Name: assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00
Duration: 10 min 49 s
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Questo lavoro è stato supportato dal progetto "The Sanitation valore catena: progettazione di servizi igienico-sanitari sistemi come Eco-comunità valore sistema", ResearchInstitute per l'umanità e la natura (RIHN, progetto No.14200107).

1. preparazione media
<ol><li>Per rendere un terreno di coltura cellulare (contenenti siero medio), è necessario aggiungere 4,7 g di polvere MEM di Eagle a 500 mL di acqua distillata. Sterilizzare in autoclave a 120 ° C per 20 min e lasciare che le medie raffreddare a temperatura ambiente. Aggiungere siero bovino fetale (concentrazione finale: 10%), L-Glutammina (2 mM), penicillina streptomicina (1%) e bicarbonato di sodio (1,125 g/L). Conservare a 4 ° C per 1 mese.</li>
	<li>Preparare il medium privo di siero per la propagazione di virus, come descritto nel passaggio 1.1, ma senza il siero bovino fetale. Conservare a 4 ° C per 1 mese.</li>
	<li>Per il dosaggio di placca, sterilizzare in autoclave 100 mL di medium di MEM di Eagle (non contenente rosso fenolo). Lasciate che il mezzo raffreddare alla temperatura ambiente e quindi aggiungere 2% FBS, 2% penicillina streptomicina, 4 mM L-Glutammina e 2,25 g/L di NaHCO3. Conservare a 4 ° C.</li>
	<li>Per il dosaggio di placca, sterilizzare 100 mL di gel di agarosio al 2,5% in autoclave. Preparare il gel lo stesso giorno che il saggio della placca è condotto. Conservare il gel a 47 ° C in un bagno d'acqua.</li>
</ol>2. coltura cellulare
<ol><li>Rimuovere un stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA contenente linee cellulari MA104 dal contenitore di azoto liquido. Posizionare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA in un bagno di acqua a 37 ° C per scongelare le cellule. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare per 20 mL di terreno contenenti siero in una boccetta di T75. Incubare la beuta in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per 2 o 3 giorni. Nota: La concentrazione finale delle cellule in sospensione è circa 106 cellule/mL.</li>
	<li>Una volta che il monostrato cellulare raggiunge 80% confluency, eliminare il surnatante e lavare le cellule due volte con 5 mL di 1 x PBS di Dulbecco (tamponato fosfato salino).</li>
	<li>Aggiungere 4 mL di tripsina-EDTA 0,05% al pallone e incubare a 37 ° C per 5 min staccare le cellule dal pallone. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare a 190 x g per 5 min.</li>
	<li>Eliminare il supernatante e risospendere le cellule pellettate (106 cellule) in 1 mL di siero contenente medio preparato in 1.1. Diluire le cellule sedimento alle 100 volte con il mezzo.</li>
	<li>Aggiungere 3 mL di sospensione cellulare diluito in ciascun pozzetto di 6 pozzetti (per il dosaggio di placca) o piastre da 24 pozzetti (per il dosaggio di cella-associazione), rispettivamente. Incubare le piastre in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2 sotto il vapore saturo per 2 o 3 giorni. Nota: Una boccetta di T75 è adatta raccogliere i campioni di corso di tempo perché il volume del campione del surnatante (1 mL) può essere ignorato rispetto al volume totale di surnatante (30 mL). Nel frattempo, il titolo infettivo del virus in ogni supernatante viene misurato dall'analisi della placca, che è solitamente condotto utilizzando una piastra a 6 pozzetti. Una piastra a 24 pozzetti è utilizzata per il dosaggio di cella-associazione.</li>
</ol>3. tasso di crescita specifiche del Rotavirus
Nota: Rotavirus rhesus (RRV, genotipo: G3P[3]) è utilizzata in questo protocollo perché RRV possono formare placche con cellule MA104 rapidamente e facilmente.
