Name: assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00
Duration: 10 min 49 s
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Ce travail a été soutenu par « L’assainissement valeur chaîne : conception assainissement systèmes comme éco-communauté valeur System » projet, recherche pour l’humanité et la Nature (RIHN, projet No.14200107).

1. préparation moyenne
<ol><li>Pour rendre un milieu de culture cellulaire (milieu contenant du sérum), ajoutez 4.7 g de poudre MEM d’aigle dans 500 mL d’eau distillée. Autoclave à 120 ° C pendant 20 min et laissez le refroidir moyens à température ambiante. Ajouter de sérum de veau fœtal (concentration finale : 10 %), L-Glutamine (2 mM), la pénicilline, streptomycine (1 %) et le bicarbonate de sodium (1,125 g/L). Conserver à 4 ° C pendant 1 mois.</li>
	<li>Préparer le milieu sans sérum pour la propagation de virus tel que décrit à l’étape 1.1, mais sans le sérum de veau fœtal. Conserver à 4 ° C pendant 1 mois.</li>
	<li>Pour l’essai de plaque, stériliser 100 mL de milieu MEM de Eagle (ne contenant pas le rouge de phénol) à l’autoclave. Laisser le milieu refroidir à température ambiante, puis ajouter 2 % FBS, 2 % pénicilline streptomycine, 4 mM de L-Glutamine et 2,25 g/L de NaHCO3. Conserver à 4 ° C.</li>
	<li>Pour l’essai de plaque, stériliser 100 mL de gel d’agarose 2.5 % par autoclave. Préparer le gel le même jour, que l’essai de plaque est réalisée. Stocker le gel à 47 ° C dans un bain d’eau.</li>
</ol>2. Culture cellulaire
<ol><li>Supprimer un cryotube contenant des lignées cellulaires MA104 du contenant de l’azote liquide. Placez le cryotube dans un bain-marie à 37 ° C à dégeler les cellules. Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire dans 20 mL de milieu contenant du sérum dans une fiole de T75. Incuber le flacon dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 2 ou 3 jours. Remarque : La concentration de la dernière cellule dans la suspension est environ 106 cellules/mL.</li>
	<li>Une fois que la monocouche cellulaire atteint 80 % confluence, éliminer le surnageant et laver les cellules deux fois avec 5 mL de 1 x PBS de Dulbecco (tamponné phosphate salin).</li>
	<li>Ajouter 4 mL de 0.05 % trypsine-EDTA au ballon et incuber à 37 ° C pendant 5 min détacher les cellules de la fiole. Transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger à 190 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules granulés (106 cellules) dans 1 mL de 1.1 préparés en moyenne contenant du sérum. Diluer les cellules resuspendues à 100 fois avec le milieu.</li>
	<li>Ajouter 3 mL de la suspension cellulaire dilué dans chaque puits de 6 puits (pour l’essai de plaque) ou plaques 24 puits (pour l’essai de liaison de cellule), respectivement. Incuber les boîtes dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 en vertu de la vapeur saturée pendant 2 ou 3 jours. Remarque : Une fiole T75 est conçue pour recueillir des échantillons de temps parce que le volume de l’échantillon du surnageant (1 mL) peut être ignoré par rapport au volume total de surnageant (30 mL). Pendant ce temps, le titre infectieux du virus dans chaque surnageant est mesuré par l’essai de plaque, qui est généralement réalisée à l’aide d’une plaque 6 puits. Une plaque 24 puits est utilisée pour le dosage de la liaison de cellule.</li>
</ol>3. taux de croissance spécifique du Rotavirus
Remarque : Rotavirus rhésus (RRV, génotype : G3P[3]) est utilisé dans le présent protocole car RRV peut rapidement et facilement former des plaques avec des cellules MA104.
