Name: assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av "The sanitær verdien kjede: utforme sanitær systemer som øko-Community verdisystem" prosjektet, ResearchInstitute for menneskeheten og natur (RIHN, prosjektet No.14200107).

1. middels forberedelse
<ol><li>For å gjøre en celle kultur medium (serum inneholder medium), legge til 4,7 g Eagle's MEM pulver 500 mL destillert vann. Autoclave ved 120 ° C for 20 min og la den mellomstore avkjøles til romtemperatur. Legge til fosterets bovin serum (siste konsentrasjon: 10%), L-glutamin (2 mM), Penicillin Streptomycin (1%) og natriumbikarbonat (1.125 g/L). Lagre på 4 ° C for 1 måned.</li>
	<li>Forberede serum-free mediet virus forplantning som beskrevet i trinn 1.1, men uten fosterets bovin serum. Lagre på 4 ° C for 1 måned.</li>
	<li>For plakk analysen, sterilisere 100 mL Eagle's MEM medium (ikke inneholder fenol rød) av autoklavering. La mediet avkjøles til romtemperatur, og deretter legge til 2% FBS, 2% Penicillin Streptomycin, 4 L-glutamin, og 2,25 finans NaHCO3. Butikken på 4 ° C.</li>
	<li>For plakk analysen, sterilisere 100 mL 2,5% agarose gel av autoclave. Forberede gel samme dag plakk analysen utføres. Lagre gel på 47 ° C i et vannbad.</li>
</ol>2. celle kultur
<ol><li>Fjerne en cryotube som inneholder MA104 linjer fra beholderen flytende nitrogen. Plass cryotube i et vannbad på 37 ° C å tine cellene. Legge til 1 mL av cellen suspensjon 20 mL serum inneholder mediet i en MT75 bolle. Inkuber flasken i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2 for 2 eller 3 dager. Merk: Den siste celle konsentrasjonen i suspensjon er ca 106 celler/mL.</li>
	<li>Når de celle monolayer når 80% confluency, fjerne nedbryting og vask cellene to ganger med 5 mL 1 x Dulbecco's PBS (fosfat bufret saltvann).</li>
	<li>Legge til 4 mL 0,05% trypsin-EDTA kolbe og ruge ved 37 ° C i 5 min koble cellene fra flasken. Overføre celle suspensjon 15 mL tube og sentrifuge 190 x g for 5 min.</li>
	<li>Forkast nedbryting og resuspend pelleted cellene (106 celler) i 1 mL av serum inneholder middels forberedt i 1.1. Fortynne de resuspended cellene på 100-fold med mediet.</li>
	<li>Tilsett 3 mL utvannet celle suspensjon hver brønn 6-vel (for plakk analysen) eller 24-vel plater (for celle-bindende analysen), henholdsvis. Inkuber plater i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2 under mettet damp for 2 eller 3 dager. Merk: En MT75 kolbe er egnet for oppsamling av tid-retters fordi eksempel volumet av nedbryting (1 mL) kan ignoreres i forhold til det totale supernatant volumet (30 mL). I mellomtiden målt den smittsomme titer av viruset i hver nedbryting ved plakk analysen, som er vanligvis utført med en 6-vel plate. En 24-vel plate benyttes for celle-bindende analysen.</li>
</ol>3. spesifikk vekstrate av Rotavirus
Merk: Rhesus rotavirus (RRV, genotype: G3P[3]) er benyttet i denne protokollen fordi RRV kan enkelt og raskt danne plaketter med MA104 celler.
