Name: assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00
Duration: 10 min 49 s
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이 작품은 "위생 가치 체인:: 디자인 위생 시스템으로 에코 커뮤니티 가치 시스템" 프로젝트, 인간과 자연 (RIHN, 프로젝트 No.14200107)에 대 한 ResearchInstitute에 의해 지원 되었다.

1. 매체 준비
<ol><li>세포 배양 매체 (혈 청에 포함 된 매체)을이 글의 MEM 분말의 4.7 g 증류수 500 mL를 추가 합니다. 20 분 하 고 실내 온도에 보통 쿨에 대 한 120 ° C에 고압. 소 태아 혈 청에 추가 (최종 농도: 10%), L-글루타민 (2mm), 페니실린 스 (1%), 나트륨 중 탄산염 (1.125 g/L). 1 개월에 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>소 태아 혈 청 하지 않고 단계 1.1에서 설명 된 대로 바이러스 전파에 대 한 혈 청 자유로운 매체를 준비 합니다. 1 개월에 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>상 패 분석 결과 대 한이 글의 메모리 매체 (비 포함 된 페 놀 레드) 100 mL 압력가 마로 소독 하 여 소독. 실내 온도에 냉각 하 고 2% 추가 매체를 하자 FBS, 2% 페니실린 스, L-글루타민, 4mm와 2.25 g/L NaHCO3. 4 ° c.에 게</li>
	<li>상 패 분석 결과 대 한 압력솥으로 2.5 %agarose 젤 100 mL 소독. 젤 패 시험 실시 당일 준비. 물 욕조에 47 ° C에 젤을 저장 합니다.</li>
</ol>2. 세포 배양
<ol><li>액체 질소 용기에서 MA104 셀 라인을 포함 하는 cryotube를 제거 합니다. 세포를 해 동 37 ° C에서 물 욕조에는 cryotube를 놓습니다. T75 플라스 크에서 혈 청에 포함 된 매체의 20 mL에 세포 현 탁 액 1 mL를 추가 합니다. 2 또는 3 일 동안 37 ° C, 5% CO2 배양 기에 플라스 크를 품 어. 참고: 현 탁 액에서 최종 셀 농도 약 106 셀/mL 이다.</li>
	<li>일단 셀 단층 80 %confluency 도달는 상쾌한을 제거 하 고 Dulbecco의 PBS (인산 염 버퍼 식 염 수) x 1의 5 mL로 두 번 셀을 세척.</li>
	<li>0.05% 트립 신-EDTA의 4 mL 플라스 크에 추가 하 고 플라스 크에서 세포를 분리 하려면 5 분 동안 37 ° C에서 품 어. 15 mL 튜브를 5 분 동안 190 x g에서 원심 분리기 세포 현 탁 액을 전송 합니다.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 중간에 준비 1.1 포함 하는 혈 청 1 mL에 수송과 세포 (106 셀) resuspend. 약에서 resuspended 셀을 희석 매체와.</li>
	<li>6-잘 (패 분석 결과) 또는 (대 한 셀 바인딩 분석 결과), 24-잘 접시의 각 음을 각각 희석된 세포 현 탁 액 3 mL를 추가 합니다. 2 ~ 3 일에 대 한 포화 증기에서 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에 접시를 품 어. 참고: T75 플라스 크 샘플 볼륨 상쾌한 (1 mL)의 총 표면에 뜨는 볼륨 (30 mL)에 비해 무시 될 수 있기 때문에 시간 코스 샘플을 수집 하는 게 적당 하다. 한편,는 일반적으로 6-잘 접시를 사용 하 여 수행 상 패 분석 결과 각 상쾌한에 바이러스의 감염 titer 측정 됩니다. 24 잘 플레이트 세포 바인딩 분석 결과 대 한 활용 됩니다.</li>
</ol>3. 특정 성장 율으로 타 바이러스의
참고: 붉은 털으로 타 바이러스 (RRV, 유전자 형: G3P[3]) RRV 신속 하 고 쉽게 MA104 셀과 플 라크를 형성 수 있습니다 때문에이 프로토콜에서 이용 된다.
<ol><li>해 동 장소-80 ° c에서 37 ° C에 물 목욕 저장 혈 청 자유로운 매체에 바이러스 중지 (107 pfu/mL) 1 mL를 포함 하는 관. 돼지 췌 장에서 바이러스 정지 (최종 트립 신 농도 4 µ g/mL) 그리고 소용돌이의 1 mL 1 µ µ g/L 트립 신을 추가 합니다. 30 분에 대 한 포화 증기에서 37 ° C, 5% CO2 에서 바이러스 정지를 품 어. 참고: 트립 신 다른 소스에서 사용할 수 있습니다, 그러나로 infectivity에 영향 사전에 테스트할 필요가 있다.</li>
	<li>혈 청 무료 매체 조정 0.1 pfu/셀 감염 (MOI)의 다양성을 활성화 바이러스 정지 희석.</li>
	<li>추가 희석된 바이러스 서 스 펜 션의 1 mL MA104 셀 라인 (80% 합칠) T75 플라스 크에 셀 (2.1) 도금 후에 3 일, 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어 하 고 부드럽게 흔들어 플라스 크 매 15 분.</li>
	<li>그런 다음, 30 mL 플라스 크에 돼지 췌 장에서 trypsin의 0.13 µ g/mL를 포함 하는 혈 청 무료 매체의 추가. 포화 증기에서 37 ° C, 5% CO2 플라스 크를 품 어.</li>
	<li>0, 6, 12, 18, 24에 플라스 크에서 상쾌한의 1 mL 및 36 (또는 48) h 후 감염 (hpi)를 수집 하 고는 피 펫을 사용 하 여 1.5 mL 튜브에 상쾌한 대체.</li>