<ol><li>Place un tube contenant 1 mL de la suspension virale (7 10 UFP/mL) dans un milieu sans sérum stockée à-80 ° C dans un bain-marie à 37 ° C à dégeler. Ajouter 1 µg/µL la trypsine du pancréas porcin à 1 mL de la suspension virale (concentration finale de la trypsine est 4 µg/mL), puis vortexer. Incuber la suspension virale à 37 ° C et 5 % de CO2 en vertu de la vapeur saturée pendant 30 min. Remarque : La trypsine provenant des autres sources peut être utilisée, mais l’effet sur l’infectivité antirotavirus doit être testé à l’avance.</li>
	<li>Diluer la suspension de virus activés avec un milieu sans sérum pour ajuster la multiplicité d’infection (MOI) à 0,1 pfu/cellule.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de suspension virale dilué aux lignées de cellules MA104 (confluent de 80 %) dans une fiole de T75 3 jours après la cellule électrodéposition (2.1), incuber à 37 ° C pendant 1 h et agiter doucement le flacon toutes les 15 min.</li>
	<li>Puis, ajouter 30 mL d’un milieu sans sérum contenant 0,13 µg/mL de trypsine du pancréas porcin dans le ballon. Incuber le ballon à 37 ° C et 5 % de CO2 en vertu de la vapeur saturée.</li>
	<li>Collecter 1 mL du surnageant dans le ballon à 0, 6, 12, 18, 24 et 36 (ou 48) h après l’infection (hpi) et remplacer le liquide surnageant dans les tubes de 1,5 mL à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Procéder au gel (-80 ° C) et faire fondre au bain-marie à 37 ° C cycle trois fois. Puis centrifuger les tubes à 12 600 x g pendant 10 min à 4 ° C. Recueillir le liquide surnageant.</li>
	<li>Filtrer le liquide surnageant avec un filtre de distillée 0,2 µm pour éliminer la fraction cellulaire. Conserver le surnageant-80 ° C dans le réfrigérateur jusqu'à l’appliquant à l’essai de plaque pour mesurer le titre du virus.</li>
	<li>Placer les tubes contenant le liquide surnageant collecté (étape 3.5) dans un bain-marie à 37 ° C. Ajouter 4 trypsine µg/mL à un 1 mL d’échantillon dilué 10 fois et incuber à 37 ° C pendant 30 min.</li>
	<li>Au cours de l’incubation de 30 min à 3,8, pour commencer l’essai de plaque pour mesurer le titre virus obtenu à partir d’échantillons de cours temps (étape 3.5), laver les cellules de MA104 deux fois dans une plaque 6 puits avec 2 mL de solution 1 PBS x après avoir enlevé le milieu contenant du sérum.</li>
	<li>En série, diluer les échantillons incubés avec un milieu sans sérum et ensemencer 1 mL de l’échantillon dilué dans chaque puits. Incuber les plaques pendant 90 min à 37 ° C et 5 % de CO2 en vertu de la vapeur saturée et secouez légèrement la plaque toutes les 15 min.</li>
	<li>Après incubation, retirer l’inoculum de la plaque de 6 puits. Ajouter 4 trypsine µg/mL dans le milieu préparé (étape 1.3). Doucement, mais immédiatement ajouter 3 mL de milieu mélangé avec du gel d’agarose (le ratio est de 1:1) dans chaque puits.</li>
	<li>Maintenir la plaque à température ambiante pendant plus de 10 min (jusqu'à ce que le gel d’agarose devient solid) et incuber pendant 2 jours à 37 ° C et 5 % de CO2 en vertu de la vapeur saturée. Remarque : Versez le milieu mélangé avec agar du bord du puits.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de la solution de rouge neutre de 0,015 % diluée avec 1 x PBS dans chaque puits et incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 en vertu de la vapeur saturée. Enlever la teinture après 3 h et incuber pendant 1 jour à 37 ° C et 5 % de CO2 en vertu de la vapeur saturée.</li>
	<li>Le lendemain, compter le nombre de plaques dans chaque puits et calculer l’UFP/mL. Vérifiez soigneusement la confluence de la cellule avant l’essai de plaque pour assurer le nombre de plaques.</li>
</ol>4. cellule-liaison Assay
Remarque : Ce protocole est basé sur rapport13 de Gilling.
