Name: assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af "The sanitet værdi kæden: designe sanitet systemer som Eco-værdi fællesskabssystemet" projekt, forskningsenhed for menneskeheden og naturen (RIHN, projekt No.14200107).

1. medium forberedelse
<ol><li>For at gøre en cellekulturmedium (serum-holdige medium), skal du tilføje 4,7 g af Eagle's MEM pulver til 500 mL destilleret vand. Autoklave ved 120 ° C i 20 min. og lad det medium afkøle til stuetemperatur. Tilføje føtal bovint serum (endelig koncentration: 10%), L-glutamin (2 mM), Penicillin Streptomycin (1%) og natriumhydrogencarbonat (1,125 g/L). Opbevares ved 4 ° C i 1 måned.</li>
	<li>Forberede den serumfrit medium virus formeringsmateriale som beskrevet i trin 1.1, men uden den føtale bovint serum. Opbevares ved 4 ° C i 1 måned.</li>
	<li>Plaque assay, sterilisere 100 mL af Eagle's MEM medium (ikke-holdige phenol rød) ved autoklavering. Lad mediet, afkøles til stuetemperatur, og derefter tilføje 2% FBS, 2% Penicillin Streptomycin, 4 mM L-glutamin, og 2,25 g/L NaHCO3. Opbevares ved 4 ° C.</li>
	<li>Plaque assay, sterilisere 100 mL 2,5% agarosegel af autoklave. Forberede gelen samme dag plaque-analysen er gennemført. Gemme gel på 47 ° C i et vandbad.</li>
</ol>2. celle kultur
<ol><li>Fjerne en cryotube indeholdende MA104 cellelinjer fra objektbeholderen flydende kvælstof. Placere cryotube i et vandbad ved 37 ° C at tø cellerne. Der tilsættes 1 mL af cellesuspension til 20 mL serum, der indeholder mediet i en kolbe på T75. Inkuber kolben i et varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 eller 3 dage. Bemærk: Den sidste celle koncentration i suspension er ca. 106 celler/mL.</li>
	<li>Når cellen éncellelag når 80% confluency, Fjern supernatanten og cellerne vaskes to gange med 5 mL af 1 x Dulbecco's PBS (fosfatbufferet saltopløsning).</li>
	<li>Kolben tilsættes 4 mL 0,05% trypsin-EDTA og inkuberes ved 37 ° C i 5 min at løsrive celler fra kolben. Overføre cellesuspension til en 15 mL rør og centrifugeres ved 190 x g i 5 min.</li>
	<li>Supernatanten og resuspend pelleted cellerne (106 celler) i 1 mL serum-holdige medium parat i 1.1. Fortynd de resuspenderede celler på 100 med mediet.</li>
	<li>Tilføj 3 mL fortyndet cellesuspension til hver brønd 6-godt (for plaque assay) eller 24-godt plader (for celle-bindende analysen), henholdsvis. Inkuber plader i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp i 2 eller 3 dage. Bemærk: En T75 kolbe er velegnet til at indsamle tidsforløb prøver, fordi prøven rumfang supernatant (1 mL) kan ignoreres i forhold til den samlede supernatanten volumen (30 mL). I mellemtiden, smitsomme titer af virus i hver supernatanten er målt af plaque assay, der normalt gennemføres ved hjælp af en 6-godt plade. En 24-godt plade er udnyttet til celle-bindende assay.</li>
</ol>3. specifik tilvækst af Rotavirus
Bemærk: Rhesus rotavirus (RRV, genotype: G3P[3]) er udnyttet i denne protokol, fordi RRV kan hurtigt og nemt danner plaques med MA104 celler.
