
			<td>Catalog number for 200 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:327px;">Qiagen, Hilden, Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td>Catalog number for 50 units</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tris base</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td>Catalog number for 250 g</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">EDTA</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15576028</td>
			<td>Catalog number for 500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">(CENP-A/H4)2, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0010</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H2A/H2B, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">15-0311</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H3 Octamer, recombinant human</td>
			<td style="width:327px;">EpiCypher, Durham, NC</td>
			<td style="width:119px;">16-0001</td>
			<td>Catalog number for 50 ug</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">69574</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">S9888-500G</td>
			<td>Catalog number for 500 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Amicon Ultra-0.5&#160;mL Centrifugal Filters&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Millipore-sigma, Burlington, MO</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td>Catalog number for 8 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HCl</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>258148-25ML</td>
			<td>Catalog number for 25 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tricine</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T0377-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">SDS</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">11667289001</td>
			<td>Catalog number for 1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ammonium Persulfate (AmmPS)&#160;</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610700</td>
			<td>Catalog number for 10 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td>Catalog number for 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TEMED</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610800</td>
			<td>Catalog number for 5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610747</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">2-ME</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M6250-10ML</td>
			<td>Catalog number for 10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">ageRuler Prestained Protein Ladder&#160;</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td>Catalog number for 500 uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bio-Safe&#8482; Coomassie Stain</td>
			<td style="width:327px;">Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:119px;">1610786</td>
			<td>Catalog number for 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth&#160;</td>
			<td style="width:327px;">TexWipe, Kernersvile, NC</td>
			<td style="width:119px;">TX604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Muscovite Block Mica</td>
			<td style="width:327px;">AshevilleMica, Newport News, VA</td>
			<td style="width:119px;">Grade-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aminopropyl silatrane (APS)</td>
			<td style="width:327px;">Synthesized as described in 22</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">HEPES</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">H4034-25G</td>
			<td>Catalog number for 25 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scotch Tape</td>
			<td style="width:327px;">Scotch-3M, St. Paul, MN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">TESPA-V2 afm probe (for static imaging)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)</td>
			<td style="width:327px;">Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Aron Alpha Industrial Krazy Glue</td>
			<td style="width:327px;">Toagosei America, West Jefferson, OH</td>
			<td style="width:119px;">AA480</td>
			<td>Catalog number for 2 g tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MgCl2</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">M8266-100G</td>
			<td>Catalog number for 100 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Millex-GP Filter, 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:327px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">SLGP05010</td>
			<td>Catalog number for 10 devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)</td>
			<td style="width:327px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FG-3020C-20&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Compound FS-1010S135-0.5&#160;</td>
			<td style="width:327px;">FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MultiMode Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy</td>
			<td style="width:327px;">Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing the structure and dynamics of nucleosomes using atomic force microscopy imaging

Nucleosome alt birimleri uzun bir zincir olan kromatin, DNA ikileşmesi ve transkripsiyonu almaya ökaryotik hücrelerde yer olarak böyle kritik süreçleri için sağlayan dinamik bir sistemdir. Oluşturarlar dinamikleri ve transkripsiyonu makineleri tarafından DNA'yı erişim sağlar ve eleştirel kromatin işlevlerini temel moleküler mekanizmaları katkıda bulunur. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) gibi görüntüleme tek molekül çalışmaları önemli ölçüde nucleosome yapısı ve dinamik rolünün geçerli anlayışımızı katkıda bulunmuştur. Geçerli protokol oluşturarlar yapısal ve dinamik özelliklerini incelemek yüksek çözünürlüklü AFM görüntüleme teknikleri etkinleştirme adımları açıklar. Protokol H3 histon onun muadili şeması protein A (CENP-A) ile değiştirilir şeması oluşturarlar için elde edilen AFM veri tarafından gösterilmektedir. Protokol mono-oluşturarlar sürekli seyreltme yöntemiyle derleme ile başlar. Nucleosome görüntüleme için kullanılan aminopropyl silatrane (APS-Mika) ile functionalized Mika yüzey hazırlanması açıklanan oluşturarlar AFM görselleştirme için önemlidir ve yüzey hazırlamak için yordam sağlanmıştır. APS-Mika yüzeyinde biriken oluşturarlar ilk nucleosome nüfus bir görüntüsünü yakalar statik AFM kullanarak yansıma. Bu görüntülerin analizleri, böyle parametre DNA buna sarılarak oluşturarlar boyutu olarak ölçülebilir ve bu işlem ayrıca ayrıntılı. Sıvı yordamda Imaging hızlandırılmış AFM birkaç çerçeveleri yakalayabilir yüksek hızlı hızlandırılmış AFM için anlatılan nucleosome dinamiği saniyede. Son olarak, dinamik süreçler nicel karakterizasyonu etkinleştirme nucleosome dinamiklerini analiz açıklanan ve resimli.