	<li>동결 (-80 ° C)를 실시 하 고 37 ° C 사이클에서 세 번 물 욕조에 녹아. 다음 4 ° c.에서 10 분 동안 12600 x g 에서 튜브 원심 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>소 주 0.2 µ m 필터 셀 일부를 제거 하는 상쾌한을 필터링 합니다. 바이러스 titer 측정 하기 위한 패 분석 실험에 적용까지 표면에 뜨는-80 ° C 냉장고에 저장 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 물 목욕에서 수집 된 상쾌한 (3.5 단계)를 포함 하는 튜브를 배치 10 희석된 샘플의 1 mL를 4 µ g/mL의 트립 신을 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>3.8에 30 분 인큐베이션 기간 동안 시작 시간 코스 샘플 (3.5 단계)에서 얻은 바이러스 titer 측정 하기 위한 패 분석 결과 씻어 6 잘 플레이트 1 x PBS의 2 mL와 두 번의 MA104 셀 포함 하는 혈 청 매체를 제거한 후.</li>
	<li>직렬 혈 청 무료 매체 incubated 샘플을 희석 하 고 각 우물에 희석된 샘플의 1 mL를 접종. 37 ° C, 5% CO2 포화 증기, 아래에서 90 분 동안 접시를 품 어 그리고 부드럽게 흔들어 접시 마다 15 분.</li>
	<li>부 화, 후 6 잘 플레이트에서는 inoculum을 제거 합니다. (1.3 단계)에서 준비 하는 중간에 4 µ g/mL의 트립 신을 추가 합니다. 부드럽게 하지만 즉시 각 음을 agarose 젤 (비율은 1:1) 혼합 매체의 3 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>(Agarose 젤 고체까지) 10 분 이상 실 온에서 접시를 유지 하 고 포화 증기에서 37 ° C, 5% CO2 에서 2 일 동안 품 어. 참고: 우물의 가장자리에서 agar와 혼합 매체를 붓는 다.</li>
	<li>각 음을 1 x PBS에 희석 0.015% 중립 빨강 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 포화 증기에서 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어. 3 h 후 염료를 제거 하 고 포화 증기에서 37 ° C, 5% CO2 1 일 품 어.</li>
	<li>다음 날, 각 잘에서 플 라크의 수를 세 고 계산 pfu/mL. 신중 하 게 패 분석 결과 패 숫자를 보장 하기 전에 셀 합류를 확인 하십시오.</li>
</ol>4. 셀 바인딩 분석 결과
참고: 이 프로토콜은 Gilling의 보고서13을 기반으로 합니다.
<ol><li>(2.1에서 같은 방식으로)에 돼지 췌 장 (최종 트립 신 농도 4 µ g/mL) 바이러스 정지 그리고 소용돌이의 1 mL에 1 µ µ g/L 트립 신을 추가 합니다. 조정 1 pfu/셀의 나 혈 청 자유로운 매체와 바이러스 정지 희석.</li>
	<li>다음, MA104 셀 Tris 버퍼 식 염 수 1ml와 24-잘 접시에 두 번 세척 (TBS; 2.53 g/L 트리 스 베이스, 6.54 g/L NaCl, KCl, 0.3 g/L 0.046 g/l Na2HPO4 증류수 1 L에 도달).</li>
	<li>셀, 24-잘 접시의 각 잘 희석된 바이러스 정지의 100 µ L를 접종 하 고 부드러운 떨고 모든 15 분으로 90 분, 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>바이러스 inoculum을 제거 하 고 세척 tbs.의 1 mL로 두 번 셀 더블-좌초 (ds) RNA는로 타 바이러스의 추출, 추가 PBS x 1의 140 µ L 및 RNA 추출 버퍼의 560 µ L ( 재료의 표참조) 각 잘 하. 피 펫 (10 x에 대 한 때까지 또는 연 무 또는 버퍼에 있는 세포의 오염 나타나지 않습니다)와 적절 하 게 믹스.</li>
	<li>회복 후 제조업체의 프로토콜에 따라 이중 좌초 RNA (dsRNA), 1.5 mL 튜브 dsRNA 추출 dsRNA, 변성 다음 즉시 얼음에 튜브를 배치 하 고 2 이상의 품 어 5 분 동안 95 ° C에서 열 블록에 포함 된 배치 분입니다.</li>
	<li>반전 녹음 방송을 사용 하 여는 cDNA를 합성 키트 ( 재료의 표참조). 혼합물 (표 1)의 16 µ l을 포함 하는 PCR 튜브에 변성된 바이러스 성 RNA 솔루션의 4 µ L을 추가 하 고 거품 생성을 하지 피 펫으로 신중 하 게 혼합. 튜브 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>표 2에 표시 된 조건 하에서 열 cycler와 반전 녹음 방송을 수행 합니다. cDNA 즉시 사용 하지 않으면 최대 1 년 동안-20 ° C에서 cDNA를 포함 하는 PCR 튜브를 저장 합니다.</li>
	<li>정량 PCR를 위한 뇌관을 사용 하 여 (앞으로 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', 역; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 와 프로브를 끄는 삽입 (정량 프로브; 5'-/ 팸/ATGAGCACA/끄는/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA/3 '), 대상에 963-NSP3로 타 바이러스의 게놈 세그먼트의 1049 지역 (ST3 스트레인, 은행: X81436). 참고: 끄는 쩡 외.14 에 의해 설계 된 프로브 삽입 됩니다.
</li>
	<li>표준 플라스 미드를 직렬로 희석 (10 106 복사본/mL을1 ) PCR과 정량 혼합 (표 3)에 물을 학년 고 정량 다음 표 4에 대 한 마스터 믹스 (20 µ L/샘플).</li>
	<li>96-잘 PCR 격판덮개의 우물을 마스터 믹스 20 µ L을 추가 하 고 10 번 pipetting으로 cDNA 샘플의 5 µ L 또는 표준 플라스 미드의 5 µ L를 혼합. 표 4에 표시 된 조건에 따라 정량 시스템의 반응을 시작 합니다.</li>
	<li>MA104 세포 표면에 바인딩된로 타 바이러스 게놈을 계산 하려면 Ct 값과 표준 플라스 미드의 알려진된 게놈 수 사이의 선형 회귀를 수행 하 고 샘플의 게놈 수 예상 합니다. 다음 그 초기 inoculum (G0)에 virion 숫자 바인딩 셀 (Gt)의 비율을 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