<ol><li>Plasser et rør som inneholder 1 mL av virus suspensjon (107 pfu/mL) i en serum-free medium lagret på-80 ° C i et vannbad på 37 ° C å tine. Legge til 1 µg/µL trypsin fra svin bukspyttkjertelen 1 mL av virus suspensjon (siste trypsin konsentrasjon er 4 µg/mL) og deretter vortex. Inkuber virus suspensjon på 37 ° C og 5% CO2 under mettet damp i 30 min. Merk: Trypsin fra andre kilder kan brukes, men effekten på rotavirus infectivity skal testes på forhånd.</li>
	<li>Fortynne aktivert virus suspensjon med en serum-free medium å justere mangfoldet av infeksjon (MOI) til 0,1 pfu/cellen.</li>
	<li>Legge 1 mL av utvannet virus suspensjon til MA104 linjer (80% confluent) i en MT75 bolle 3 dager etter cellen plating (2.1), ruge ved 37 ° C i 1 time og forsiktig risting kolbe hvert 15 min.</li>
	<li>Legg deretter til 30 mL av en serum-fri medium som inneholder 0,13 µg/mL av trypsin fra en svin bukspyttkjertelen til kolbe. Inkuber kolbe på 37 ° C og 5% CO2 under mettet damp.</li>
	<li>Samle 1 mL av nedbryting i flasken på 0, 6, 12, 18, 24 og 36 (og/eller 48) h etter infeksjon (hpi) og erstatte nedbryting i 1,5 mL rørene bruker en pipette.</li>
	<li>Gjennomføre fryse (-80 ° C) og smelte i et vannbad på 37 ° C syklusen tre ganger. Deretter sentrifuge rør 12.600 x g i 10 min på 4 ° C. Samle nedbryting.</li>
	<li>Filtrere nedbryting med filtere destillert 0,2 µm fjerne celle brøken. Lagre supernatant-80 ° C i kjøleskapet til bruke det på plakk analysen for å måle virus titer.</li>
	<li>Plassere rør som inneholder samlet nedbryting (trinn 3,5) i et vannbad på 37 ° C. Legg 4 µg/mL trypsin til en 1 mL av 10 ganger utvannet prøve og ruge på 37 ° C i 30 min.</li>
	<li>For å begynne plakk analysen for å måle virus titer fra kurset tidsprøvene (trinn 3,5), under 30 min incubation i 3.8, vask MA104 cellene to ganger i en 6-vel plate med 2 mL 1 x PBS etter fjerner serum inneholder mediet.</li>
	<li>Serielt fortynne inkubert prøvene med en serum-free medium og vaksinere 1 mL av utvannet prøven i hver brønn. Inkuber platen i 90 min på 37 ° C og 5% CO2 under mettet damp, og forsiktig risting platen hvert 15 min.</li>
	<li>Etter inkubasjon fjerne inoculum fra 6-vel plate. Legge til 4 µg/mL trypsin mediet i (trinn 1.3). Forsiktig men umiddelbart legge 3 mL mediet blandet med agarose gel (forholdet er 1:1) i hver brønn.</li>
	<li>Holde platen ved romtemperatur i mer enn 10 min (inntil agarose gel blir solid) og ruge for 2 dager på 37 ° C og 5% CO2 under mettet damp. Merk: Hell mediet blandet med agar fra kanten av brønnen.</li>
	<li>Legg 1 mL av 0.015% nøytral rød løsningen fortynnet med 1 x PBS hver brønn og ruge på 37 ° C og 5% CO2 under mettet damp. Fjern fargestoff etter 3t og ruge for 1 dag på 37 ° C og 5% CO2 under mettet damp.</li>
	<li>Neste dag, antall plaketter i hver brønn og beregne pfu/mL. Nøye sjekke cellen der før plakk analysen å sikre plakk tallene.</li>
</ol>4. celle-bindende analysen
Merk: Denne protokollen er basert på Gillings rapport13.