<ol><li>Ajouter 1 µg/µL la trypsine du pancréas porcin à 1 mL de la suspension virale (concentration finale de la trypsine est 4 µg/mL), puis vortex (de la même manière qu’en 2.1). Diluer la suspension virale avec un milieu sans sérum pour ajuster le ministère de l’intérieur de 1 pfu/cellule.</li>
	<li>Ensuite, laver les cellules MA104 deux fois sur la plaque 24 puits avec 1 ml de tampon Tris salin (SCT ; base de 2,53 g/L Tris, 6,54 g/L de NaCl, 0,3 g/L de KCl, 0,046 g/l Na2HPO4 pour atteindre 1 L avec de l’eau distillée).</li>
	<li>Ensemencer 100 µL de la suspension du virus dilué dans chaque puits d’une plaque 24 puits avec des cellules et incuber à 4 ° C pendant 90 min, en agitant doucement toutes les 15 min.</li>
	<li>Retirez l’inoculum de virus et laver les cellules deux fois avec 1 mL du SCT. Pour extraire le double-brin (ds) RNA du rotavirus, ajouter 140 µL de 1 x PBS et 560 µL de tampon d’extraction de la RNA (voir Table des matières) dans chaque puits. Mélangez bien avec une pipette (environ 10 x ou jusqu'à ce que la brume ou le contaminant des cellules dans la mémoire tampon n’est pas vu).</li>
	<li>Après avoir récupéré l’ARN double brin (dsRNA) selon le protocole du fabricant, placer les tubes de 1,5 mL contenant l’extrait de dsRNA sur un bloc chauffant à 95 ° C pendant 5 min à dénaturer l’Arndb, immédiatement placer les tubes sur la glace, puis incuber pendant plus de 2 min.</li>
	<li>Faire la synthèse de l’ADNc en utilisant une transcriptase inverse nécessaire (voir la Table des matières). Ajouter 4 µL de solution de RNA virale dénaturée dans un tube PCR contenant 16 µl du mélange (tableau 1) et mélanger soigneusement avec une pipette de manière à ne pas générer des bulles. Tournez en bas des tubes.</li>
	<li>Effectuer la transcription inverse avec un thermocycleur dans les conditions indiquées au tableau 2. Si l’ADNc n’est pas utilisé immédiatement, ranger le tube PCR contenant l’ADNc à-20 ° C pendant 1 an.</li>
	<li>Utiliser les amorces pour la PCR quantitative (avant 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', inverses ; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 et une sonde d’insertion d’un extincteur (qPCR sondes ; 5'- / FAM/ATGAGCACA/extincteur/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA /-3'), ciblant les 963 – région de 1049 du segment du génome NSP3 du rotavirus (souche ST3, GenBank : X81436). NOTE : Quencher est inséré dans la sonde conçue par Zeng et coll.14
</li>
	<li>Diluer le plasmide standard en série (101 106 copies/ml) avec PCR de grade d’eau pour le mélange de qPCR (tableau 3) et faire des master mix (20 µL/échantillon) pour qPCR suivant tableau 4.</li>
	<li>Ajouter 20 µL du mélange maître dans le puits d’une plaque PCR 96 puits et mélanger puis 5 µL d’échantillons de cDNA ou 5 µL du plasmide standard en pipettant également 10 fois. Démarrer la réaction de l’installation de qPCR selon les modalités indiquées dans le tableau 4.</li>
	<li>Pour calculer le génome de rotavirus lié à la surface des cellules MA104, effectuer une régression linéaire entre les valeurs de Ct et le nombre de génomes connus d’un plasmide standard et d’estimer le nombre de génome de l’échantillon. Puis calculer le ratio de liaison numéros virion aux cellules (G,t) à ceux de l’inoculum initial (G0).</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Notre protocole pour mesurer le taux de croissance spécifique est plus facile que les précédents et peut être adapté pour d’autres virus, à moins que leur système de culture cellulaire n’a pas encore été établie. Dans cette étude, nous avons utilisé RRV (G3P[3]) car cette souche peut former des plaques plus facile que les rotavirus humains lors de l’utilisation de lignées cellulaires MA104. Certaines souches de rotavirus humain ne peuvent pas constituer la plaque dans cette lignée cellulaire. Donc, au lieu de l’essai de plaque, l’accent formant unité (FFU) dosage15 ou médiane vitroplants dose infectante (dict50) dosage peut être appliqué pour bon nombre de souches de rotavirus16. Le protocole présenté pour déterminer le taux de croissance spécifique peut être utilisé pour d’autres types de virus, mais ne convient pas pour les virus pour lesquels aucun système de culture cellulaires établies n’est établi. Avant de commencer l’expérience pour le taux de croissance spécifique, il vaut mieux savoir à l’avance quand le titre infectieux du virus commence à augmenter et atteint la phase stationnaire lors d’un essai préliminaire. Si trop de plaques sont présents, l’essai de plaque se fasse à nouveau après la modification du taux de dilution des échantillons de virus. La heures après l’infection (hpi) pour prélever des échantillons sont également importantes car la pente de la phase exponentielle de croissance peut être sous-estimée si le point de bonne heure pour atteindre la phase stationnaire est manqué. Dans l’approximation de la mis à jour le modèle de Gompertz, un coefficient de détermination devrait toujours être calculé et vérifié. Si la remise en forme à la mis à jour le modèle de Gompertz est faible, les autres modèles de croissance tels que le modèle logistique mis à jour le12 peuvent être préférables.