<ol><li>Posto una provetta contenente 1 mL di sospensione di virus (107 pfu/mL) in un medium senza siero conservato a-80 ° C in bagnomaria a 37 ° C per lo scongelamento. Aggiungere 1 µ g / µ l tripsina da pancreas suino a 1 mL della sospensione di virus (concentrazione finale di tripsina è 4 µ g/mL) e poi vortice. Incubare la sospensione di virus a 37 ° C e 5% CO2 sotto il vapore saturo per 30 min. Nota: Tripsina dalle altre fonti può essere utilizzata, ma l'effetto sull'infettività rotavirus deve essere testato in anticipo.</li>
	<li>Diluire la sospensione di virus attivato con un medium senza siero per regolare la molteplicità di infezione (MOI) a 0,1 pfu/cella.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di sospensione di virus diluito a linee cellulari MA104 (80% confluenti) in un matraccio da T75 3 giorni dopo la cella placcatura (2.1), incubare a 37 ° C per 1 h e agitare delicatamente il matraccio ogni 15 min.</li>
	<li>Quindi, aggiungere 30 mL di un mezzo privo di siero contenente 0.13 µ g/mL di tripsina da un pancreas suino al pallone. Incubare la beuta a 37 ° C e 5% CO2 sotto il vapore saturo.</li>
	<li>Raccogliere 1 mL del surnatante in un matraccio a 0, 6, 12, 18, 24 e 36 (e/o 48) h post-infettiva (hpi) e sostituire il surnatante nelle provette da 1,5 mL utilizzando una pipetta.</li>
	<li>Condurre il congelamento (-80 ° C) e si fondono in un bagno di acqua a 37 ° C ciclo tre volte. Poi Centrifugare le provette a 12.600 x g per 10 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante.</li>
	<li>Filtrare il surnatante con un filtro da 0,2 µm distillata per rimuovere la frazione di cella. Conservare il surnatante-80 ° C in frigorifero fino a quando l'applicazione per l'analisi della placca per la misurazione il titolo del virus.</li>
	<li>Disporre le provette contenenti il surnatante raccolto (passo 3.5) in un bagno di acqua a 37 ° C. Aggiungere 4 tripsina µ g/mL a un 1 mL del campione diluito 10 volte e incubare a 37 ° C per 30 min.</li>
	<li>Durante l'incubazione di 30 min a 3.8, per iniziare l'analisi della placca per la misurazione il titolo del virus ottenuto da campioni di tempo corso (passo 3.5), lavare le cellule MA104 due volte in una piastra a 6 pozzetti con 2 mL di PBS 1x 1 dopo aver tolto il mezzo contenente siero.</li>
	<li>In serie di diluire i campioni incubati con un medium senza siero e inoculare 1 mL del campione diluito in ciascun pozzetto. Incubare la piastra per 90 min a 37 ° C e 5% CO2 sotto il vapore saturo e scuotere delicatamente la piastra ogni 15 min.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, rimuovere l'inoculo dal piatto 6 pozzetti. Aggiungere 4 tripsina µ g/mL per il mezzo preparato al (punto 1.3). Delicatamente ma immediatamente aggiungere 3 mL di terreno miscelato con gel di agarosio (il rapporto è 1:1) in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Tenere la piastra a temperatura ambiente per più di 10 min (fino a quando il gel dell'agarosi diventa solido) e incubare per 2 giorni a 37 ° C e 5% CO2 sotto il vapore saturo. Nota: Versare il medio miscelato con agar dal bordo del pozzo.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL della soluzione rosso neutro 0.015% diluita con 1x PBS in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C e 5% CO2 sotto il vapore saturo. Rimuovere il colorante dopo 3 h e incubare per 1 giorno a 37 ° C e 5% CO2 sotto il vapore saturo.</li>
	<li>Il giorno successivo, contare il numero delle placche in ciascun pozzetto e calcolare la pfu/mL. Controllare attentamente la confluenza di cella prima del dosaggio di placca per assicurare i numeri di targa.</li>
</ol>4. cell-associazione Assay
Nota: Questo protocollo è basato su relazione13 di Gilling.