특정 성장 속도 측정 하기 위한 우리의 프로토콜 이전의 것 들 보다 쉽습니다 그리고 그들의 세포 문화 시스템 아직 설립 하지 않는 한 다른 바이러스에 대 한 적응 시킬 수 있다. 이 연구에서는 사용 하는 RRV (G3P[3]) MA104 셀 라인을 사용 하 여 때이 긴장 패 인간의 rotaviruses 보다 쉽게 형성할 수 있기 때문에. 일부 인간로 긴장이 셀 라인에서 플 라크를 형성할 수 없습니다. 따라서, 상 패 분석 결과, 대신 초점 형성 단위 (: FFU) 분석 결과15 또는 중간 조직 문화 감염 복용량 (TCID50) 분석 결과 적용할 수 있는 많은 타 바이러스 긴장16. 특정 성장 율을 결정 하기 위한 제시 프로토콜 다른 바이러스 종류에 사용할 수 있습니다 하지만 바이러스 설립된 셀 문화 시스템 설립에 적합 하지 않습니다. 특정 성장 율에 대 한 실험을 시작 하기 전에 미리 알고 있는 때 바이러스 감염 titer가 증가 하기 시작 하 고 예비 테스트에서 고정 단계에 도달. 너무 많은 패 경우 패 분석 결과 바이러스 샘플의 희석 비율을 변경한 후 다시 실시 한다. 지 수 성장 단계의 기울기 고정 단계에 도달 하는 적절 한 시간 포인트 놓쳤다면 과소평가 될 수 있기 때문에 샘플을 수집 하는 시간 후 감염 (hpi)도 중요 하다. 수정된 Gompertz 모형에 의해 근사에서 결정 계수 해야 항상 계산 되며 체크. 체력 수정된 Gompertz 모델을 낮은 경우에, 다른 성장 모델 수정된 로지스틱 모델12 바람직 있을 수 있습니다.
매체 또는 바이러스 inoculum을 제거 하는 경우 셀을 처리, 상 패 분석 결과 대 한 세척 또는 agarose 젤에 대 한 PBS 즉시에 추가 되어야 합니다 각 셀 건조에서를 방지 하기 위해 셀 문화 접시의 잘. 동시에 부드럽게 PBS 또는 우물에서 분리 하지 셀 agarose 붓고 해야 합니다. 이 단계는 모두 분석 실험 (단계 3.9와 3.11)에서 가장 중요 한. 상 패 분석 결과 너무 많은 샘플 있으면 좋습니다 agarose 젤 (100ml 각 최대 권장) 여러 중간 병으로 정기 agarose 이후 사용 직전 젤은 룸에서 약 10 분 이내 경화 될 때까지 병을 따뜻하게 유지 온도입니다. 트립 신 높은 온도17에 취약 이기 때문에, trypsin 솔루션 매체 및 agarose 적절 하 게 냉각 후 상 패 분석 결과 대 한 추가 되어야 합니다.
셀 바인딩 분석 결과에서 바이러스 바인딩 셀에 대 한 외피 세포의 침입을 방지 하기 위해 4 ° C에서 수행 되어야 합니다. Gilling의 방법13에 따르면 셀 부드러운 떨고는 필요한 모든 15 분 동안 보육 낮은 온도에서 건조 하는 경향이 있다. 여기에 활용 하는 RNA 추출 키트는 다른 키트에 대 한 대체 수 있습니다. 실시간 정량에서 표준 곡선의 기울기는 약 3.3, 이어야 한다 고 결정 계수는 0.98 보다 더 해야한다. 세포에 있는 바이러스의 지역화를 시각화 하기 위해 형광 현미경에 비해, 분석 결과 더 신속 하 고 바이러스에 형광 물질의 바인딩이 필요 하지 않습니다 때문에 사용 하기 쉽습니다.
최근, 인간의 장 enteroid (히), 유사한 세포 구성과 기능 전시 인간의 위장 상피로로 타 바이러스 전파18사용할 수 있게 했다. 히 사용 특정 성장 속도로 타 바이러스의 비 culturable 긴장의 셀 바인딩 능력 평가를 통해 수 있습니다 있습니다. 또한, 여기에 설명 된 두 실험 모두 고기19에 약물 효과의 평가에 적용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜 양적 표현 형으로 타 바이러스 변종이 다양 한 조건에서의 매개 변수 값의 변화를 논의 하기 위해 가능 하 게.