<ol><li>Sted et rør, der indeholder 1 mL virussuspension (107 pfu/mL) i et serumfrit medium opbevares ved-80 ° C i et vandbad ved 37 ° C til at tø. Tilsættes 1 µg/µL trypsin fra svin bugspytkirtlen 1 mL virussuspension (endelige trypsin koncentration er 4 µg/mL) og derefter vortex. Inkuber virussuspension ved 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp i 30 min. Bemærk: Trypsin fra andre kilder kan bruges, men effekten på rotavirus smitteevne skal være testet på forhånd.</li>
	<li>Fortyndes de aktiverede virussuspension med et serumfrit medium til at justere mangfoldigheden af infektion (MOI) til 0,1 pfu/celle.</li>
	<li>Tilsættes 1 mL fortyndet virussuspension til MA104 cellelinjer (80% sammenflydende) i en T75 kolben 3 dage efter cellen plating (2.1), inkuberes ved 37 ° C i 1 time og forsigtigt ryst kolben hver 15 min.</li>
	<li>Derefter tilsættes 30 mL af en serumfrit medium indeholdende 0,13 µg/mL trypsin fra et svin bugspytkirtlen kolben. Inkuber i kolben på 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp.</li>
	<li>Saml 1 mL af supernatanten i kolben på 0, 6, 12, 18, 24 og 36 (eller 48) h efter infektionen (hpi) og erstatte supernatanten i 1,5 mL rør med pipette.</li>
	<li>Gennemføre fryse (-80 ° C) og smelte i vandbad på 37 ° C-normalprogrammet tre gange. Derefter centrifugeres rør på 12.600 x g i 10 min. ved 4 ° C. Indsamle supernatanten.</li>
	<li>Filtrer supernatanten med destilleret 0,2 µm filter til at fjerne den celle fraktion. Gemme supernatanten-80 ° C i køleskabet indtil gælder plaque analyse til måling af virus titer.</li>
	<li>Placer de rør, der indeholder den indsamlede supernatanten (trin 3.5) i vandbad ved 37 ° C. Tilføjes en 1 mL af 10-fold fortyndede prøve 4 µg/mL trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 30 min.</li>
	<li>Under 30 min inkubation i 3,8, til at begynde plaque analyse til måling af virus titer fremstillet af tid kursus prøver (trin 3.5), MA104 cellerne vaskes to gange i en 6-godt plade med 2 mL 1 x PBS efter fjernelse af serum-holdige medium.</li>
	<li>Seriefremstillede fortyndes de rugede prøver med et serumfrit medium og podes 1 mL af det fortyndede prøve i hver brønd. Inkuber plade for 90 min. ved 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp, og Ryst forsigtigt plade hver 15 min.</li>
	<li>Efter inkubation, skal du fjerne inokulat fra 6-godt plade. Tilføj 4 µg/mL trypsin til medium forberedt i (trin 1.3). Forsigtigt men straks tilføje 3 mL af substratet blandet med agarosegel (forholdet er 1:1) til hver brønd.</li>
	<li>Holde pladen ved stuetemperatur i mere end 10 min (indtil agarosegel bliver fast), og der inkuberes i 2 dage ved 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp. Bemærk: Hæld medium blandet med agar fra kanten af brønden.</li>
	<li>Der tilsættes 1 mL af 0.015% neutral rød opløsningen fortyndes med 1 x PBS i hvert hul, og der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp. Fjerne farven efter 3 h og inkuberes i 1 dag på 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp.</li>
	<li>Den næste dag, tælle antallet af plaques i hver brønd og beregne pfu/mL. Nøje kontrollere celle sammenløbet før plaque analysen at forsikre plaque numre.</li>
</ol>4. celle-bindende Assay
Bemærk: Denne protokol er baseret på Gillings rapport13.
<ol><li>Tilføje 1 µg/µL trypsin fra et svin bugspytkirtlen til 1 mL virussuspension (endelige trypsin koncentration er 4 µg/mL) og derefter vortex (på samme måde som 2.1). Fortynd virussuspension med et serumfrit medium til at justere MOI 1 pfu/celle.</li>
	<li>Derefter, vaske MA104 cellerne to gange på 24-godt plade med 1 ml af Tris-bufferet saltvand (TBS; 2,53 g/L Tris base, 6,54 g/L NaCl, 0,3 g/L KCl, 0.046 g/l Na2HPO4 til 1 L med destilleret vand).</li>
	<li>Podes 100 µL fortyndede virussuspension til hver brønd med en 24-godt plade med celler, og der inkuberes ved 4 ° C til 90 min, med blid ryster hver 15 min.</li>
	<li>Fjern virus inokulum og cellerne vaskes to gange med 1 mL af TBS. Hen til uddrag dobbelt-strenget (ds) RNA af rotavirus, tilføje 140 µL 1 x PBS og 560 µL af RNA ekstraktionsbuffer (Se Tabel af materialer) til hver brønd. Bland tilstrækkeligt med en pipette (omkring 10 x, eller indtil DIS eller forurenende stof i celler i bufferen ikke er set).</li>
	<li>Efter at inddrive den dobbelt strandede RNA (dsRNA) efter producentens protokol, placere de 1,5 mL rør indeholdende dsRNA ekstrakt på en varme blok ved 95 ° C i 5 min at denaturere dsRNA, og derefter straks sted rør på is og Inkuber i mere end 2 min.</li>
	<li>Syntetisere cDNA ved hjælp af en reverse transkription kit (Se Tabel af materialer). Tilføje 4 µL af denatureret viral RNA løsning til en PCR rør indeholdende 16 µl af blanding (tabel 1) og bland det forsigtigt med en pipette for ikke at generere bobler. Spin ned rørene.</li>
	<li>Udføre reverse transkription med en termisk cycler under den betingelse, der er vist i tabel 2. Hvis cDNA ikke anvendes straks, gemme PCR rør indeholdende cDNA ved-20 ° C i op til 1 år.</li>