Mono-oluşturarlar ilk sürekli seyreltme derleme yöntemi (resim 1) kullanarak deneyler Imaging AFM için hazırlanmıştır. Hazırlanan oluşturarlar sonra kesintili SDS-sayfa (Şekil 2) kullanarak kontrol edildi. Mika yüzey sonraki oluşturarlar yüzeyi pürüzsüz bir arka plan için yüksek çözünürlüklü düşsel (Şekil 3) korunarak yakalar APS kullanarak functionalized. Oluşturarlar APS-Mika üzerinde tevdi ve daha so...

Watch this Scientific Journal Video about Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging at JoVE.com

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Burada, nucleosome parçacıklar, statik ve hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleme teknikleri kullanılarak tek molekül düzeyinde karakterize etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yakalama yapısı ve dinamik oluşturarlar içinde olan yüzey functionalization yöntemi sağlar nano, yüksek çözünürlüklü.

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Bu protokol, diğer tek molekül tekniklerine uygun olmayan AFM'nin tüm önemli özelliklerini kullanır. Sonuç olarak, nükleozomun yapısını nano ölçekte çözebiliyoruz. Daha da önemlisi, nükleozomların doğrudan görselleştirilmesi fizyolojik koşullarda yapıldı.AFM tekniğimizi kullanarak, son zamanlarda tüm sentromer işlevinde rol oynayabilecek sentromer nükleozomunun benzersiz özelliklerini ortaya çıkardık. Gösterilecek yöntem şu anda laboratuarımızda amiloid agregalarının oluşumu ile ilişkili proteinlerin kendi kendine biraraya getirmek için uygulanmaktadır. Bu protein agregaları Alzheimer ve Parkinson gibi yıkıcı hastalıkların gelişimini tetikler.Basit hazırlama yöntemleri, DNA çoğaltma makineleri gibi büyük sistemler de dahil olmak üzere diğer protein-DNA kompleksleri için de geçerlidir. Bazı değişiklikler gerekli olmasına rağmen. Statik ve zaman atlamalı atomik kuvvet mikroskobu kullanarak tek molekül düzeyindenükleozom parçacıkları karakterize etmek için, eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi nükleozomların arındırılması, birleştirilmesi ve doğrulanması ile başlar.Daha sonra, statik AFM görüntüleme için mika yüzeyini hazırlayın. Bunu yapmak için, ilk deiyonize suda elli milimolar APS stok çözeltisi hazırlamak. Bu çözeltinin bir mililitrelik aliquotlarını ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın.Stok çözeltisinden, 50 mikromolar APS stokunun 50 mikrolitresini 15 mililitre distile deiyonize suda eriterek mika modifikasyonu için çalışan bir APS çözümü hazırlayın. Çözeltiyi karıştırın ve sonra çözelti ile bir cuvette doldurun. Sonra, yüksek kaliteli mika levhalar mika üç santimetre şeritler bir kes.Bir cuvette çapraz yerleştirildiğinde parça uygun olup olmadığını kontrol edin. Daha sonra, her iki taraf taze beşli kadar mika katmanları cleave, ve parça olarak ince 0.1 milimetre. Mika parçasını hemen APS dolu cuvette'ye yerleştirin ve mikayı 30 dakika kuluçkaya yatırın.Mika parçasını distile deiyonize su yla dolu bir çiviye aktarın ve 30 saniye bekletin. Daha sonra, APS mika şeridinin her iki tarafını da tamamen kurutmak için argon kullanın. Birkaç manyetik diskler için çift yüzlü yapışkan bant uygulayın ve yan yerleştirin.Daha sonra, APS mika alt