RNA 바이러스는 그들의 돌연변이 비율, DNA 기반 생물의 보다 높은2 인해 quasispecies1로 알려진 유전으로 다양 한 인구를 형성 한다. Quasispecies에 인구 구조는 돌연변이, 유전적 부동, 선택의 압력 등 인구 유전 요인에 의해 영향을 받습니다. 단일 유전 계보 내의 긴장 유전적 다양성 때문에 다른 고기를 표시할 수 있습니다. 예를 들어 Rachmadi 외. 무료 염소 감도 플 라크 정화 스트레인 S7-p p 3의3에서 murine 노로바이러스 긴장 가운데 다른 했다 보여주었다.
Rotaviruses (reoviridae 가족에 속으로)는 비 싸여 ds RNA 바이러스 quasispecies2를 형성. 위에서 설명한 인구 유전 요인 뿐만 아니라 게놈 reassortment 영향을 미칩니다로 타 바이러스의 유전적 다양성을 때문에이 바이러스는 11 세그먼트 유전자4. Rotaviruses는 주로 유아, 중 설사를 일으킬 하 고 2013 년에 유아 죽음 2500005에 대 한 추정 했다. 하지만 일부 연구 자들은 이제 백신 탈출 돌연변이6,,78, 의 존재를 논의 하는 두 백신 여러 국가에서 사용 하 고로 타 바이러스 감염의 부담을 줄이는 효과가 있다 9. 이러한 돌연변이의 특성 백신 탈출 메커니즘을 이해 하는 것이 중요 하다.
여기, 우리가 특정 성장 율 및 변종/돌연변이 간의 phenotypic 차이 이해 하기 위해로 타 바이러스의 세포 바인딩 능력을 평가 하기 위한 두 개의 분석 실험에 대 한 프로토콜 제시. Rotaviruses의 성장 곡선 이전 보고서10, 발표 되었습니다 하지만 특정 성장률 등 성장 매개 변수는 일반적으로 측정 되지 않습니다. 실시 셀 바인딩 분석 결과 이전 immunofluorescent 얼룩 기법11를 포함 한다. 우리는 여기 패 분석 결과 및 RT-정량, 양적 바이러스 고기에 차이 논의 하기 위해 우리를 사용 하 여 쉽게 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 고기 특성에 대 한 적절 한 하 고 마침내 여러 genotypes에 대 한 효과적인 새로운 백신의 건설에 기여할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7500 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-EPI</td>
			<td>Nakalai Tesque, Inc</td>
			<td>01101-34</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>194-02875</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05900</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05901</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward / Reverse primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>140-00932</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-) &#34;Nissui&#34;</td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05913</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liguid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR039A</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR037A</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52904</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>199-05985</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>198-01675</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 6-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancrease</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0303-1G</td>
			<td>Activate for rotavirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus

로 타 바이러스는 유아 설사에 대 한 주요 etiological 요인이 다. (Ds) 이중 가닥 RNA 바이러스가 고 형성 한다 quasispecies, 그들의 높은 돌연변이 비율 때문으로 알려진 유전으로 다양 한 인구. 여기, 우리가 특정 성장 율 및 그것의 고기도로 타 바이러스의 셀 바인딩 능력을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 로 타 바이러스 세포 수용 체를 인식 하는 트립 신으로 처리 하 고 MA104 세포 배양에 주사. 바이러스 성 progenies를 포함 하 여 상쾌한 간헐적으로 수집 됩니다. 상 패 분석 결과 바이러스 titer를 확인 하는 데 사용은 (패 형성 단위: pfu) 각 수집된 상쾌한의. 특정 성장 율 수정 Gompertz 모델 pfu/mL의 시간-코스 데이터를 피팅 하 여 추정 된다. 셀 바인딩 분석 결과 24-잘 접시의 MA104 세포로 타 바이러스에 감염 되며 세포 수용 체로 흡착 4 ° C에서 90 분 동안 알을 품을. 낮은 온도로 타 바이러스 주인 세포에 침입에서 멈출. 씻은 후 언바운드 virions를 제거 하, RNA virions 세포 수용 체 cDNA 합성 및 반전 전사 정량 PCR (RT-정량)에 연결 된에서 추출 됩니다. 바이러스 성 긴장 중 phenotypic 차이 조사에 대 한 이러한 프로토콜을 적용할 수 있습니다.