	<li>Bruge primere for kvantitativ PCR (fremad 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3' omvendt; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 og en sonde, indsætte en quencher (qPCR sonder; 5'- / FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA /-3'), rettet mod den 963 – 1049 region af NSP3 genom segment af rotavirus (ST3 stamme, GenBank: X81436). Bemærk: Quencher indsættes i sonden designet af Zeng et al.14
</li>
	<li>Fortynd den standard plasmid seriefremstillede (101 106 eksemplarer/ml) med PCR-klasse vand til qPCR blanding (tabel 3) og gøre det master mix (20 µL/prøve) for qPCR efter tabel 4.</li>
	<li>Tilføj 20 µL af den master mix til en 96-brønd PCR plade fordybning, og derefter blande 5 µL cDNA prøver eller 5 µL af den standard plasmid af pipettering 10 gange. Start reaktion af qPCR systemet ifølge de betingelser, der er vist i tabel 4.</li>
	<li>For at beregne rotavirus genom bundet til MA104 celle overflade, udføre lineær regression mellem Ct værdier og kendte genom antallet af en standard plasmid, og anslå genom prøvenummer. Derefter beregne forholdet mellem virion numre binding til celler (Gt) til dem i den indledende inokulum (G0).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rna+Virus+Mutations.">Rna Virus Mutations.</a> Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).</li><li>Gouvea, V., Brantly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+rotavirus+a+population+of+reassortants?.">Is rotavirus a population of reassortants?.</a> Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).</li><li>Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-chlorine+disinfection+as+a+selection+pressure+on+norovirus.">Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).</li><li>Ghosh, S., Kobayashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genomic+analysis+of+rotavirus+strains:+current+status+and+future+prospects.">Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects.</a> Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).</li><li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2008+estimate+of+worldwide+rotavirus-associated+mortality+in+children+younger+than+5+years+before+the+introduction+of+universal+rotavirus+vaccination+programmes:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).</li><li>Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+and+correlates+of+protection+for+rotavirus+vaccines.">Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines.</a> Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).</li><li>Santos, N., Hoshino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+distribution+of+rotavirus+serotypes/+genotypes+and+its+implication+for+the+development+and+implementation+of+an+effective+rotavirus+vaccine.">Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine.</a> Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).</li><li>Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylodynamic+analyses+of+rotavirus+genotypes+G9+and+G12+underscore+their+potential+for+swift+global+spread.">Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread.</a> Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).</li><li>Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+molecular+epidemiology+of+rotavirus+infection+after+introduction+of+monovalent+rotavirus+vaccination+in+Scotland.">Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland.</a> Vaccine. 35, 156-163 (2017).</li><li>Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+rotaviruses+in+continuous+human+and+monkey+cell+lines+that+vary+in+their+expression+of+integrins.">Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins.</a> Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).</li><li>Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+a2b1+and+a4b1+can+mediate+SA11+rotavirus+attachment+and+entry+into+cells.">Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells.</a> Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).</li><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).</li><li>Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+antiviral+action+of+plant+antimicrobials+against+murine+norovirus.">Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).</li><li>Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+quantitative+RT-PCR+for+the+detection+of+rotavirus+in+acute+gastroenteritis.">One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis.</a> Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).</li><li>Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+evaluation+of+rotavirus-cell+interactions:+identification+of+an+enterocyte+ganglioside+fraction+that+mediates+group+A+porcine+rotavirus+recognition.">Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition.</a> Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).