tabakasını bir santimetre kare ile bir santimetreye kesin ve bunları temiz bir Petri kabına kapatın. Daha sonra, 10 milimolar hepes ve 7,5 PH dört milimolar magnezyum klorür içeren bir 0.22 mikron filtreli tampon kullanarak monte nükleozomların üç seyreltme hazırlamak. Nükleozomların kaybını sınırlamak için, düşük son konsantrasyonda seyreltme APS mikasının birikmeden hemen önce teker teker yapılmalıdır.Aps mika parçasının ortasına her nükleozom numunesinin 5 ila 10 mikrolitresini yatırın ve iki dakika kuluçkaya yatırmalarını bekleyin. Daha sonra, tampon bileşenleri kaldırmak için iki ila üç mililitre distile deiyonize su ile numuneyi hafifçe durulayın. Ve biriken numuneyi argon ışığı altında kurutun.Başlamak için, AFM kurulumunun uç tutucuya bir ipucu takın. Ardından, ilk örneği AFM sahnesine monte edin ve numune yüzeyine temas etmemeye dikkat edin. Lazeri, toplamı maksimum olana kadar kantilin üzerinde konumlandırın ve dikey ve yanal sapma değerlerini sıfıra yakın ayarlayın.Ardından, rezonans frekansını bulmak, sürücü genliğini ayarlamak ve görüntü boyutunu 100'e 100 nanometreye ayarlamak için AFM sondasını ayarlayın. Ayarlandıktan sonra, yaklaşmaya başlamak için meşgul düğmesini tıklatın. Yaklaşım tamamlandığında, numunenin yüzeyi açıkça görülene kadar genlik ayar noktasını kademeli olarak optimize edin.Ardından, tazyik boyutunu bir mikrona, çözünürlüğü 512'ye 512 piksele yükseltin. Son olarak, görüntü edinimi başlatmak için yakalama düğmesini tıklatın. AFM tarayıcı aşamasına bir cam çubuk takmak için cam çubuk tarayıcı tutkal kullanın.Bu en az 10 dakika kurumasını bekleyin. Bu arada, daha büyük bir mika levha onları delerek 1,5 milimetre çapında mika 0.1 milimetre kalınlığında dairesel parçalar yapmak. Yüksek hızlı AFM mika cam çubuk tutkal yüksek hızlı AFM üzerinde cam çubuk bu mika parçası eklemek için kullanın ve kurur ise en az 10 dakika boyunca dokunulmamış kalmasını bekleyin.Daha sonra, yüksek bir katmanlı bant üzerinde görülene kadar bir basınca duyarlı bant kullanarak mika katmanları cleave. Daha sonra, 500 mikromolar APS çözeltisi yapmak için distile deiyonize su 99 mikrolitre 50 milimolar APS stok 50milimolar APS stok bir mikrolitre seyreltmek. Çözeltinin 2,5 mikrolitresini taze olarak aralanmış mika yüzeyine yatırın ve yüzeyin 30 dakika işlevsel hale gelsin.Kuluçkadan sonra, mikayı üç mikrolitre durulama uygulayarak distile deiyonize su ile birkaç kez durulayın. Mikanın kenarına dokuma olmayan bir mendil yerleştirerek her durulamayı takip eden suyu tamamen çıkarın. Son durulandıktan sonra, üç mikrolitre distile deiyonize su yüzeyine yerleştirin ve özel olarak bağlı olmayan APS'yi çıkarmak için en az beş dakika boyunca oturun.Ardından, prob'u yüksek hızlı AFM tutucuya yerleştirin ve ucu yukarı bakacak şekilde tutucuyu AFM sahnesine yerleştirin. Tutucuyu 100 mikrolitre distile deiyonize su kullanarak durulayın ve ardından 0,22 mikron filtrelenmiş nükleozom görüntüleme tamponunun 100 mikrolitrelik iki durulayın. Durulamalar yapıldı, ucu batırarak, nükleozom görüntüleme tampon 100 mikrolitre ile oda doldurun.Lazerle vurulana kadar cantilever pozisyonunu ayarlayın. Daha sonra, durulama başına dört mikrolitre