특정 성장 속도 플 라크-정화 RRV 긴장의 셀 바인딩 분석 결과 대 한 두 개의 프로토콜에 대 한 개요는 각각 그림 1A 와 2A에 표시 됩니다.
특정 성장 율에 대 한 분석 결과, 마지막 바이러스 titer T75 플라스 크에 전파할 때 10 이상7 pfu/mL에 도달 합니다. 최대 농도 107 pfu/mL 보다 낮은 경우에, MA104 셀 confluent 될 않을 수 있습니다 또는 RRV는 트립 신에 의해 잘 활성화 되지. 일부 성장 모델 감염 단위 데이터를 사용 하 여 특정 성장 율 추정을 위한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 수정된 Gompertz 모델12 ; 예를 들어 고용 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
여기서 N0 (104 pfu/mL이이 연구에서)과 Nt (104 108 pfu/mL) 0와 t 바이러스 감염 titer (pfu/mL)는 (예: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, 각각, A는 점근 값 [로그 (N∞/N0 )] (예: 3 ~ 4), μ 특정 성장 율 [1/h] e는 네이피어의 상수 이며, λ는 지연 기간 [h]. 모델 매개 변수 관찰 및 모델 값의 차이의 제곱의 합을 최소화 하는 분석 소프트웨어의 해 찾기 함수에 의해 얻을 수 있습니다. 그림 1B에서 예제에서 특정 한 성장 율 (μ) 0.197 [1/h] 추정 되며 지연 기간 (λ) 6.61 [h] 초기 titer (고정 단계에서 수정 Gompertz 모델과 상대 바이러스 titer를 최소 제곱 메서드를 적용 하 여 로그 스케일) (A)는 3.15 [로그 (N∞/N0)]. 우리 총, 6로 타 바이러스 복제를 테스트 하 고 특정 성장 율의 추정된 값 0.27 [1/h] 0.19에서 ranged. 이 값은 신뢰할 수 있는의 결정 값 모델 피팅 계수 0.98 보다 더 있기 때문에 추정.
RRV virions 셀 표면에 바인딩 했다 약 103 복사본/mL (바인딩 효율은 약 1%) 셀 바인딩 분석 결과 (그림 2B)에 대 한 24-잘 접시를 사용 하는 경우. 분석 결과 일반적으로 모든 샘플에 대 한 세 번을 수행 하 고 복사본 수에 큰 차이 샘플에서 관찰, 트립 신에 의해 RRV의 부족-세탁기 활성화 등 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. Ct 값 정량 초과 약 36.0 바람직 이며 우리의 정량 상태에서 검출 한계 미만 이어야 하 고 여겨진다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>볼륨 1 / 반응</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript 버퍼 x 5</td>
			<td>4.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript RT 효소 나 혼합</td>
			<td>1.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>올리고 dT 프라이 머</td>
			<td>1.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>임의 6 메</td>
			<td>4.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>이온을 제거 된 증류수</td>
			<td>6.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>ssRNA 샘플</td>
			<td>4.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>총</td>
			<td>20.0 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 마스터는로 타 바이러스 게놈의 cDNA 합성에 대 한 구성 믹스.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>온도 [℃]</td>
			<td>시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>로 타 바이러스 게놈의 cDNA 합성 표 2: 반응 조건입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>볼륨/1 반응</td>
		</tr>
<tr>
<td>섞은 Taq</td>
			<td>12.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>앞으로 뇌관 (10 µ M)</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>반전 뇌관 (10 µ M)</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>프로브 (10 µ M)</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>참조 염료 II</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>이온을 제거 된 증류수</td>
			<td>5.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA 샘플</td>
			<td>5.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>총</td>
			<td>25 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 마스터는로 타 바이러스 게놈의 양이 많은 PCR에 대 한 구성 믹스.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>온도 [℃]</td>
			<td>시간</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 분</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">45 주기</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 분</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>로 타 바이러스 게놈의 양이 많은 PCR에 표 4: 반응 조건입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> 그림 1:로 타 바이러스 성장 추정과로 타 바이러스의 성장 곡선의 도식 개요. (A)로 타 바이러스의 감염 단위 패 분석 실험으로 측정 됩니다. (B) 곡선 (파란색 선)는 우리의 실험실 (흰색 원)에서 관찰 된 데이터 수정된 Gompertz 모델에서 직선 근사 줄. 특정 성장 율 [μ]; [h-1], 0.197 지연 기간 (λ); 6.61 [h], 초기 titer (로그 눈금)에 고정 단계에서 상대 바이러스 titer (A); 3.15 [로그 (N∞/N0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> 그림 2: 도식 개요 및 우리의 실험실에 있는 플 라크에서 정화 5 RRV 긴장의 셀 바인딩 분석 결과의 대표적인 결과. (A) A 셀 문화 접시와로 타 바이러스 접종 억제 세포로 바이러스 침공 4 ° C에서 incubated입니다. 부 화 후에 셀에 언바운드 바이러스 성 입자를 제거, 바운드 바이러스 입자에서 발생 하는 실시간 정량 Pcr과 세포 표면에는 게놈의 수 계량. (B) 셀 바인딩 결과 분석 결과 바인딩 했다 그는 inoculum에 바인딩된 바이러스 성 입자의 비 효율 (%)로 표시 됩니다. 대담한 바: 중간, 월말 상자: 사분 위 수 편차, 라인의 끝: 최대 및 최소. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

여기 두 개의 프로토콜 특정 성장 율 및 상 패 분석 결과 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여로 타 바이러스의 셀 바인딩 기능에 대 한 다른 측정 한 선물이. 이러한 프로토콜으로 타 바이러스 변종 고기에 차이 확인 수 있습니다.