</li><li>Br&#252;ssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+milk+immunoglobulins+for+passive+immunity+to+infantile+rotavirus+gastroenteritis.">Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).</li><li>Outzen, H., Berglund, G. I., Smal&#229;s, A. O., Willassen, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+and+pH+sensitivity+of+trypsins+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+in+comparison+with+bovine+and+porcine+trypsin.">Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).</li><li>Saxena, K., Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).</li><li>Yin, Y., Bijvelds, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+rotavirus+infection+and+antiviral+therapy+using+primary+intestinal+organoids.">Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids.</a> Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Vores protokol til måling af de specifikke vækstrate er lettere end tidligere og kan tilpasses til andre vira, medmindre deres celle kultur system endnu ikke er blevet etableret. I denne undersøgelse, brugte vi RRV (G3P[3]) fordi denne stamme kan danne plaques lettere end menneskelige rotaviruses når du bruger MA104 cellelinjer. Nogle menneskelige rotavirus stammer ikke kan danne plak i denne cellelinje. Derfor, i stedet for analysen plaque fokus danner enhed (FFU) assay15 eller median vævskultur infektiøse dosis (TCID50) analysen kan anvendes til mange rotavirus stammer16. Den præsenterede protokol til bestemmelse af de specifikke vækstrate kan bruges til andre virustyper men er ikke egnet til vira som ingen etableret celle kultur system er etableret. Før du starter eksperimentet for den specifikke vækstrate, det er bedre at vide på forhånd, når virus smitsom titer begynder at stige og når den stationære fase i en foreløbig prøve. Hvis for mange plaques er til stede, bør plaque analysen udføres igen efter skiftende fortynding satsen af virus prøver. Timer efter infektionen (hpi) til at indsamle prøver er også vigtige, fordi hældningen af den eksponentielle vækstfase kan være undervurderet, hvis den rette tidspunkt at nå frem til den stationære fase er savnet. I tilnærmelsen af den modificerede Gompertz model, bør en determinationskoefficienten altid beregnet og tjekket. Hvis fitness til den modificerede Gompertz model er lav, kan andre vækst modeller såsom modificeret logistisk model12 være at foretrække.
I håndtering celler, når du fjerner medium eller virus inokulat, skal PBS for vask eller Agarosen gel for plaque assay straks tilføjet til hver godt af en celle kultur plade til at forhindre celler fra tørhed. På samme tid, skal du forsigtigt hældes PBS eller Agarosen celler ikke at løsrive fra brøndene. Dette trin er det vigtigste i begge assays (trin 3,9 og 3.11). Hvis plak analysen har for mange prøver, anbefaler vi inddele agarosegel (100 mL hver maksimalt anbefales) i flere mellemstore flasker og holde flaskerne varme indtil lige før brug siden Agarosen gel er størknet i ca 10 min på værelse temperatur. Da trypsin er sårbare over for høje temperaturer17, bør en trypsin løsningen føjes til en medium og Agarosen for plaque analysen efter passende afkøling.
I celle-bindende assay, skal inkubation i virus binding til celler gøres ved 4 ° C at forhindre invasion af celler. Ifølge Gillings metode13er celler tilbøjelige til tørring ved lave temperaturer, så blid ryster er nødvendigt hvert 15 min under inkubation. RNA udvinding kit udnyttet her kan erstatte andre kits. Hældningen af standardkurven i RT-qPCR bør være ca 3.3, og determinationskoefficienten bør være mere end 0,98. I forhold til fluorescens mikroskop til at visualisere lokalisering af virus i celler, er analysen hurtigere og nemmere at bruge fordi binding af fluorescerende stoffer til vira ikke er nødvendigt.
For nylig, menneskelige tarm enteroid (HIE), udviser en lignende cellulære sammensætning og funktion som menneskelige mave-tarm epitel, er blevet tilgængelig for rotavirus formering18. Brugen af HIE kan gøre det muligt at evaluere de specifikke vækstrate og celle-bindende evne til ikke-bestemmelse stammer af rotavirus. Også, begge forsøg beskrives her kan anvendes til evaluering af narkotika virkninger på begge fænotyper19. Protokollerne præsenteres her gøre det muligt at kvantitativt diskutere ændringer i fænotype parameterværdier af rotavirus stammer under varierede forhold.

RNA-vira danne en genetisk forskellige befolkning, kendt som quasispecies1, på grund af deres Mutationshastighed,2 som er højere end i DNA-baserede organismer. Befolkningsstrukturen i quasispecies påvirkes af befolkningen genetiske faktorer, herunder mutation, udvælgelse pres og genetisk drift. Stammer inden for en enkelt genetiske afstamning kan vise forskellige fænotyper på grund af den genetiske mangfoldighed. For eksempel viste Rachmadi et al., fri klor følsomhed var forskellig blandt murine norovirus stammer, der stammer fra en plaque-renset stamme S7-PP33.