Dans le traitement de cellules, lorsque vous retirez l’inoculum de moyen ou d’un virus, le PBS pour le gel de lavage ou d’agarose pour l’analyse de la plaque doit être rapidement ajouté à chacune d’une plaque de culture cellulaire afin d’empêcher les cellules de la sécheresse. Dans le même temps, vous devez verser doucement PBS ou agarose à cellules ne pas à se détacher des puits. Cette étape est la plus importante dans les deux tests (étape 3.9 et 3.11). Si l’essai de plaque a beaucoup trop d’échantillons, nous vous recommandons de subdiviser le gel d’agarose (100 mL chaque maximum est recommandé) en plusieurs bouteilles moyennes et garder les bouteilles au chaud jusqu'à ce que juste avant l’utilisation depuis agarose gel est solidifié dans environ 10 min à la chambre température. Étant donné que la trypsine est vulnérable à des températures élevées17, une solution de trypsine devrait figurer dans un milieu et d’agarose pour l’essai de plaque après refroidissement adéquatement.
Dans l’analyse de liaison de cellule, l’incubation pour la liaison du virus aux cellules doit être faite à 4 ° C pour éviter toute invasion des cellules. Selon la méthode13, de Gilling les cellules sont sujettes à séchage à basse température, agitant doucement est nécessaire toutes les 15 min pendant l’incubation. Le kit d’extraction d’ARN utilisé ici peut être substitué pour d’autres kits. La pente de la courbe d’étalonnage en RT-qPCR devrait être environ 3.3, et le coefficient de détermination devrait être plus que 0,98. Par rapport à la microscopie à fluorescence pour visualiser la localisation du virus dans les cellules, l’essai est plus rapide et plus facile à utiliser parce que la liaison de substances fluorescentes de virus n’est pas nécessaire.
Récemment, des enteroid intestinale humaine (HIE), présentant une composition cellulaire similaire et une fonction comme l’épithélium gastro-intestinal humain, est devenu disponible pour rotavirus propagation18. L’utilisation de HIE peut nous permettre d’évaluer le taux de croissance spécifique et la capacité de liaison de cellule non cultivables souches de rotavirus. En outre, les deux expériences décrites ici peuvent être appliqués à l’évaluation des effets des médicaments sur les deux phénotypes19. Les protocoles présentés ici permettent de discuter quantitativement les changements de valeurs de paramètre du phénotype des souches de rotavirus dans diverses conditions.

Les virus à ARN forment une population génétiquement diverse, connue comme les quasi-espèces1, en raison de leur taux de mutation,2 qui est supérieur à celui des organismes basés sur l’ADN. Structure de la population dans les quasi-espèces est affectée par les facteurs génétiques de la population, y compris la mutation, la pression de sélection et la dérive génétique. Au sein d’une seule lignée génétique des souches peuvent présenter différents phénotypes en raison de la diversité génétique. Par exemple, Yelena et coll. ont montré que la sensibilité de chlore libre était différente parmi les souches de norovirus murin qui proviennent d’une souche purifiés par plaque S7-PP33.
Rotavirus (rotavirus de genre dans la famille des reoviridae) sont des virus non enveloppé ds RNA formant les quasi-espèces2. Outre les facteurs génétiques de la population décrites ci-dessus, un réassortiment du génome affecte la diversité génétique du rotavirus parce que ce virus a 11 génomes segmenté4. Rotavirus causent la diarrhée chez les nourrissons, et les décès infantiles en 2013 ont été estimées à environ 250 0005. Deux vaccins sont utilisés dans plusieurs pays et ont été efficaces pour réduire la charge de l’infection à rotavirus, mais certains chercheurs sont maintenant discuter de la présence de vaccin-escape mutants6,7,8, 9. la caractérisation des mutants est importante de comprendre les mécanismes de vaccin-s’échapper.