<ol><li>Aggiungere 1 µ g / µ l tripsina da un pancreas suino a 1 mL della sospensione di virus (concentrazione finale di tripsina è 4 µ g/mL) e poi vortice (nello stesso modo come in 2.1). Diluire la sospensione di virus con un medium senza siero per regolare il MOI di 1 pfu/cella.</li>
	<li>Quindi, lavare le cellule MA104 due volte su piastra a 24 pozzetti con 1 ml di soluzione fisiologica tamponata (TBS; 2,53 g/L Tris base, 6,54 g/L NaCl, KCl, 0,3 g/L 0,046 g/l, Na2HPO4 raggiungere 1 L con acqua distillata).</li>
	<li>Inoculare 100 µ l di sospensione di virus diluito in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con cellule e incubare a 4 ° C per 90 min, con agitazione delicata ogni 15 min.</li>
	<li>Rimuovere l'inoculo di virus e lavare le cellule due volte con 1 mL di TBS. Per estrarre la doppia elica (ds) RNA il rotavirus, aggiungere 140 µ l di PBS: 1x e 560 µ l di tampone di estrazione RNA (Vedi Tabella materiali) in ciascun pozzetto. Mescolare adeguatamente con una pipetta (circa 10 volte o fino a quando la foschia o contaminante di cellule nel buffer non è visibile).</li>
	<li>Dopo aver recuperato il doppio incagliato RNA (dsRNA) secondo il protocollo del produttore, posizionare le provette da 1,5 mL contenente l'Estratto di dsRNA su un blocco di calore a 95 ° C per 5 min denaturare il dsRNA, quindi immediatamente mettere i tubi sul ghiaccio e incubare per più di 2 min.</li>
	<li>Sintetizzare il cDNA utilizzando una trascrizione inversa kit (Vedi Tabella materiali). Aggiungere 4 µ l di soluzione di RNA virale denaturato in una provetta PCR contenente 16 µ l di miscela (tabella 1) e mescolare accuratamente con una pipetta per non generare bolle. Rotazione verso il basso i tubi.</li>
	<li>Eseguire la trascrizione d'inversione con un termociclatore a condizione riportato nella tabella 2. Se il cDNA non viene utilizzato immediatamente, conservare la provetta PCR contenente il cDNA a-20 ° C fino a 1 anno.</li>
	<li>Utilizzare il primer per PCR quantitativa (Forward; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', Reverse; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 e una sonda inserendo un quencher (qPCR sonde; 5'- / FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA-3'), destinazione il 963 – regione di 1049 del NSP3 segmento di genoma di rotavirus (ST3 ceppo, GenBank: X81436). Nota: Quencher viene inserita la sonda progettata da Zeng et al.14
</li>
	<li>Diluire il plasmide standard in serie (101 106 copie/ml) con PCR grado acqua alla miscela qPCR (tabella 3) e rendere il mix master (20 µ l/campione) per qPCR seguendo la tabella 4.</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l di master mix nel pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti e poi mescolare 5 µ l di campioni di cDNA o 5 µ l di standard plasmide pipettando 10 volte. Avviare la reazione del sistema qPCR secondo le condizioni indicate nella tabella 4.</li>
	<li>Per calcolare il genoma di rotavirus associato alla superficie delle cellule MA104, regressione lineare tra i valori Ct e il numero di genoma noto di un plasmide standard di condotta e stimare numero di genoma del campione. Quindi calcolare il rapporto di associazione numeri virione alle cellule (Gt) a quelli di inoculo iniziale (G0).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rna+Virus+Mutations.">Rna Virus Mutations.</a> Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).</li><li>Gouvea, V., Brantly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+rotavirus+a+population+of+reassortants?.">Is rotavirus a population of reassortants?.</a> Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).</li><li>Rachmadi, A. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il nostro protocollo per misurare il tasso di crescita specifico è più facile di quelli precedenti e può essere adattato per altri virus a meno che il loro sistema di coltura cellulare non è ancora stata stabilita. In questo studio, abbiamo usato RRV (G3P[3]) perché questo ceppo può formare placche più facile che i rotavirus umani quando si utilizzano linee cellulari MA104. Alcuni ceppi di rotavirus umano non possono formare delle placche in questa linea cellulare. Pertanto, anziché il saggio della placca, la messa a fuoco che formano unità (FFU) dosaggio15 o mediana coltura tissutale dose infettiva (TCID50) test può essere applicato per molti ceppi di rotavirus16. Il protocollo presentato per determinare il tasso di crescita specifico può essere utilizzato per altri tipi di virus, ma non è adatto per i virus per i quali non è stabilito nessun sistema di coltura cellulare stabilito. Prima di iniziare l'esperimento per il tasso di crescita specifico, è meglio sapere in anticipo quando il titolo infettive del virus inizia ad aumentare e raggiunge la fase stazionaria in un test preliminare. Se troppi placche sono presenti, il saggio della placca dovrebbe essere condotto nuovamente dopo la modifica il tasso di diluizione dei campioni di virus. post-L'infezione ore (hpi) per raccogliere campioni sono importanti anche perché la pendenza della fase di crescita esponenziale può essere sottovalutata se il punto di tempo proprio per raggiungere la fase stazionaria è perso. Nell'approssimazione del modello modificato di Gompertz, un coefficiente di determinazione dovrebbe sempre essere calcolato e controllato. Se l'idoneità per il modello modificato di Gompertz è bassa, altri modelli di crescita come il modello logistico modificato12 possono essere preferibile.