특정 성장 속도로 타 바이러스의 세포 바인딩 기능에 대 한 분석

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

여기에 제시된 분석서를 사용하여, 독특한 균주가 고립된 로타바이러스 균주 들 사이 표현형의 차이를 평가할 수 있습니다. 특히, 로타바이러스의 소독제 내성 균주의 현상제 변화가 조사된다. 플라크 분석기를 사용하여 명확한 정량적 출력을 달성하기 위해서는 로타바이러스 균주와 혈청의 적절한 조합을 선택하는 것이 중요하며, 로타바이러스는 혈청에 잘 적응된다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생인 카도야 성석입니다. 액체 질소 용기에서 MA104 세포주를 포함하는 CryoTube를 제거합니다. CryoTube를 수조에 37°C의 수조에 배치하여 세포를 해동시십시오.T75 플라스크에 혈청 함유 배지의 20 밀리리터에 셀 서스펜션 1밀리리터를 추가합니다. 인큐베이터에서 플라스크를 섭씨 37도, 2~3일 동안 5%의 CO2로 배양합니다. 세포 단층이 80%의 합류에 도달하면, 상체를 제거하고 1X 덜벡코의 PBS의 5밀리리터로 세포를 두 번 씻으라.플라스크에 0.05%의 트립신-EDTA의 4밀리리터를 추가하고, 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 섭씨 37도에서 배양합니다. 셀 서스펜션을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기를 190g에서 5분간 전달합니다. 상체를 버리고 혈청 함유 매체의 1 밀리리터에서 펠렛 세포를 다시 중단합니다.그런 다음 재중단 된 세포를 배지로 100 배 희석시 희석시. 플라크 분석용 6웰 플레이트의 각 웰에 희석된 셀 서스펜션 3밀리리터를 넣습니다. 세포 결합 분석에 대해 24웰 플레이트의 각 웰에 희석 된 셀 현탁액의 1 밀리리터를 추가합니다.인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도, 2~3일 동안 5%CO2 저포화 증기로 배양합니다. 영하 80도에서 섭씨 37도의 수조로 저장에서 혈청없는 매체에 바이러스 서스펜션 1 밀리리터가 들어있는 튜브를 37도의 해동으로 옮기다. 돼지 췌장에서 트립신의 마이크로 리터 당 1 마이크로 그램을 바이러스 현탁액의 1 밀리리터에 추가 한 다음 소용돌이.바이러스 현탁액을 섭씨 37도, CO2 저평가 증기 5%에서 30분 동안 배양합니다. 활성 바이러스 현탁액을 혈청 이없는 배지로 희석하여 감염또는 MOI의 복합성을 세포당 0.1 pfu로 조정합니다. 세포 도금 후 3일 후에 T75 플라스크에서 MA104 세포에 희석된 바이러스 현탁액1밀리리터를 추가합니다.1시간마다 37°C의 바이러스로 세포를 배양하고 15분마다 부드럽게 플라스크를 흔들어 보냅니다. 그런 다음 돼지 췌장에서 플라스크에 트립신의 밀리리터 당 4 마이크로 그램을 포함하는 혈청없는 매체의 30 밀리리터를 추가합니다. 플라스크를 섭씨 37도, 저포화 증기 5%로 배양합니다.감염 후 0, 6, 12, 18, 24 및 36시간 플라스크에서 상체 1밀리리터를 수집하고 파이펫을 사용하여 1.5 밀리리터 유형의 상체를 교체한다. 영하80도에서 15분 이내에 동결 해동 주기를 한 다음, 섭씨 37도의 수조에서 15분간 녹는다. 그런 다음 4섭씨에서 10분 동안 12g, 600g의 튜브원심분리를 합니다.상체를 수집합니다. 증류된 0.2 미크론 필터로 상체를 필터링하여 세포 분획을 제거합니다. 바이러스 성미를 측정하기 위한 플라크 분석서에 적용할 때까지 상체를 영하 80도에서 보관하십시오.플라크 분석 작업을 수행할 준비가 되면 수집된 상체가 들어있는 튜브를 섭씨 37도의 수조에 놓습니다. 트립신을 10배 희석 시료 1밀리리터에 넣고 섭씨 37도에서 30분간 배양합니다. 이 30 분 인큐베이션 동안 혈청 함유 매체를 제거 한 후 1X PBS의 2 밀리리터로 6 웰 플레이트에서 MA104 세포를 조심스럽게 씻으면하십시오.혈청이 없는 배지로 배양된 시료를 직렬적으로 희석한 시료1밀리리터를 각 우물로 접종합니다. 섭씨 37도, CO2 저평가 증기5%에서 90분 동안 플레이트를 배양하고 15분마다 부드럽게 접시를 흔들어 놓습니다. 인큐베이션 후 6웰 플레이트에서 접종을 제거합니다.트립신의 밀리리터 당 4 마이크로그램을 준비된 매체에 추가합니다. 부드럽게 하지만 즉시 각 잘 아가로즈 젤과 혼합 된 매체의 3 밀리 리터를 추가 합니다. 아가로즈 젤이 실온에서 10분 이상 고화되도록 합니다.그런 다음 섭씨 37도 및 5% CO2 저포화 증기로 이틀 동안 플레이트를 배양합니다. 다음으로, 각 웰에 1X PBS로 희석된 0.015%의 중립 적색 용액 1밀리리터를 추가하고 동일한 조건으로 배양합니다. 3시간 후에 염료를 제거하고 하루 동안 계속 배양하십시오.