Nous présentons ici les protocoles pour deux essais pour évaluer le taux de croissance spécifique et la capacité de liaison de cellule du rotavirus afin de comprendre les différences phénotypiques entre les souches/des mutants. La courbe de croissance de rotavirus a été présentée dans précédents rapports10, mais les paramètres de croissance tels que le taux de croissance spécifique ne sont pas habituellement mesurés. Un essai de liaison cellulaire effectué précédemment implique par immunofluorescence technique coloration11. Nous montrons ici des méthodes plus faciles d’utiliser le dosage de la plaque et de la RT-qPCR, qui permettent de discuter quantitativement la différence dans les phénotypes virales. Ces méthodes sont appropriées pour la caractérisation des phénotypes de rotavirus et peuvent enfin participer à la construction de nouveaux vaccins efficaces pour plusieurs génotypes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7500 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-EPI</td>
			<td>Nakalai Tesque, Inc</td>
			<td>01101-34</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>194-02875</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05900</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05901</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward / Reverse primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>140-00932</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-) &#34;Nissui&#34;</td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05913</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liguid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR039A</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR037A</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52904</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>199-05985</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>198-01675</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 6-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancrease</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0303-1G</td>
			<td>Activate for rotavirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus

Le rotavirus est le principal facteur étiologique de la diarrhée infantile. C’est un virus à ARN double brin (ds) et forme une population génétiquement diverse, appelée les quasi-espèces, en raison de leur taux élevé de mutations. Ici, nous décrivons comment mesurer le taux de croissance spécifique et la capacité de liaison de cellule du rotavirus comme ses phénotypes. Rotavirus est traitée avec de la trypsine de reconnaître le récepteur des cellules et ensuite inoculé dans la culture de cellules MA104. Le surnageant, y compris les progénitures virales, est recueilli par intermittence. L’essai de plaque sert à confirmer le titre du virus (unité de formation de plaques : pfu) de chaque liquide surnageant collecté. Le taux de croissance spécifique est estimé en ajustant les données de temps de l’UFP/mL et la mis à jour le modèle de Gompertz. Dans l’analyse de liaison de cellule, cellules MA104 dans une plaque 24 puits sont infectés par un rotavirus et incubés pendant 90 min à 4 ° C pour l’adsorption de rotavirus aux récepteurs cellulaires. Une température basse retient rotavirus d’envahir la cellule hôte. Après le lavage pour enlever des virions non liées, l’ARN est extrait de virions attachées aux récepteurs cellulaires, suivies de la synthèse de cDNA et PCR quantitative de transcription inverse (RT-qPCR). Ces protocoles peuvent être appliquées pour étudier les différences phénotypiques entre les souches virales.

Un aperçu des deux protocoles pour le taux de croissance spécifique et l’analyse de cellule-fixation de plaque-purifiée souches RRV est montré à la Figure 1 a et 2 a, respectivement.
Dans l’analyse du taux de croissance spécifique, le titre final virus atteint plus de 107 UFP/mL lors de la propagation sur la fiole T75. Si la concentration maximale est inférieure à 107 UFP/mL, la cellule MA104 ne peut-être devenir confluente ou RRV n’était pas activé par la trypsine. Certains modèles de croissance sont disponibles pour estimer le taux de croissance spécifique en utilisant les données de l’unité infectieuse. Dans ce protocole, le modèle de Gompertz mis à jour le12 est employée à titre d’exemple ; <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
où N0 (104 UFP/mL dans cette étude) et Nt (104 à 108 UFP/mL) sont le titre infectieux du virus (UFP/mL) à 0 et t (exemple : 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, respectivement, A est la valeur asymptotique [log (N∞/n0 )] (exemple : 3 à 4), µ est le taux de croissance spécifique [1/h], e est constante de Napier et λ est la période de latence [h]. Paramètres du modèle sont obtenus par la fonction solveur du logiciel d’analyse, ce qui minimise la somme des carrés des différences entre les valeurs observées et modélisées. Dans l’exemple de la Figure 1 b, le taux de croissance spécifique (µ) est estimé à 0,197 [1/h] et la période de latence (λ) est 6,61 [h] en appliquant la méthode des moindres carrée à un mis à jour le modèle de Gompertz et le titre de virus relatif à la phase stationnaire de la (titre initial échelle des journaux) (A) est de 3.15 [log (∞de N/n (0)]. Nous avons testé les 6 clones de rotavirus au total, et les valeurs estimées du taux de croissance spécifique variaient de 0,19 à 0,27 [1/h]. Ces estimations de valeurs sont fiables, car le coefficient de détermination des valeurs dans l’ajustage de précision de modèle est plus que 0,98.