Nella gestione delle cellule, quando si rimuove l'inoculo medio o virus, il PBS per lavaggio o dell'agarosi gel per saggio della placca deve essere prontamente aggiunto a ciascuno bene di una piastra di coltura delle cellule per impedire le cellule dalla secchezza. Allo stesso tempo, si deve versare delicatamente PBS o agarosio alle cellule di non staccare dai pozzi. Questo passaggio è il più importante in entrambe le analisi (passo 3.9 e 3.11). Se il saggio di placca ha troppi campioni, si consiglia di suddividere il gel di agarosio (100 mL ogni massima è consigliata) in diverse bottiglie medie e mantenere le bottiglie caldo fino appena prima dell'uso dal agarosio gel è solidificato all'interno di circa 10 min a camera temperatura. Poiché la tripsina è vulnerabile a alte temperature17, una soluzione di tripsina dovrebbe aggiungersi un medium ed agarosio per il saggio della placca dopo aver fatto raffreddare adeguatamente.
Nell'analisi della cella-associazione, l'incubazione per l'associazione del virus alle cellule deve essere fatto a 4 ° C per impedire l'invasione delle cellule. Secondo metodo13, di Gilling le cellule sono inclini a essiccazione a basse temperature, quindi agitazione delicata è necessaria ogni 15 minuti durante l'incubazione. Il kit di estrazione di RNA utilizzato qui può essere sostituito per altri kit. La pendenza della curva standard in RT-qPCR dovrebbe essere circa 3.3, e il coefficiente di determinazione dovrebbe essere più di 0.98. Rispetto al microscopio di fluorescenza per visualizzare la localizzazione del virus nelle cellule, il dosaggio è più rapida e più facile da usare perché l'associazione di sostanze fluorescenti ai virus non è necessario.
Recentemente, enteroid intestinale umano (HIE), esibendo una simile composizione cellulare e funzione come epitelio gastrointestinale umano, è diventato disponibile per rotavirus propagazione18. L'uso di HIE può permetterci di valutare il tasso di crescita specifico e la capacità di cella-associazione di non-coltivabili ceppi di rotavirus. Inoltre, entrambi gli esperimenti descritti qui possono essere applicati alla valutazione degli effetti della droga su entrambi fenotipi19. I protocolli qui presentati rendono possibile quantitativamente discutere i cambiamenti nei valori di parametro di fenotipo di ceppi di rotavirus in varie condizioni.

Virus del RNA forma una popolazione geneticamente eterogenea, nota come quasispecie1, a causa del loro tasso di mutazione,2 che è superiore a quello degli organismi basati sul DNA. Struttura della popolazione in quasispecie è influenzata da fattori genetici della popolazione, tra cui la deriva genetica, mutazione e selezione pressione. Ceppi all'interno di una singola stirpe genetico possono mostrare differenti fenotipi a causa della diversità genetica. Ad esempio, Devid et al ha mostrato che la sensibilità di cloro libero era differente fra ceppi murini norovirus che ha avuto origine da un ceppo di placca-purificato S7-PP33.
Rotavirus (rotavirus di genere nella famiglia reoviridae) sono virus non capsulati ds RNA formando delle quasispecie2. Oltre ai fattori genetici di popolazione sopra descritti, riassortimento genoma colpisce la diversità genetica del rotavirus perché questo virus ha 11 genoma segmentato4. I rotavirus causano diarrea principalmente fra gli infanti, e morti infantili nel 2013 sono stati stimati circa 250.0005. Due vaccini sono in uso in diversi paesi e sono stati efficaci nel ridurre l'onere dell'infezione di rotavirus, ma alcuni ricercatori stanno ora discutendo la presenza del vaccino-fuga mutanti6,7,8, 9. la caratterizzazione di questi mutanti è importante capire i meccanismi del vaccino-fuga.