kullanarak, filtrelenmiş nükleozom görüntüleme tamponu ile APS mika beş kez durulayın. Bir nanomolar son nükleozom konsantrasyonu için filtrelenmiş nükleozom görüntüleme tampon 250 mikrolitre içine nükleozom montaj stok bir mikrolitre seyreltin.Yüzeye bu seyreltme 2,5 mikrolitre mevduat ve iki dakika boyunca oturup sağlar. Kalabalığı önlemek için dört mikrolitre nükleozom görüntüleme tamponu yla yüzeyi iki kez durula. Son durulama dan sonra, yüzeyi görüntüleme tamponuyla kaplı bırakın.Tarayıcıyı ve örneği uç tutucunun üstüne ayarlayın, böylece örnek yüz üstü olacak. Yaklaşmaya başlamak için, otomatik yaklaşım işlevini serbest salınım genliğine yakın ayar noktası genliği yle kullanın. Yüzey iyi izlenene kadar ayar noktasını ayarlayın.Daha sonra, görüntüleme çerçevesi başına yaklaşık 300 milisaniye veri toplama hızı ile 200 tarafından 200 nanometre 150 ile 150 nanometre etrafında görüntü alanı ayarlayın. Montaj ve biriktirme kontrolü olarak H3 mononükleozomları statik AFM kullanılarak hazırlandı ve görüntülendi. Bu görüntü nükleozom popülasyonunun nüselozomların başarılı bir şekilde bir araya getirildiğini doğrulayan birikimin hemen öncesinde var olduğu gibi bir anlık görüntüsünü sağlar.H3 kontrol tertibatının başarılı olması yla birlikte, sunulan yöntemler daha sonra CENP-A nükleozomlarının çalışmasına uygulandı. Bu örneğin Statik AFM görüntüleme simontajı bir başarı olduğunu ortaya koymuştur. Statik AFM görüntülerinden mononükleozomların yüksekliği ve dönüş sayısı karakterize edilebilir.Serbest DNA kolları arasındaki açı ve serbest DNA kollarının uzunluğu, tek tek nükleozomdaki DNA dönüşlerinin sayısını belirlemek için kullanılır. Buna karşılık, nükleozomların zaman atlamalı AFM görüntülemenü nükleozomların genel spontan açma davranışını görselleştirmek için kullanılabilir. Nükleozomun dönüş sayısı azaldıkça, nükleozom çekirdek hacminde de bir azalma gözlenir.Normal zaman atlamalı görüntülemeye ek olarak, yüksek hızlı zaman atlamalı AFM, standart zaman atlamalı görüntüleme kullanılarak kaçırılan daha karmaşık nükleozom dinamiklerini araştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin dinamikleri uzun bir süre boyunca yakalayabilme yeteneği, 1200 kare boyunca yakalanan bir CENP-A nükleozom çekirdeğinin uzun mesafe translokasyonunun görüntülenmesi için gerekliydi. Bu teknik aynı zamanda bir CENP-A nükleozom çekirdeğinin bir DNA substratından diğerine nadir transferini yakalamada da kritik öneme sahiptir.Hızlı görüntü yakalama hızı, bu dinamik olayın görselleştirilmesini mümkün kıldı, çünkü tamamlanması sadece birkaç kare aldı. Geniş kromatin alanında liger histones ve kromatin dinamiklerinin histon büyütme rolleri ile ilgili önemli sorular bir dizi vardır. Tüm bu sorular bizim tekniğimizle cevaplanabilir.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biochemistry

Unit 1

Diagnostic Imaging Techniques

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Bio3D-web ile Protein Dizisi-yapı-dinamikleri İlişkilerinin İncelenmesi

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

MeshAndCollect kullanarak floresan Protein Cerulean yapı çözümü

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...