<ol><li>Legge til 1 µg/µL trypsin fra en svin bukspyttkjertelen og 1 mL av virus suspensjon (siste trypsin konsentrasjon er 4 µg/mL) og deretter vortex (på samme måte som 2.1). Fortynne virus suspensjon med en serum-free medium å justere MOI 1 pfu/cellen.</li>
	<li>Deretter vaske MA104 cellene to ganger på 24-vel plate med 1 ml av Tris-bufret saltvann (SS; 2,53 finans Tris base, 6.54 finans NaCl, 0,3 finans KCl, 0.046 finans Na2HPO4 til 1 L med destillert vann).</li>
	<li>Vaksinere 100 µL av utvannet virus suspensjon i hver brønn av en 24-vel plate med celler, og ruge ved 4 ° C i 90 min, med milde risting hvert 15 min.</li>
	<li>Fjerne det virus inoculum og vask cellene to ganger med 1 mL av TBS. Til ekstrakt double-strandet (ds) RNA i rotavirus, legge til 140 µL av 1 x PBS og 560 µL av RNA utvinning bufferen (se Tabell for materiale) i hver brønn. Bland tilstrekkelig med en pipette (om 10 x eller til dis eller miljøgifter på celler i bufferen ikke er sett).</li>
	<li>Etter å gjenopprette den doble strandet RNA (dsRNA) i henhold til produsentens protokollen, plassere 1,5 mL rør som inneholder dsRNA-ekstrakt på varme blokk ved 95 ° C i 5 min til denature dsRNA, og deretter umiddelbart plassere rør på is og ruge for mer enn 2 min.</li>
	<li>Syntetisere cDNA ved å bruke en omvendt transkripsjon kit (se Tabell for materiale). Legg 4 µL denaturert viral RNA løsning til en PCR rør som inneholder 16 µl av blanding (tabell 1) og bland det nøye med en pipette for ikke å generere bobler. Nedspinning rørene.</li>
	<li>Utføre omvendt transkripsjon med en termisk cycler under forutsetning vist i tabell 2. Hvis cDNA ikke brukes umiddelbart, lagre PCR røret som inneholder cDNA på 20 ° C i opptil 1 år.</li>
	<li>Bruke primerne for kvantitative PCR (fremover, 5-ACCATCTACACATGACCCTC-3', omvendt, 5-GGTCACATAACGCCCC-3")14 og en sonde sette en avsluttes (qPCR sonder; 5'- / FAM/ATGAGCACA/slukkeren/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA /-3"), målretting den 963-1049 regionen NSP3 genomet segment av rotavirus (ST3 press, GenBank: X81436). Merk: Avsluttes settes inn i sonden designet av Zeng et al.14
</li>
	<li>Fortynne den standard plasmider serielt (101 til 106 Kopier/mL) med PCR Vurder vann til qPCR blandingen (tabell 3) og gjøre master blandingen (20 µL/sampling) for qPCR etter Tabell 4.</li>
	<li>Legge til 20 µL av master miksen av en 96-brønns PCR plate, og bland 5 µL av cDNA prøver eller 5 µL av den standard plasmider av pipettering 10 ganger. Starte reaksjonen av qPCR systemet i henhold til betingelsene som er vist i Tabell 4.</li>
	<li>For å beregne rotavirus genomet bundet til MA104-celleoverflaten, utføre lineær regresjon mellom Ct verdiene og kjente genomet antall en standard plasmider og anslå prøvens genomet mange. Deretter beregne forholdet mellom virion tall binding til celler (Gt) til de i den første inoculum (G0).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rna+Virus+Mutations.">Rna Virus Mutations.</a> Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).</li><li>Gouvea, V., Brantly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+rotavirus+a+population+of+reassortants?.">Is rotavirus a population of reassortants?.</a> Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).</li><li>Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-chlorine+disinfection+as+a+selection+pressure+on+norovirus.">Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).</li><li>Ghosh, S., Kobayashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genomic+analysis+of+rotavirus+strains:+current+status+and+future+prospects.">Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects.</a> Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).</li><li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2008+estimate+of+worldwide+rotavirus-associated+mortality+in+children+younger+than+5+years+before+the+introduction+of+universal+rotavirus+vaccination+programmes:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).</li><li>Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+and+correlates+of+protection+for+rotavirus+vaccines.">Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines.</a> Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).</li><li>Santos, N., Hoshino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+distribution+of+rotavirus+serotypes/+genotypes+and+its+implication+for+the+development+and+implementation+of+an+effective+rotavirus+vaccine.">Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine.</a> Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).</li><li>Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylodynamic+analyses+of+rotavirus+genotypes+G9+and+G12+underscore+their+potential+for+swift+global+spread.">Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread.</a> Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).</li><li>Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+molecular+epidemiology+of+rotavirus+infection+after+introduction+of+monovalent+rotavirus+vaccination+in+Scotland.">Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland.</a> Vaccine. 35, 156-163 (2017).</li><li>Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+rotaviruses+in+continuous+human+and+monkey+cell+lines+that+vary+in+their+expression+of+integrins.">Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins.</a> Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).</li><li>Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+a2b1+and+a4b1+can+mediate+SA11+rotavirus+attachment+and+entry+into+cells.">Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells.</a> Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).</li><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).</li><li>Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+antiviral+action+of+plant+antimicrobials+against+murine+norovirus.">Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).</li><li>Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+quantitative+RT-PCR+for+the+detection+of+rotavirus+in+acute+gastroenteritis.">One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis.</a> Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).</li><li>Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+evaluation+of+rotavirus-cell+interactions:+identification+of+an+enterocyte+ganglioside+fraction+that+mediates+group+A+porcine+rotavirus+recognition.">Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition.</a> Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).</li><li>Br&#252;ssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+milk+immunoglobulins+for+passive+immunity+to+infantile+rotavirus+gastroenteritis.">Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).</li><li>Outzen, H., Berglund, G. I., Smal&#229;s, A. O., Willassen, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+and+pH+sensitivity+of+trypsins+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+in+comparison+with+bovine+and+porcine+trypsin.">Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).</li><li>Saxena, K., Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).</li><li>Yin, Y., Bijvelds, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+rotavirus+infection+and+antiviral+therapy+using+primary+intestinal+organoids.">Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids.</a> Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Våre protokollen for å måle den spesifikk vekstraten er lettere enn de foregående og kan tilpasses for andre virus hvis deres celle kultur-systemet ikke er ennå fastslått. I denne studien vi brukte RRV (G3P[3]) fordi denne belastningen kan danne plaketter enklere enn menneskelige rotaviruses ved MA104 linjer. Noen menneskelige rotavirus stammer form ikke plakk i denne cellen linje. Derfor, i stedet for plakk analysen, fokus danner enhet (FFU) analysen15 eller median vev kultur smittsomme dose (TCID50) analysen kan brukes for mange rotavirus stammer16. Presentert protokollen for å bestemme spesifikke veksten kan brukes for andre virus, men er ikke egnet for virus som ingen etablert celle kultur-systemet er etablert. Før du starter eksperimentet for bestemte veksten, det er bedre å vite på forhånd når virus smittsomme titer begynner å øke og når den stasjonære fasen i en foreløpig test. Hvis det finnes for mange plaketter, bør plakk analysen utføres igjen etter endre fortynning hastigheten av virus eksemplar. Timer etter infeksjon (hpi) for oppsamling er også viktig fordi skråningen av eksponensiell vekstfase kan undervurderes hvis det riktig tidspunktet å nå den stasjonære fasen er savnet. I tilnærmingen til endrede Gompertz forretningsmodell, bør en determinantens koeffisient alltid beregnes og sjekket. Hvis fitness endret Gompertz modellen er lav, målbudsjett andre vekst modeller som endret logistikk model12 .
I håndtering celler, når du fjerner middels eller virus inoculum, PBS for vask eller agarose gel for plakk analysen raskt legges til hver brønn av en celle kultur plate å hindre cellene fra tørrhet. Samtidig, må du forsiktig helle PBS eller agarose celler ikke å koble fra brønner. Dette trinnet er det viktigste i begge analyser (trinn 3.9 og 3.11). Hvis plakk analysen har for mange eksempler, anbefaler vi subdividing agarose gel (100 mL hver maksimalt anbefales) i flere medium flasker og holde flasker varme før like før bruk siden agarose gel er styrket innen ca 10 min på rommet temperatur. Siden trypsin er utsatt for høy temperatur17, bør en trypsin løsning legges til et medium og agarose for plakk analysen etter tilstrekkelig nedkjøling.
I celle-bindende analysen, må inkubasjonstiden for virus binding til cellene gjøres i 4 ° C å hindre invasjon av cellene. Ifølge Gillings metode13er celler utsatt for tørke ved lave temperaturer, så forsiktig risting er nødvendig hvert 15 min under inkubasjon. RNA utvinning kit benyttes her kan erstatte andre kits. Skråningen av standardkurve i RT-qPCR bør være ca 3,3 determinantens koeffisient bør være mer enn 0,98. Forhold til fluorescens mikroskopet visualisere lokalisering av virus i celler, er analysen raskere og enklere å bruke fordi binding av fluorescerende stoffer virus ikke er nødvendig.