RRV virions liaison à surfaces cellulaires sont environ 103 copies/mL (liant efficacité était d’environ 1 %) lorsque vous utilisez une plaque 24 puits pour le dosage en liant le cellulaire (Figure 2 b). Le dosage est généralement mené trois fois pour chaque échantillon, et si un écart important dans le nombre de copies est observé dans un échantillon, certains problèmes tels que l’activation trop lavage et insuffisante du RRV par la trypsine peuvent survenir. La valeur de Ct de qPCR dépassant environ 36,0 n’est pas préférable et est considérée comme inférieur à une limite de détection dans notre condition de qPCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volume / 1 réaction</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x PrimeScript tampon</td>
			<td>4,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript RT Enzyme Mix j’ai</td>
			<td>1,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo dT Primer</td>
			<td>1,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 mers aléatoires</td>
			<td>4,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau distillée désionisée</td>
			<td>6.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>échantillon d’ARN à simple brin</td>
			<td>4,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>20,0 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Master mix composition pour la synthèse de cDNA du génome de rotavirus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Température [° C]</td>
			<td>Temps</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : État de réaction pour la synthèse de cDNA du génome de rotavirus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volume/1 réaction</td>
		</tr>
<tr>
<td>Prémélange Taq</td>
			<td>12,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Apprêt avant (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inverser l’amorce (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonde (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Référence Dye II</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau distillée désionisée</td>
			<td>5.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>échantillon d’ADNc</td>
			<td>5,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>25 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Master mix composition pour PCR quantitative du rotavirus un génome.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Température [° C]</td>
			<td>Temps</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">cycle de 45</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : Condition de réaction PCR quantitative du rotavirus un génome.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> Figure 1 : aperçu schématique de l’estimation de la croissance de rotavirus et la courbe de croissance du rotavirus. (A) l’unité infectieuse du rotavirus est mesurée avec l’essai de plaque. (B) la courbe (ligne bleue) a été approchée par le mis à jour le modèle de Gompertz basé sur des données observées dans notre laboratoire (cercle blanc). Le taux de croissance spécifique [µ] ; 0,197 [h-1], lag période (λ) ; 6,61 [h], le titre virus relatif à la phase stationnaire au titre initial (échelle logarithmique) (A) ; 3.15 [log (∞de N/n (0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> Figure 2 : aperçu schématique et résultat représentatif de l’essai de liaison cellulaire de cinq souches RRV purifiée à partir de plaques dans notre laboratoire. Plaque de culture cellulaire (A) A inoculé par un rotavirus est incubée à 4 ° C pour empêcher l’invasion de virus dans les cellules. Après incubation et enlever les particules virales non liés aux cellules, quantifier le nombre de génomes provenant des particules virales liés à la surface de la cellule avec la RT-qPCR. (B), le résultat de la cellule-liaison dosage s’affichait comme liant de rendement (%), qui était le taux de particules virales liées à celles présentes dans l’inoculum. Bar "BOLD" : médian, fin des cases : déviation quartile, fin de ligne : maximum et minimum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Nous présentons ici deux protocoles, l’un pour mesurer le taux de croissance spécifique et l’autre pour la capacité de liaison de cellule du rotavirus à l’aide de l’essai de plaque et de la RT-qPCR. Ces protocoles sont disponibles pour confirmer les différences de phénotypes entre souches de rotavirus.