Qui, presentiamo protocolli per due saggi per valutare il tasso di crescita specifico e la capacità delle cellule-associazione di rotavirus al fine di comprendere le differenze fenotipiche tra ceppi/mutanti. La curva di crescita di rotavirus è stata presentata nei precedenti rapporti10, ma i parametri di crescita come il tasso di crescita specifico non sono di solito misurati. Un'analisi di cella-obbligatoria condotta precedentemente coinvolge la macchiatura immunofluorescente tecnica11. Indichiamo qui metodi più facili di utilizzando il saggio della placca e la RT-qPCR, che ci permettono di discutere quantitativamente la differenza nei fenotipi virale. Questi metodi sono appropriati per la caratterizzazione dei fenotipi di rotavirus e infine possono contribuire alla costruzione di nuovi vaccini efficaci per genotipi multipli.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7500 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-EPI</td>
			<td>Nakalai Tesque, Inc</td>
			<td>01101-34</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>194-02875</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05900</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05901</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward / Reverse primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>140-00932</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-) &#34;Nissui&#34;</td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05913</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liguid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR039A</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR037A</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52904</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>199-05985</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>198-01675</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 6-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancrease</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0303-1G</td>
			<td>Activate for rotavirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus

Rotavirus è il fattore eziologico principale per diarrea infantile. È un virus a RNA double-stranded (ds) e forma una popolazione geneticamente eterogenea, nota come quasispecie, a causa del loro alto tasso di mutazione. Qui, descriviamo come misurare il tasso di crescita specifico e la capacità delle cellule-associazione di rotavirus come suoi fenotipi. Rotavirus è trattata con tripsina a riconoscere il recettore cellulare e quindi inoculati in colture cellulari MA104. Il supernatante, tra cui progenie virale, è raccolti in modo intermittente. Il saggio della placca viene utilizzato per confermare il titolo del virus (unità formanti placca: pfu) di ciascun supernatante raccolti. Il tasso di crescita specifico è stimato inserendo dati di tempo-corso di pfu/mL per il modello di Gompertz modificato. Nell'analisi della cella-associazione, MA104 cellule in una piastra a 24 pozzetti sono infettate da rotavirus e incubate per 90 min a 4 ° C per adsorbimento di rotavirus ai recettori delle cellule. Bassa temperatura trattiene rotavirus dall'invasione della cellula ospite. Dopo il lavaggio per rimuovere i virions non associati, RNA è Estratto da virioni associate ai recettori delle cellule seguiti dalla sintesi del cDNA e PCR quantitativa di d'inversione-trascrizione (RT-qPCR). Questi protocolli possono essere applicati per indagare le differenze fenotipiche tra ceppi virali.

Una panoramica dei due protocolli per il tasso di crescita specifico e il dosaggio di cella-associazione della placca-purificato ceppi RRV è mostrata in Figura 1A e 2A, rispettivamente.
Nel test per il tasso di crescita specifico, il titolo del virus finale raggiunge più di 107 pfu/mL durante la propagazione su pallone T75. Se la concentrazione massima è inferiore a 107 pfu/mL, la cella MA104 non può diventare confluente o RRV non è stato attivato anche da tripsina. Alcuni modelli di crescita sono disponibili per stimare il tasso di crescita specifico utilizzando i dati di unità infettive. In questo protocollo, il modificato Gompertz modello12 è impiegato come un esempio; <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
dove N0 (104 pfu/mL in questo studio) e Nt (104 -108 pfu/mL) sono il titolo infettive del virus (pfu/mL) a 0 e t (esempio: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, rispettivamente, A è il valore asintotico [log (N∞/N0 )] (esempio: 3-4), µ è il tasso di crescita specifico [1/h], e è la costante di Napier e λ è il periodo di ritardo [h]. Parametri del modello sono ottenuti tramite la funzione solver del software di analisi, che minimizza la somma dei quadrati della differenza tra i valori osservati e modellati. Nell'esempio in Figura 1B, il tasso di crescita specifico (µ) è stimato a 0.197 [1/h] e il periodo di ritardo (λ) è 6,61 [h] applicando il metodo di minimi quadrato per un modello di Gompertz modificato e il titolo del relativo virus presso la fase stazionaria al titolo iniziale ( scala logaritmica) (A) è 3.15 [log (N∞/n0)]. Abbiamo testato 6 cloni di rotavirus in totale, e i valori stimati del tasso di crescita specifico ha variato da 0,19 a 0,27 [1/h]. Questi stimati valori sono affidabili perché il coefficiente di valori di determinazione nel raccordo modello è più di 0.98.