Nylig menneskelige intestinal enteroid (HIE), viser en lignende mobil komposisjon og funksjon som menneskelige mage epitel, har blitt tilgjengelig for rotavirus forplantning18. Bruk av HIE kan aktivere oss å evaluere spesifikk vekstrate og celle-bindende evne til ikke-culturable stammer av rotavirus. Også, begge eksperimenter beskrevet her kan brukes til evalueringen av narkotika effekter på både fenotyper19. Protokollene presenteres her gjør det mulig å diskutere kvantitativt endringene i fenotypen parameterverdier av rotavirus stammer under ulike forhold.

RNA-virus danner en genetisk ulike befolkning, kjent som quasispecies1, deres Mutasjonshastigheten,2 som er høyere enn DNA-baserte organismer. Befolkningen strukturen i quasispecies påvirkes av befolkningen genetiske faktorer, inkludert mutasjon, utvalg press og genetisk drift. Belastninger innenfor en enkelt genetisk avstamning kan vise Norge på grunn av genetisk mangfold. For eksempel viste Rachmadi et al. at gratis klor følsomhet var forskjellig blant murine norovirus stammer som stammer fra en plakett-renset belastning S7-PP33.
Rotaviruses (slekt rotavirus i reoviridae familien) er ikke innhyllet ds RNA virus danner quasispecies2. I tillegg til befolkningen genetiske faktorer beskrevet ovenfor, påvirker genomet reassortment genetisk mangfold av rotavirus fordi dette viruset har 11 segmentert genomer4. Rotaviruses forårsake diaré hovedsakelig blant barn og spedbarn dødsfall i 2013 var anslått om 250.0005. To vaksiner er i bruk i flere land og er effektive i å redusere byrden av rotavirus infeksjon, men noen forskere nå diskuterer tilstedeværelsen av vaksine-flukt mutanter6,7,8, 9. karakterisering av disse mutanter er viktig å forstå mekanismene som vaksine-escape.
Her presenterer vi protokoller for to analyser for å vurdere spesifikk vekstrate og celle-bindende evne til rotavirus for å forstå fenotypiske forskjellene mellom stammer/mutanter. Vekstkurve av rotaviruses har blitt presentert i tidligere rapporter10, men vekst parametre som spesifikk vekstrate er ikke vanligvis målt. En celle-bindende analysen utført tidligere omfatter immunofluorescent flekker teknikk11. Her viser vi enklere metoder av benytter plakk analysen og RT-qPCR, som tillater oss å diskutere kvantitativt forskjellen i viral fenotyper. Disse metodene er passende for karakterisering av rotavirus fenotyper og endelig bidra til bygging av nye vaksiner effektivt for flere genotyper.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7500 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-EPI</td>
			<td>Nakalai Tesque, Inc</td>
			<td>01101-34</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>194-02875</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05900</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05901</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward / Reverse primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>140-00932</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-) &#34;Nissui&#34;</td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05913</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liguid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR039A</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR037A</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52904</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>199-05985</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>198-01675</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 6-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancrease</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0303-1G</td>
			<td>Activate for rotavirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus

Rotavirus er paranoid Hovedfaktoren for infantile diaré. Det er en dobbel-strandet (ds) RNA-virus og danner en genetisk ulike befolkning, kalles quasispecies, på grunn av deres høye Mutasjonshastigheten. Her beskriver vi hvordan måle den spesifikk vekstraten og celle-bindende evne til rotavirus som sin fenotyper. Rotavirus er behandlet med trypsin å gjenkjenne celle reseptor og deretter inokulert i MA104 cellekultur. Nedbryting, inkludert viral progenies, samles midlertidig. Plakk analysen brukes til å bekrefte virus titer (plakk-forming enhet: pfu) av hver samlet nedbryting. Spesifikk vekstrate anslås ved passende tid-retters data pfu/mL endret Gompertz modellen. I analysen av celle-binding, er MA104 celler i en 24-vel plate infisert med rotavirus og ruges i 90 min ved 4 ° C i rotavirus adsorpsjon til celle reseptorer. En lav temperatur begrenser rotavirus fra invadere vert cellen. Etter vask for å fjerne ubundet virions, er RNA Hentet fra virions knyttet til celle reseptorene etterfulgt av cDNA syntese og omvendt-transkripsjon kvantitative PCR (RT-qPCR). Disse protokollene kan brukes for å undersøke de fenotypiske forskjellene viral stammer.