Rotaviruses (slægten rotavirus i reoviridae familie) er ikke-kappebærende ds RNA virus danner quasispecies2. Ud over de befolkning genetiske faktorer beskrevet ovenfor, påvirker genom resortering den genetiske mangfoldighed af rotavirus fordi denne virus har 11 segmenterede genomer4. Rotaviruses forårsage diarré hovedsageligt blandt spædbørn, og børnedødelighed i 2013 blev anslået omkring 250.0005. To vacciner er i brug i flere lande og har været effektive til at reducere byrden af rotavirus-infektion, men nogle forskere diskuterer nu tilstedeværelsen af vaccine-undslippe mutanter6,7,8, 9. karakterisering af disse mutanter er vigtigt at forstå mekanismerne, vaccine-escape.
Vi præsenterer her, protokoller for to assays til evaluering af specifikke vækstrate og celle-bindende evne af rotavirus for at forstå de fænotypiske forskelle blandt stammer/mutanter. Vækstkurven af rotaviruses har været præsenteret i tidligere rapporter10, men vækst parametre såsom-specifik tilvækst er normalt ikke måles. En celle-bindende analyse gennemført tidligere indebærer den immunfluorescent farvning teknik11. Her viser vi lettere metoder til brug af plaque assay og RT-qPCR, som tillader os at kvantitativt diskutere forskellen i viral fænotyper. Disse metoder er hensigtsmæssige for karakterisering af rotavirus fænotyper og kan endelig bidrage til opbygningen af nye vacciner effektiv for flere genotyper.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7500 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-EPI</td>
			<td>Nakalai Tesque, Inc</td>
			<td>01101-34</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>194-02875</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05900</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05901</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward / Reverse primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>140-00932</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-) &#34;Nissui&#34;</td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05913</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liguid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR039A</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR037A</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52904</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>199-05985</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>198-01675</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 6-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancrease</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0303-1G</td>
			<td>Activate for rotavirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus

Rotavirus er den største ætiologiske faktor for infantile diarré. Det er en dobbelt-strenget (ds) RNA-virus og danner en genetisk forskellige befolkning, kendt som quasispecies, på grund af deres høje Mutationshastighed. Her, beskriver vi hvordan man kan måle den specifikke vækstrate og celle-bindende evne af rotavirus som sin fænotyper. Rotavirus er behandlet med trypsin at genkende celle receptoren og derefter inokuleres i MA104 cellekultur. Supernatanten, herunder viral descendenter, er indsamlet sporadisk. Plaque analysen bruges til at bekræfte virus titer (plak-dannende enhed: pfu) af hver indsamlet supernatanten. Den specifikke vækstrate anslås ved at montere tidsforløb data på pfu/mL, den modificerede Gompertz model. I analysen af celle-bindende er MA104 celler i en 24-godt plade inficeret med rotavirus og inkuberes i 90 min. ved 4 ° C for rotavirus adsorption til cellereceptorer. Lav temperatur når den tilbageholder rotavirus fra invaderende vært-cellen. Efter vask for at fjerne ubundne virioner, er RNA udvundet af virioner tilknyttet cellereceptorer efterfulgt af cDNA syntese og omvendt-transskription kvantitativ PCR (RT-qPCR). Disse protokoller kan anvendes for at undersøge de fænotypiske forskelle blandt viral stammer.

En oversigt over to protokoller for specifikke vækstrate og celle-bindende assay af plaque-renset RRV stammer er vist i figur 1A og 2A, henholdsvis.
I analysen for de specifikke vækstrate når den endelige virus titer mere end 107 pfu/mL når formeringsmateriale på T75 kolben. Hvis den maksimale koncentration er lavere end 107 pfu/mL, MA104 cellen kan ikke være blevet Konfluerende eller RRV blev ikke aktiveret godt af trypsin. Nogle vækst modeller er til rådighed til vurdering af den specifikke vækstrate ved hjælp af den smitsomme enhedsdataene. I denne protokol, er de modificerede Gompertz model12 ansat som eksempel; <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
hvor N0 (104 pfu/mL i denne undersøgelse) og Nt (104 til 108 pfu/mL) er den virus smitsom titer (pfu/mL) på 0 og t (eksempel: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, henholdsvis A er den asymptotiske værdi [log (N∞/n0 )] (eksempel: 3-4), μ er den specifikke vækstrate [1/h], e er Napiers konstant og λ er den mellemliggende periode [h]. Model parametre er fremstillet af funktionen Problemløser af analysesoftwaren, der minimerer summen af kvadrater af differencen mellem de observerede og modelleret. I eksemplet i figur 1B, den specifikke vækstrate (µ) skønnes for at være 0.197 [1/h] og den mellemliggende periode (λ) er 6.61 [h] ved at anvende de mindste kvadraters metode til en modificeret Gompertz model, og relative virus titer på den stationære fase til den indledende titer ( Log skala) (A) er 3.15 [log (N∞/n0)]. Vi har testet 6 rotavirus kloner i alt, og de anslåede værdier af den specifikke vækstrate varierede fra 0,19 til 0,27 [1/h]. Disse anslået værdier er pålidelige, fordi bestemmelse værdier i model fitting lig mere end 0,98.