Virioni RRV associazione a superfici delle cellule erano circa 103 copie/mL (associazione efficienza era di circa 1%) quando si utilizza una piastra a 24 pozzetti per l'analisi delle cellule-obbligatoria (Figura 2B). Il test è condotto solitamente tre volte per ogni campione, e se una grande varianza del numero di copia è osservata in un campione, potrebbero verificarsi alcuni problemi quali l'attivazione sovra-lavaggio e insufficiente di RRV di tripsina. Il valore Ct di qPCR superiore a circa 36.0 non è preferibile ed è considerato per essere inferiore a un limite di rilevazione nella nostra condizione di qPCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volume / 1 reazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x PrimeScript Buffer</td>
			<td>Μ l 4.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript RT enzima mescolare I</td>
			<td>1,0 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo dT Primer</td>
			<td>1,0 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 mers casuale</td>
			<td>Μ l 4.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua distillata deionizzata</td>
			<td>6,0 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>campione di ssRNA</td>
			<td>Μ l 4.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale</td>
			<td>20,0 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Master mix di composizione per la sintesi del cDNA del genoma di rotavirus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura [° C]</td>
			<td>Tempo</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Condizione di reazione per la sintesi del cDNA del genoma di rotavirus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Reazione di volume/1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Premiscela Taq</td>
			<td>12,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forward primer (10 µM)</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reverse primer (10 µM)</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonda (10 µM)</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tintura di riferimento II</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua distillata deionizzata</td>
			<td>5,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>campione di cDNA</td>
			<td>5,0 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale</td>
			<td>25 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Master mix composizione per PCR quantitativa del rotavirus un genoma.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura [° C]</td>
			<td>Tempo</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">ciclo di 45</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4: Condizioni di reazione per PCR quantitativa del rotavirus un genoma.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica della stima di crescita di rotavirus e la curva di crescita di rotavirus. (A) l'unità infettiva del rotavirus è misurata con il saggio della placca. (B) la curva (linea blu) è stata approssimata dal modello di Gompertz modificato sulla base dei dati osservati nel nostro laboratorio (cerchio bianco). Il tasso di crescita specifico [µ]; 0.197 [h-1], periodo di ritardo (λ); 6,61 [h], il titolo del relativo virus presso la fase stazionaria al titolo iniziale (scala logaritmica) (A); 3.15 [log (N∞/n0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> Figura 2: schema generale e risultato rappresentativo del dosaggio cellula-associazione di cinque ceppi RRV purificato dalle placche nel nostro laboratorio. (A) A piastra di coltura delle cellule inoculato con rotavirus viene incubato a 4 ° C per inibire l'invasione di virus nelle cellule. Dopo l'incubazione e la rimozione di particelle virali non associate alle cellule, quantificare il numero di genomi provenienti da particelle virali associate alla superficie delle cellule con RT-qPCR. (B) il risultato del cellula-binding assay è stato visualizzato come efficienza (%), che era il rapporto di particelle virali associati a quelli presenti nell'inoculo di associazione. Bar grassetto: mediano, fine delle caselle: deviazione quartile, fine linea: massimo e minimo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Qui presentiamo due protocolli, uno per misurare il tasso di crescita specifico e l'altro per la capacità di cella-associazione di rotavirus utilizzando il saggio della placca e RT-qPCR. Questi protocolli sono disponibili per la conferma le differenze nei fenotipi tra ceppi di rotavirus.