Dosages pour le taux de croissance spécifique et la capacité de liaison de cellule du Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

À l’aide des analyses présentées ici, la différence de phénotype entre les souches de rotavirus peut être évaluée, lorsque des souches uniques sont isolées. Plus précisément, le changement phénotypique des souches désinfectantes résistantes au rotavirus est étudié. Pour obtenir des extrants quantitatifs clairs à l’aide de l’analyse de la plaque, il est essentiel de choisir une combinaison appropriée de souche rotavirus et de sérum, dans laquelle le rotavirus est bien adapté au sérum.Syun-suke Kadoya, doctorant de mon laboratoire, démontrera la procédure. Retirez un CryoTube contenant des lignées cellulaires MA104 du contenant d’azote liquide. Placez le CryoTube dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pour décongeler les cellules.Ajouter un millilitre de la suspension cellulaire à 20 millilitres du milieu contenant du sérum dans un flacon T75. Incuber le flacon dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de CO2 pendant deux à trois jours. Une fois que le monocouche cellulaire atteint 80% de confluence, retirez le supernatant et lavez les cellules deux fois avec cinq millilitres de PBS de 1X Dulbecco.Ajouter quatre millilitres de 0,05% trypsine-EDTA à la fiole, et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour détacher les cellules de la fiole. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et la centrifugeuse à 190 g pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules granulées dans un millilitre de milieu contenant du sérum.Ensuite, diluer les cellules résuspendées 100 fois avec le milieu. Ajouter trois millilitres de suspension cellulaire diluée à chaque puits d’une plaque de six puits pour l’analyse de la plaque. Ajouter un millilitre de suspension cellulaire diluée à chaque puits d’une plaque de 24 puits pour l’analyse de liaison cellulaire.Incuber les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de vapeur sous-saturée de CO2 pendant deux ou trois jours. Transférer un tube contenant un millilitre de la suspension virale dans un milieu sans sérum de stockage à moins 80 degrés Celsius à un bain d’eau de 37 degrés Celsius pour décongeler. Ajouter un microgramme par microlitre de trypsine du pancréas porcin à un millilitre de la suspension du virus, puis vortex.Incuber la suspension virale à 37 degrés Celsius et 5% de vapeur sous-saturée de CO2 pendant 30 minutes. Diluer la suspension virale activée avec un milieu sans sérum pour ajuster la multiplicité de l’infection, ou MOI, à 0,1 pfu par cellule. Ajouter un millilitre de la suspension du virus dilué aux cellules MA104 dans un flacon T75 trois jours après le placage cellulaire.Incuber les cellules avec le virus à 37 degrés Celsius pendant une heure, en secouant doucement le flacon toutes les 15 minutes. Ajouter ensuite 30 millilitres d’un milieu sans sérum contenant quatre microgrammes par millilitre de trypsine du pancréas porcin au flacon. Incuber le flacon à 37 degrés Celsius et 5 % de vapeur sous-saturée de CO2.Recueillir un millilitre du surnatant dans le flacon à zéro, six, 12, 18, 24 et 36 heures après l’infection, et remplacer le supernatant dans les types de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette. Effectuer un cycle gel-dégel dans les 15 minutes à moins 80 degrés Celsius suivi d’une fonte de 15 minutes dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Puis centrifuger les tubes à 12 600 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Recueillir le surnatant. Filtrer le supernatant à l’aide d’un filtre distillé de 0,2 micron pour enlever la fraction cellulaire. Conserver le surnatant à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit appliqué sur l’essai de plaque pour mesurer le titer du virus.Lorsque vous êtes prêt à effectuer l’analyse de la plaque, placez les tubes contenant le supernatant recueilli dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Ajouter la trypsine à un millilitre d’échantillon dilué 10 fois et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant cette incubation de 30 minutes, lavez soigneusement les cellules MA104 dans une plaque de six puits avec deux millilitres de 1X PBS après avoir enlevé le milieu contenant du sérum.Diluer périodiquement les échantillons incubés avec un milieu sans sérum et inoculer un millilitre de l’échantillon dilué dans chaque puits. Incuber la plaque pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de vapeur sous-saturée de CO2, en secouant doucement la plaque toutes les 15 minutes. Après l’incubation, retirer l’inoculum de la plaque de six puits.Ajouter quatre microgrammes par millilitre de trypsine au milieu préparé. Ajouter délicatement mais immédiatement trois millilitres du milieu mélangés avec du gel d’agarose à chaque puits. Laisser le gel d’agarose se solidifier à température ambiante pendant plus de 10 minutes.Puis incuber la plaque pendant deux jours à 37 degrés Celsius et 5% de vapeur sous-saturée de CO2. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution rouge neutre de 0,015 % diluée avec 1X PBS à chaque puits, et incubez avec les mêmes conditions. Retirer le colorant au bout de trois heures et continuer à couver pendant une journée.Le lendemain, comptez le nombre de plaques dans chaque puits et calculez le pfu par millilitre. Vérifiez soigneusement la confluence cellulaire avant l’analyse de la plaque pour assurer les numéros de plaque. Pour l’analyse de liaison cellulaire, ajouter un microgramme par microlitre de trypsine d’un pancréas porcin à un millilitre de la suspension du virus, puis vortex.Diluer la suspension virale avec un milieu sans sérum pour ajuster le MOI à un pfu par cellule. Lavez les cellules MA104 deux fois dans une plaque de 24 puits avec un millilitre de solution saline tamponnée par tris. Maintenant inoculer les cellules avec 100 microlitres de suspension de virus dilué dans chaque puits de la plaque de 24 puits.Incuber la plaque à quatre degrés Celsius pendant 90 minutes avec des secousses douces toutes les 15 minutes. Enlevez l’inoculum du virus et lavez les cellules deux fois avec un millilitre de solution saline tamponnée par tris. Pour extraire l’ARN à double brin du rotavirus, ajouter 140 microlitres de 1X PBS et 560 microlitres du tampon d’extraction d’ARN à chaque puits.Mélanger adéquatement avec une pipette jusqu’à ce que la brume des cellules dans le tampon n’est pas vu. Après avoir récupéré l’ARN à double brin, selon le protocole du fabricant, placez les tubes de 1,5 millilitre, contenant l’extrait d’ARN à double brin, sur un bloc thermique à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour dénoturer l’ARN. Ensuite, placez immédiatement les tubes sur la glace et incubez pendant plus de deux minutes.Synthétiser l’ADN en utilisant un kit de transcription inversée. Ajoutez quatre microlitres de solution d’ARN viral dénaturé à un tube PCR contenant 16 microlitres de mélange de réaction, et mélangez-le soigneusement avec une pipette afin de ne pas générer de bulles. Après avoir tourné dans les tubes, effectuer la transcription inverse avec un thermocycleur.Pour le PCR quantitatif, utilisez une sonde d’insertion quencher ciblant la région 963 à 1 049 du segment du génome du NSP3 du rotavirus. Diluer en série le plasmide standard avec de l’eau de qualité PCR, et procéder à faire le mélange principal pour pcr quantitative. Ajouter 20 microlitres du mélange principal aux puits d’une plaque PCR de 96 puits.Mélangez ensuite cinq microlitres d’échantillons d’ADNC ou cinq microlitres du plasmide standard par pipetting 10 fois. Effectuez un PCR quantitatif selon les conditions du protocole texte. Enfin, calculer le génome du rotavirus lié à la surface de la cellule MA104 tel que décrit dans le protocole texte.On voit ici une courbe de croissance du rotavirus. En appliquant la méthode la moins carrée à un modèle Gompertz modifié, le taux de croissance spécifique est estimé à 0,197, et la période de décalage est estimée à 6,61 heures. Le titer relatif de virus à la phase stationnaire au titer initial est 3.15.Sur les six clones testés de rotavirus, les valeurs estimées du taux de croissance spécifique allaient de 0,19 à 0,27. Ces valeurs estimées sont fiables parce que le coefficient de valeurs de détermination dans le raccord du modèle est supérieur à 0,98. Le résultat de l’analyse de liaison cellulaire est affiché comme l’efficacité de liaison, qui est le rapport des particules virales liées à celles présentes dans l’inoculum.Nos virions rv se liant aux surfaces cellulaires sont d’environ 10 000 exemplaires par millilitre avec une efficacité de liaison d’environ 1% lors de l’utilisation d’une plaque de 24 puits pour l’analyse de liaison cellulaire. Puisque les cellules cultivées sont sensibles aux contraintes physiques, prenez soin de verser le tampon et l’agar doucement mais rapidement. Essentiellement, un nouveau système pour les virus a été introduit.En utilisant ce système, nous pouvons évaluer la capacité réelle de liaison cellulaire et le taux de croissance spécifique avec des instruments. Notre protocole est avantageux dans la mesure du trait phénotypique. En vérifiant différentes souches nouvellement émergentes, vous pouvez aider à évaluer ses nouveaux vaccins contre les virus.Les virus sont désignés comme pathogènes BSL-2, de sorte que vous devrez préparer des salles expérimentales BSL-2 pour effectuer cette procédure.

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