RRV virioner binding til celle overflader var omkring 103 kopier/mL (bindende effektivitet var omkring 1%) ved hjælp af en 24-godt plade til celle-bindende assay (figur 2B). Analysen foregår normalt tre gange for hver prøve, og hvis en stor varians i kopi nummer er observeret i en prøve, kan opstå nogle problemer såsom over vask og utilstrækkelig aktivering af RRV af trypsin. Ct værdi af qPCR overstiger ca 36,0 er ikke at foretrække og anses for at være under en detektionsgrænse i vores qPCR tilstand.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volumen / 1 reaktion</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x PrimeScript Buffer</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript RT enzym Mix jeg</td>
			<td>1,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo dT Primer</td>
			<td>1,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tilfældige 6 mers</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ionbyttet destilleret vand</td>
			<td>6,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ssRNA prøven</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>I alt</td>
			<td>20,0 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Master mix sammensætning for cDNA syntese af rotavirus genom.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur [° C]</td>
			<td>Tid</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Reaktion betingelse for cDNA syntese af rotavirus genom.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volumen/1 reaktion</td>
		</tr>
<tr>
<td>Premix Taq</td>
			<td>12,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Videresende primer (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Omvendt primer (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonden (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reference farvestof II</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ionbyttet destilleret vand</td>
			<td>5.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA prøve</td>
			<td>5.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>I alt</td>
			<td>25 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Master mix sammensætning for kvantitativ PCR af rotavirus et genom.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur [° C]</td>
			<td>Tid</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">45 cyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4: Reaktion betingelse for kvantitativ PCR af rotavirus et genom.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> Figur 1: skematisk oversigt over vurdering af rotavirus vækst og vækstkurven af rotavirus. (A) de smitsomme enhed af rotavirus måles med plaque assay. (B) kurve (blå linje) var en indbyrdes tilnærmelse af den modificerede Gompertz model baseret på observerede data i vores laboratorium (hvid cirkel). Den specifikke vækstrate [µ]; 0.197 [h-1], mellemliggende periode (λ); 6.61 [h], relative virus titer på den stationære fase til den indledende titer (log skala) (en); 3.15 [log (N∞/n0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> Figur 2: skematisk oversigt og repræsentativt resultat af celle-bindende analysen af fem RRV stammer renset fra plaques i vores laboratorium. (A) A celle kultur plade podet med rotavirus er inkuberes ved 4 ° C for hæmme virus invasion i celler. Efter inkubation og fjerne de ubundne viruspartikler til celler, kvantificere antallet af genomer stammer fra bundne viruspartikler til cellens overflade med RT-qPCR. (B) et resultat af celle-bindende assay blev vist som bindende effektivitet (%), som var forholdet mellem bundne viruspartikler til de tilstedeværende i inokulat. Fed bar: median, slutningen af kasser: kvartil afvigelse, slutningen af linjen: maksimums- og minimumsmængder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Her præsenterer vi to protokoller, en til at måle den specifikke vækstrate og den anden for celle-bindende evne af rotavirus ved hjælp af plaque assay og RT-qPCR. Disse protokoller er tilgængelige for at bekræfte fænotyper forskellene mellem rotavirus stammer.