Saggi per il tasso di crescita specifico e la capacità di cella-associazione di Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Utilizzando i test qui presentati, la differenza nel fenotipo tra i ceppi di rotavirus può essere valutata, dove ceppi unici sono isolati. In particolare, viene studiato il cambiamento fenotipico dei ceppi di rotavirus resistenti ai disinfettanti. Per ottenere risultati quantitativi chiari utilizzando il saggio della placca, è fondamentale selezionare una combinazione appropriata di ceppo di rotavirus e siero, in cui il rotavirus è ben adattato al siero.A dimostrare la procedura sarà Syun-suke Kadoya, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Rimuovere un CryoTube contenente linee cellulari MA104 dal contenitore di azoto liquido. Posiziona CryoTube in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per scongelare le cellule.Aggiungere un millilitro della sospensione cellulare a 20 millilitri del mezzo contenente siero in un pallone T75. Incubare il pallone in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per due o tre giorni. Una volta che il monostrato cellulare raggiunge l'80% di confluenza, rimuovere il supernatante e lavare le cellule due volte con cinque millilitri del PBS di 1X Dulbecco.Aggiungere quattro millilitri dello 0,05% di tripside-EDTA al pallone e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti per staccare le cellule dal pallone. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 190 g per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule pelletate in un millilitro di mezzo contenente siero.Quindi diluire le cellule rimorsidenti 100 volte con il mezzo. Aggiungere tre millilitri della sospensione cellulare diluita ad ogni pozzo di una piastra a sei porri per il test della placca. Aggiungere un millilitro della sospensione cellulare diluita ad ogni pozzo di una piastra da 24 pozzetto per il saggio di legame cellulare.Incubare le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5%CO2 vapore sottosaturo per due o tre giorni. Trasferire un tubo contenente un millilitro della sospensione del virus in mezzo privo di siero dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius a un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per scongelare. Aggiungere un microgrammo per microlitro di tripside dal pancreas suino a un millilitro della sospensione del virus e quindi del vortice.Incubare la sospensione del virus a 37 gradi Celsius e 5%CO2 vapore sottosaturo per 30 minuti. Diluire la sospensione del virus attivata con mezzo privo di siero per regolare la molteplicità dell'infezione, o MOI, a 0,1 pfu per cellula. Aggiungere un millilitro della sospensione del virus diluito alle cellule MA104 in un pallone T75 tre giorni dopo la placcatura cellulare.Incubare le cellule con virus a 37 gradi Celsius per un'ora, scuotendo delicatamente il pallone ogni 15 minuti. Quindi aggiungere 30 millilitri di un mezzo privo di siero contenente quattro microgrammi per millilitro di tripside dal pancreas suino al pallone. Incubare il pallone a 37 gradi Celsius e 5%CO2 vapore sottosaturo.Raccogliere un millilitro del supernatante nel pallone a zero, sei, 12, 18, 24 e 36 ore dopo l'infezione e sostituire il supernatante nei tipi da 1,5 millilitri usando una pipetta. Condurre un ciclo di congelamento-disgelo entro 15 minuti a meno 80 gradi Celsius seguito da uno scioglimento di 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quindi centrifugare i tubi a 12.600 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Raccogli il supernatante. Filtrare il supernatante con un filtro distillato da 0,2 micron per rimuovere la frazione cellulare. Conservare il supernatante a meno 80 gradi Celsius fino ad applicarlo al test della placca per misurare il titolo del virus.Quando è pronto per eseguire il test della placca, posizionare i tubi contenenti il supernatante raccolto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Aggiungere la tripsiderina a un millilitro di campione diluito 10 volte e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Durante questa incubazione di 30 minuti, lavare accuratamente le cellule MA104 in una piastra a sei pompoli con due millilitri di 1X PBS dopo aver rimosso il mezzo contenente siero.Diluire serialmente i campioni incubati con mezzo privo di siero e inoculare un millilitro del campione diluito in ogni pozzo. Incubare la piastra per 90 minuti a 37 gradi Celsius e 5%CO2 vapore sottosaturo, scuotendo delicatamente la piastra ogni 15 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere l'inoculo dalla piastra a sei pozzi.Aggiungere quattro microgrammi per millilitro di triptina al mezzo preparato. Aggiungere delicatamente ma immediatamente tre millilitri del mezzo mescolati con gel di agarosio ad ogni bene. Lasciare