En oversikt over to protokoller for spesifikk vekstrate og celle-bindende analysen av plakk-renset RRV stammer er vist i figur 1A og 2A, henholdsvis.
I analysen for bestemte veksten når den endelige virus titer mer enn 107 pfu/mL ved overføring på MT75 kolbe. Hvis maksimal konsentrasjon er lavere enn 107 pfu/mL, den MA104 cellen kan ikke ha blitt confluent eller RRV ble ikke aktivert godt av trypsin. Noen vekst modeller er tilgjengelig for å estimere den spesifikk vekstraten bruker smittsomme enhet data. I denne protokollen, er endret Gompertz model12 ansatt som et eksempel; <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
der N0 (104 pfu/mL i denne studien) og Nt (104 til 108 pfu/mL) er det virus smittsomme titer (pfu/mL) på 0 og t (eksempel: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, henholdsvis er asymptotisk verdien [log (N∞/N0 )] (eksempel: 3-4), µ er bestemt vekstraten [1/h], e er den Napier konstant og λ er lag perioden [h]. Modell parametere er innhentet av funksjonen Problemløseren analyse programvaren, som reduserer summen av kvadratene av differansen mellom de faktiske og modellerte verdiene. I eksemplet i figur 1Bden spesifikk vekstraten (μ) er anslått til 0.197 [1/h] og lag perioden (λ) er 6.61 [h] ved å bruke metoden minst kvadrat en modifisert Gompertz modell, og den relative virus titer på den stasjonære fasen til første titer ( log skala) (A) er 3,15 [log (N∞/N0)]. Vi har testet 6 rotavirus kloner totalt, og beregningene av bestemte veksten varierte fra 0,19 til 0,27 [1/h]. Disse estimert verdiene er pålitelig fordi koeffisient av besluttsomhet verdier i modellen montering er mer enn 0,98.
RRV virions binding til celle overflater var ca 103 Kopier/mL (bindende effektivitet var rundt 1%) ved en 24-vel plate for celle-bindende analysen (figur 2B). Analysen utføres vanligvis tre ganger for hver prøve, og hvis et stort avvik i antall kopier er observert i et utvalg, noe problemer som over vask og utilstrekkelig aktivering av RRV av trypsin oppstå. Ct verdien av qPCR overstiger ca 36,0 er ikke å foretrekke, og regnes for å være under gjenkjenning grensen vår qPCR tilstand.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volum / 1 reaksjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x PrimeScript Buffer</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript RT enzym bland jeg</td>
			<td>1.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo dT Primer</td>
			<td>1.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tilfeldig 6 mers</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Deionisert destillert vann</td>
			<td>6.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ssRNA utvalg</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td>20.0 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Master bland komposisjon for cDNA syntese av rotavirus genom.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur [° C]</td>
			<td>Tid</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Reaksjon tilstand for cDNA syntese av rotavirus genom.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volum/1 reaksjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Premix Taq</td>
			<td>12.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Videresende primer (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Omvendt primer (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonden (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Referanse fargestoff II</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Deionisert destillert vann</td>
			<td>5.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA utvalg</td>
			<td>5.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td>25 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Master bland sammensetning for kvantitative PCR rotavirus et genom.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur [° C]</td>
			<td>Tid</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">45 syklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 4: Reaksjon betingelse for kvantitative PCR av rotavirus et genom.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> Figur 1: skjematisk oversikt over estimering av rotavirus vekst og vekstkurven av rotavirus. (A) smittsomme enheten rotavirus måles med plakett analysen. (B) kurven (blå linje) var tilnærmes med endrede Gompertz modell basert på observerte data i vårt laboratorium (hvit sirkel). Spesifikk vekstrate [µ]; 0.197 [h-1], lag periode (λ); 6.61 [h], den relative virus titer på den stasjonære fasen til den første titer (logaritmisk skala) (A); 3.15 [log (N∞/N0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> Figur 2: skjematisk oversikt og representant resultatet av celle-bindende analysen av fem RRV stammer renset fra plaketter i vårt laboratorium. (A) A celle kultur plate inokulert med rotavirus er ruges ved 4 ° C i hemme virus invasjonen i celler. Etter inkubasjon og fjerne de ubundne virus partiklene til celler, kvantifisere antall genomer stammer fra bundet virus partikler til celleoverflaten med RT-qPCR. (B) resultatet av celle-bindende analysen ble vist som bindende effektivitet (%), som var forholdet mellom bundet virus partikler de som finnes i inoculum. Fet bar: median, slutten av boksene: kvartil avvik, slutten av linjen: maksimum og minimum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Her presenterer vi to protokoller, en for å måle den spesifikk vekstraten og den andre cellen-bindende mulighet for rotavirus plakk analysen og RT-qPCR. Disse protokollene er tilgjengelig for å bekrefte forskjellene i fenotyper mellom rotavirus stammer.