Assays til specifikke vækstrate og celle-bindende evne af Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Ved hjælp af de analyser, der præsenteres her, kan forskellen i fænotype blandt rotavirusstammer evalueres, hvor unikke stammer isoleres. Specifikt undersøges den fæotypiske ændring af desinfektionsresistente stammer af rotavirus. For at opnå klare kvantitative udgange ved hjælp af plaque-analysen er det afgørende at vælge en passende kombination af rotavirusstamme og -serum, hvor rotavirus er godt tilpasset til serum.Demonstration af proceduren vil være Syun-suke Kadoya, en ph.d.-studerende fra mit laboratorium. Fjern en CryoTube, der indeholder MA104-cellelinjer, fra beholderen med flydende nitrogen. Placer CryoTube i et vandbad ved 37 grader Celsius for at tø cellerne op.Der tilsættes en milliliter cellesuspension til 20 milliliter af det serumholdige medium i en T75-kolbe. Kolben inkuberes i en kuvøse ved 37 grader Celsius og 5 % CO2 i to til tre dage. Når cell monolayer når 80% sammenløb, fjerne supernatant og vaske cellerne to gange med fem milliliter 1X Dulbecco's PBS.Der tilsættes fire milliliter 0,05 % trypsin-EDTA i kolben, og der inkuberes ved 37 grader Celsius i fem minutter for at løsne cellerne fra kolben. Celleaffjedringen overføres til et 15 milliliterrør, og centrifugeres ved 190 g i fem minutter. Supernatanten kasseres, og de pelleterede cellerne skal opspørges i en milliliter serumholdigt medium.Derefter fortyndes de resuspenderede celler 100 gange med mediet. Der tilsættes tre milliliter af den fortyndede cellesuspension til hver brønd af en seks-brønds plade til plaque-analysen. Der tilsættes en milliliter af den fortyndede cellesuspension til hver brønd af en 24-brøndplade til cellebindende analysen.Inkuber pladerne i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% CO2 underættet damp i to eller tre dage. Et rør, der indeholder en milliliter virussuspensionen i serumfrit medium, overføres fra oplagring ved minus 80 grader Celsius til et 37 grader Celsius-vandbad for at tø op. Tilføj et mikrogram pr mikroliter trypsin fra svine bugspytkirtlen til en milliliter af virus suspension og derefter vortex.Inkuber virussuspensionen ved 37 grader Celsius og 5% CO2 undermættet damp i 30 minutter. Den aktiverede virussuspension med serumfrit medium fortyndes for at justere den mangedoble infektion eller MOI til 0,1 pfu pr. celle. Der tilsættes en milliliter af suspensionen af fortyndet virus til MA104-celler i en T75-kolbe tre dage efter celleblægningen.Inkuber cellerne med virus ved 37 grader Celsius i en time, og kolben rystes forsigtigt hvert 15. Derefter tilsættes 30 milliliter et serumfrit medium, der indeholder fire mikrogram pr. milliliter trypsin fra svinekvalos til kolben. Kolben inkuberes ved 37 grader Celsius og 5% CO2-undermættet damp.Der opsamles en milliliter supernatant i kolben ved nul, seks, 12, 18, 24 og 36 timer efter infektionen, og supernatanten udskiftes i de 1,5 millilitertyper ved hjælp af en pipette. Udbet en fryse-tø cyklus inden for 15 minutter ved minus 80 grader Celsius efterfulgt af en 15-minutters smelte i et vandbad ved 37 grader Celsius. Derefter centrifuge rørene ved 12, 600 g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Saml supernatanten. Supernatanten filtreres med et destilleret 0,2 mikronfilter for at fjerne cellefraktionen. Supernatanten opbevares på minus 80 grader Celsius, indtil den påføres plaque-analysen til måling af virustitreen.Når du er klar til at udføre plak assay, placere rør, der indeholder de indsamlede supernatant i et vandbad ved 37 grader Celsius. Tilsæt trypsin til en milliliter 10 gange fortyndet prøve, og inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Under denne 30-minutters inkubation vaskes MA104-cellerne omhyggeligt i en seks-brønds plade med to milliliter 1X PBS efter fjernelse af det serumholdige medium.Serielt fortyndes de inkuberede prøver med serumfrit medium og inokulerer en milliliter af den fortyndede prøve i hver brønd. Inkuber pladen i 90 minutter ved 37 grader Celsius og 5% CO2 underættet damp, forsigtigt ryste pladen hvert 15. Efter inkubationen fjernes inokulummet fra seks-brøndpladen.Tilsæt fire mikrogram pr. milliliter trypsin til det forberedte medium. Forsigtigt, men straks tilføje tre milliliter af mediet blandet med agarose gel til hver brønd. Lad agarosegelen størkne ved stuetemperatur i mere end 10 minutter.Derefter inkuberes pladen i to dage ved 37 grader Celsius og 5% CO2 underættet damp. Dernæst tilsættes en milliliter 0,015% Neutral Rød opløsning fortyndet med 1X PBS til hver brønd, og inkuberes med de samme betingelser. Fjern farvestoffet efter tre timer og fortsætte med at inkubere i en dag.Den næste dag, tælle antallet af plaques i hver brønd og beregne pfu pr milliliter. Kontroller