solidificare il gel di agarosio a temperatura ambiente per più di 10 minuti.Quindi incubare la piastra per due giorni a 37 gradi Celsius e 5%CO2 vapore sottosaturo. Aggiungere quindi un millilitro di soluzione 0.015%Neutral Red diluita con 1X PBS a ciascun pozzo e incubare con le stesse condizioni. Rimuovere il colorante dopo tre ore e continuare a incubare per un giorno.Il giorno dopo, contare il numero di placche in ogni pozzo e calcolare il pfu per millilitro. Controllare attentamente la confluenza cellulare prima del saggio della placca per assicurare i numeri della placca. Per il saggio di legame cellulare, aggiungere un microgrammo per microlitro di tripside da un pancreas suino a un millilitro della sospensione del virus, quindi vortice.Diluire la sospensione del virus con un mezzo privo di siero per regolare il MOI a un pfu per cellula. Lavare le cellule MA104 due volte in una piastra da 24 pozzetti con un millilitro di soluzione salina tris-tamponata. Ora inoculare le cellule con 100 microlitri di sospensione del virus diluito in ogni pozzo della piastra da 24 pozzi.Incubare il piatto a quattro gradi Celsius per 90 minuti con tremori delicati ogni 15 minuti. Rimuovere l'inoculo del virus e lavare le cellule due volte con un millilitro di soluzione salina tris-tamponata. Per estrarre l'RNA a doppio filamento del rotavirus, aggiungere 140 microlitri di 1X PBS e 560 microlitri del buffer di estrazione dell'RNA a ciascun pozzo.Mescolare adeguatamente con una pipetta fino a quando non si vede la foschia delle cellule nel tampone. Dopo aver recuperato l'RNA a doppio filamento, secondo il protocollo del produttore, posizionare i tubi da 1,5 millilitri, contenenti l'estratto di RNA a doppio filamento, su un blocco termico a 95 gradi Celsius per cinque minuti per denaturare l'RNA. Quindi posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio e incubare per più di due minuti.Sintetizzare il cDNA utilizzando un kit di trascrizione inversa. Aggiungere quattro microlitri di soluzione di RNA virale denaturato a un tubo PCR contenente 16 microlitri di miscela di reazione e mescolarlo con attenzione con una pipetta in modo da non generare bolle. Dopo aver filato i tubi, eseguire la trascrizione inversa con un termociclo.Per la PCR quantitativa, utilizzare una sonda di inserimento quencher destinata alla regione da 963 a 1.049 del segmento del genoma NSP3 del rotavirus. Diluire serialmente il plasmide standard con acqua di grado PCR e procedere a creare il master mix per pcr quantitativo. Aggiungere 20 microlitri del master mix ai pozzi di una piastra PCR da 96 porri.Quindi mescolare cinque microlitri di campioni di cDNA o cinque microlitri del plasmide standard pipettando 10 volte. Eseguire la PCR quantitativa in base alle condizioni del protocollo di testo. Infine, calcolare il genoma del rotavirus legato alla superficie cellulare ma104 come descritto nel protocollo di testo.Qui è mostrata una curva di crescita del rotavirus. Applicando il metodo meno quadrato a un modello di Gompertz modificato, il tasso di crescita specifico è stimato a 0,197 e il periodo di ritardo è stimato a 6,61 ore. Il formicolio relativo del virus nella fase stazionaria al formicolio iniziale è 3.15.Dei sei cloni di rotavirus testati, i valori stimati del tasso di crescita specifico variavano da 0,19 a 0,27. Questi valori stimati sono affidabili perché il coefficiente dei valori di determinazione nel raccordo del modello è superiore a 0,98. Il risultato del saggio di legame cellulare è mostrato come efficienza di legame, che è il rapporto tra particelle virali legate e quelle presenti nell'inoculo.I nostri virioni RV che si legano alle superfici cellulari sono di circa 10.000 copie per millilitro con un'efficienza di rilegatura di circa l'1% quando si utilizza una piastra da 24 pozzetti per il saggio di legatura cellulare. Poiché le cellule coltivate sono sensibili agli stress fisici, fare attenzione a versare delicatamente ma rapidamente il tampone e l'agar. In sostanza, è stato introdotto un nuovo sistema per i virus.Utilizzando questo sistema, possiamo valutare la reale capacità di legame cellulare e il tasso di crescita specifico con gli strumenti. Il nostro protocollo è vantaggioso per misurare il tratto fenotipico. Controllando diversi ceppi appena emergenti, puoi aiutare a valutare i suoi nuovi vaccini per i virus.I virus sono designati come agenti patogeni BSL-2, quindi sarà necessario preparare sale sperimentali BSL-2 per eseguire questa procedura.

Research

JoVE Journal

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Analisi quantitativa di tutti influenza di tipo A Hemagglutinins e neuraminidasi virale utilizzando anticorpi Universale di saggi semplice Slot Blot

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