Analyser for spesifikk vekstrate og celle-bindende evne til Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Ved hjelp av analysene som presenteres her, kan forskjellen i fenotype blant rotavirusstammer evalueres, hvor unike stammer isoleres. Spesielt undersøkes fenotypisk endring av desinfeksjonsmiddelresistente stammer av rotavirus. For å oppnå klare kvantitative utganger ved hjelp av plakkanalysen, er det viktig å velge en passende kombinasjon av rotavirusstamme og serum, der rotaviruset er godt tilpasset serumet.Å demonstrere prosedyren vil være Syun-suke Kadoya, en doktorgradsstudent fra laboratoriet mitt. Fjern en CryoTube som inneholder MA104-cellelinjer fra den flytende nitrogenbeholderen. Plasser CryoTube i et vannbad på 37 grader Celsius for å tine cellene.Tilsett en milliliter cellefjæring til 20 milliliter av serumholdig medium i en T75 kolbe. Inkuber kolben i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% CO2 i to til tre dager. Når cellemonolaget når 80% samløpet, fjern supernatanten og vask cellene to ganger med fem milliliter 1X Dulbeccos PBS.Tilsett fire milliliter på 0,05% trypsin-EDTA til kolben, og inkuber ved 37 grader Celsius i fem minutter for å løsne cellene fra kolben. Overfør cellefjæringen til et 15 milliliter rør, og sentrifuge ved 190 g i fem minutter. Kast de overnaturante og gjenoppuss de pelleterte cellene i ett milliliter serumholdig medium.Deretter fortynner de resuspended cellene 100 ganger med mediet. Tilsett tre milliliter av den fortynnede cellesuspensjonen til hver brønn av en seksbrønns plate for plakkanalysen. Tilsett en milliliter av den fortynnede cellefjæringen til hver brønn av en 24-brønnsplate for cellebindingsanalysen.Inkuber platene i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% CO2 undermettet damp i to eller tre dager. Overfør et rør som inneholder en milliliter av virussuspensjonen i serumfritt medium fra lagring ved minus 80 grader Celsius til et 37 grader Celsius vannbad for å tine. Tilsett ett mikrogram per mikroliter trypsin fra svinepankreas til en milliliter virussuspensjon og deretter virvel.Inkuber virussuspensjonen ved 37 grader Celsius og 5% CO2 undermettet damp i 30 minutter. Fortynn den aktiverte virussuspensjonen med serumfritt medium for å justere mangfoldet av infeksjon, eller MOI, til 0,1 pfu per celle. Legg til en milliliter av fortynnet virussuspensjon til MA104-celler i en T75-kolbe tre dager etter celleplating.Inkuber cellene med virus ved 37 grader Celsius i en time, forsiktig risting av kolben hvert 15. Tilsett deretter 30 milliliter serumfritt medium som inneholder fire mikrogram per milliliter trypsin fra svinepankreas til kolben. Inkuber kolben ved 37 grader Celsius og 5% CO2 undermettet damp.Samle en milliliter av supernatant i kolben på null, seks, 12, 18, 24 og 36 timer etter infeksjon, og erstatte supernatant i 1,5 milliliter typer ved hjelp av en pipette. Utuk en fryse-tine syklus innen 15 minutter ved minus 80 grader Celsius etterfulgt av en 15-minutters smelte i et vannbad på 37 grader Celsius. Deretter sentrifugere rørene på 12, 600 g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Samle supernatant. Filtrer supernatanten med et destillert 0,2 mikronfilter for å fjerne cellefraksjonen. Oppbevar supernatanten ved minus 80 grader Celsius til du bruker den på plakkanalysen for måling av virustitreren.Når du