다음 날, 각 우물의 플라크 수를 계산하고 밀리리터 당 pfu를 계산합니다. 플라크 분석 전에 세포 합류를 주의 깊게 확인하여 플라크 번호를 보장합니다. 세포 결합 분석의 경우 돼지 췌장에서 트립신 의 마이크로 리터 당 1 마이크로 그램을 바이러스 현탁액의 1 밀리리터에 추가 한 다음 소용돌이를 추가하십시오.혈청이 없는 배지로 바이러스 현탁액을 희석하여 MOI를 세포당 하나의 pfu로 조정합니다. 24웰 플레이트에 MA104 셀을 트리스 버퍼식 식염수 1밀리리터로 두 번 세척합니다. 이제 희석 된 바이러스 현탁액의 100 마이크로 리터로 세포를 24 웰 플레이트의 각 우물로 접종합니다.15분마다 완만한 흔들림으로 90분간 4도에서 접시를 배양합니다. 바이러스 접종을 제거하고 삼중 완충식식염수 1밀리리터로 세포를 두 번 씻으시다. 로타바이러스의 이중 좌초 RNA를 추출하려면 1X PBS의 140마이크로리터와 RNA 추출 버퍼 560마이크로리터를 각각 양호하게 첨가한다.버퍼의 셀 의 안개가 보이지 않을 때까지 파이펫과 적절하게 섞습니다. 제조업체의 프로토콜에 따르면 이중 좌초 RNA를 회수한 후, RNA를 변성하기 위해 5분간 섭씨 95도의 열 블록에 이중 좌초 RNA 추출물을 함유한 1.5 밀리리터 튜브를 배치합니다. 그런 다음 즉시 튜브를 얼음에 놓고 2 분 이상 배양합니다.역전사 키트를 사용하여 cDNA를 합성합니다. 반응 혼합물의 16 마이크로 리터를 포함하는 PCR 튜브에 변성 바이러스 RNA 용액의 네 마이크로 리터를 추가하고 거품을 생성하지 않도록 파이펫과 신중하게 혼합. 튜브를 회전한 후 열순환기로 역 전사를 수행합니다.정량적 PCR의 경우, 로타바이러스의 NSP3 게놈 세그먼트의 963 에서 1, 049 영역을 대상으로 하는 담종 삽입 프로브를 사용한다. PCR 급 물로 표준 플라스미드를 직렬로 희석하고 양적 PCR에 대한 마스터 믹스를 진행합니다. 마스터 믹스 20마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트의 웰에 넣습니다.그런 다음 10배 의 파이프팅을 통해 cDNA 샘플 5개 또는 표준 플라스미드의 5개의 마이크로리터를 혼합합니다. 텍스트 프로토콜의 조건에 따라 정량적 PCR을 수행합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 MA104 세포 표면에 결합된 로타바이러스 게놈을 계산한다.여기에 로타바이러스의 성장 곡선이 표시됩니다. 수정된 곰퍼츠 모델에 가장 적은 제곱 방법을 적용함으로써, 특정 성장률은 0.197로 추정되며, 지연 기간은 6.61시간으로 추정된다. 초기 티터에 고정 된 단계에서 상대 바이러스 티터는 3.15입니다.6개의 테스트된 로타바이러스 클론 중, 특정 성장률의 추정값은 0.19에서 0.27사이입니다. 모델 피팅의 결정 값 계수가 0.98 이상이기 때문에 이러한 예상 값은 신뢰할 수 있습니다. 세포 결합 분석의 결과는 결합 효율로 표시되며, 이는 비큐어에 존재하는 것과 결합된 바이러스 입자의 비율입니다.세포 표면에 결합하는 당사의 RV 비온은 세포 결합 분석에 24웰 플레이트를 사용할 때 약 1%의 결합 효율을 가진 밀리리터 당 약 10, 000 개의 사본입니다. 재배 된 세포는 물리적 인 스트레스에 민감하기 때문에 완충제와 한천을 부드럽고 빠르게 부어 주십시오. 본질적으로 바이러스에 대한 새로운 시스템이 도입되었습니다.이 시스템을 사용하여, 우리는 실제 세포 결합 능력과 계측기와 특정 성장 속도를 평가할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 현상 특성을 측정하는 데 유리합니다. 새로 출현하는 균주의 다른 것을 확인함으로써 바이러스에 대한 새로운 백신을 평가하는 데 도움을 줄 수 있습니다.바이러스는 BSL-2 병원체로 지정되므로이 절차를 수행하기 위해 BSL-2 실험실을 준비해야합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

연구

면역학 및 감염병학

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag : 높은 처리량 식민지 성장의 정량화 및 시간 지연

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

의 종 특이 검출을위한 루프 - 매개 등온 증폭 (LAMP) 분석 실험<em&gt; 에이 메리아</em&gt; 닭을 감염이

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

백혈구가 풍부한 혈액 샘플의 할로겐 퍼 옥시 다제 활동의 신속하고 구체적인 평가

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

세균성 접착 및 혈 청 저항에 Vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...