omhyggeligt cellekonfluen før plaque-analysen for at sikre plaknumrene. For celle-bindende assay, tilsæt et mikrogram pr mikroliter af trypsin fra en svinehvirvelstaks til en milliliter af virus suspension, og derefter vortex.Virussuspensionen fortyndes med serumfrit medium for at justere MOI'en til én pfu pr. celle. Ma104-cellerne vaskes to gange i en 24-brøndplade med en milliliter tris-buffered saltvand. Nu vaccinere cellerne med 100 mikroliter af fortyndet virus suspension i hver brønd af 24-brøndpladen.Inkuber pladen ved fire grader Celsius i 90 minutter med blid omrystning hvert 15. Fjern virusinokulum, og vask cellerne to gange med en milliliter tris-buffered saltvand. For at udtrække rotavirusens dobbeltstrengede RNA tilsættes 140 mikroliter 1X PBS og 560 mikroliter af RNA-ekstraktionsbufferen til hver brønd.Bland tilstrækkeligt med en pipette, indtil tåge af celler i bufferen ikke ses. Efter at have genvundet det dobbeltstrengede RNA, skal de 1,5 milliliterrør, der indeholder det dobbeltstrengede RNA-ekstrakt, være kommet sig over på en varmeblok ved 95 grader Celsius i fem minutter for at protese RNA. Derefter straks placere rørene på is og inkubere i mere end to minutter.Syntetisere cDNA ved hjælp af en omvendt transskription kit. Der tilsættes fire mikroliter denatureret viral RNA-opløsning til et PCR-rør, der indeholder 16 mikroliter reaktionsblanding, og bland det omhyggeligt med en pipette for ikke at generere bobler. Efter spinding ned rørene, udføre den omvendte transskription med en thermocycler.For kvantitativ PCR anvendes en quencher-indsættende sonde, der er rettet mod 963 til 1 049-regionen i NSP3-genomsegmentet af rotavirus. Serielt fortynde standard plasmid med PCR-grade vand, og fortsæt med at gøre master mix for kvantitative PCR. Tilføj 20 mikroliter af master mix til brøndene i en 96-brønd PCR plade.Bland derefter fem mikroliter af cDNA prøver eller fem mikroliter af standard plasmid ved pipettering 10 gange. Udfør kvantitativ PCR i henhold til betingelserne i tekstprotokollen. Endelig beregnes det rotavirusgenom, der er bundet til MA104-celleoverfladen som beskrevet i tekstprotokollen.Vist her er en vækstkurve af rotavirus. Ved at anvende den mindst firkantede metode på en modificeret Gompertz-model skønnes den specifikke vækstrate at være 0,197, og forsinkelsesperioden skønnes at være 6,61 timer. Den relative virustinde i den stationære fase til den oprindelige titer er 3.15.Af de seks testede rotaviruskloner varierede de anslåede værdier af den specifikke vækstrate fra 0,19 til 0,27. Disse anslåede værdier er pålidelige, fordi bestemmelseskoefficienten i modelmonteringen er mere end 0,98. Resultatet af den cellebindende analyse vises som bindende effektivitet, som er forholdet mellem bundne viruspartikler og dem, der findes i inokulumet.Vores RV virions binding til celleoverflader er omkring 10,000 kopier pr. milliliter med en bindende effektivitet på omkring 1%, når du bruger en 24-brønd plade til cellebindende analysen. Da dyrkede celler er følsomme over for fysiske belastninger, passe på at hælde buffer og agar forsigtigt, men hurtigt. I bund og grund er der indført et nyt system for virus.Ved hjælp af dette system kan vi evaluere den reelle cellebindingsevne og specifikke vækstrate med instrumenter. Vores protokol er fordelagtig i målingen af fænoypiske træk. Ved at kontrollere forskellige af nyligt emergente stammer, kan du hjælpe med at evaluere sine nye vacciner til virus.Vira er udpeget som BSL-2 patogener, så du bliver nødt til at forberede BSL-2 eksperimentelle rum til at udføre denne procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Assays til identifikation af nye Antivirale mod bluetonguevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: High-throughput Kvantificering af Colony vækst og Latenstid

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-medieret Isotermisk Amplification (lampe) assays til Art-specifik påvisning af<em&gt; Eimeria</em&gt; Der inficerer Kyllinger

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Parvis Growth Konkurrence Assay til Bestemmelse af Replication Fitness af Human Immunodeficiency Virus

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Tidlig Virale Adgangskrav Analyser for identifikation og evaluering af antivirale forbindelser

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative Analyser for påvisning og karakterisering af Protein Antimikrobielle stoffer

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Hurtig og konkret vurdering af halogeneringsmidlet peroxidaseaktivitet i leukocytberigede blodprøver

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Assays til at studere rollen, som Vitronectin i bakteriel adhæsion og Serum modstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...