er klar til å utføre plakkanalysen, plasser rørene som inneholder det oppsamlede supernatanten i et vannbad ved 37 grader Celsius. Legg trypsin til en milliliter 10-ganger fortynnet prøve, og inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter. I løpet av denne 30-minutters inkubasjonen vasker du FORSIKTIG MA104-cellene i en seksbrønnsplate med to milliliter 1X PBS etter å ha fjernet serumholdig medium.Fortynne de inkuberte prøvene med serumfritt medium og inokulerer en milliliter av den fortynnede prøven i hver brønn. Inkuber platen i 90 minutter ved 37 grader Celsius og 5% CO2 undermettet damp, forsiktig rister platen hvert 15. Etter inkubasjon, fjern inokulumet fra seksbrønnplaten.Tilsett fire mikrogram per milliliter trypsin til det tilberedte mediet. Forsiktig, men legg umiddelbart til tre milliliter av mediet blandet med agarose gel til hver brønn. La agarosegelen stivne ved romtemperatur i mer enn 10 minutter.Deretter inkubere platen i to dager ved 37 grader Celsius og 5% CO2 undermettet damp. Deretter legger du til en milliliter med 0,015 % nøytral rød oppløsning fortynnet med 1X PBS til hver brønn, og inkuberer med de samme forholdene. Fjern fargestoffet etter tre timer og fortsett å inkubere i en dag.Neste dag teller du antall plaketter i hver brønn og beregner pfuen per milliliter. Kontroller nøye cellekonløpet før plakkanalysen for å sikre plakktallene. For cellebindende analyse, legg til ett mikrogram per mikroliter trypsin fra en svinepankrease til en milliliter av virussuspensjonen, og deretter virvel.Fortynn virussuspensjonen med serumfritt medium for å justere MOI til en pfu per celle. Vask MA104-cellene to ganger i en 24-brønns plate med en milliliter trisbufret saltvann. Inokuler nå cellene med 100 mikroliter fortynnet virussuspensjon i hver brønn av 24-brønnplaten.Inkuber platen ved fire grader Celsius i 90 minutter med mild risting hvert 15. Fjern viruset inoculum, og vask cellene to ganger med en milliliter tris-bufret saltvann. For å trekke ut rotavirusets dobbelttrådet RNA, tilsett 140 mikroliter 1X PBS og 560 mikroliter av RNA-ekstraksjonsbufferen til hver brønn.Bland tilstrekkelig med en pipette til dis av celler i bufferen ikke er sett. Etter å ha gjenopprettet den dobbeltt strandede RNA, i henhold til produsentens protokoll, plasserer du de 1,5 milliliter rørene, som inneholder det dobbeltt strandede RNA-ekstraktet, på en varmeblokk ved 95 grader Celsius i fem minutter for å fornekte RNA. Deretter plasserer du umiddelbart rørene på is og inkuberer i mer enn to minutter.Syntetisere cDNA ved hjelp av et omvendt transkripsjonssett. Tilsett fire mikroliter av denaturert viral RNA-løsning til et PCR-rør som inneholder 16 mikroliter reaksjonsblanding, og bland den forsiktig med en pipette for ikke å generere bobler. Etter å ha snurret ned rørene, utfør omvendt transkripsjon med en termocycler.For kvantitativ PCR, bruk en quencher-sette inn sonde rettet mot 963 til 1, 049-regionen i NSP3 genomsegmentet rotavirus. Serialt fortynne standard plasmid med PCR-klasse vann, og fortsette å gjøre master mix for kvantitative PCR. Tilsett 20 mikroliter av masterblandingen i brønnene på en 96-brønns PCR-plate.Bland deretter fem mikroliter cDNA-prøver eller fem mikroliter av standardplasmid ved å pipettering 10 ganger. Utfør kvantitativ PCR i henhold til betingelsene i tekstprotokollen. Til slutt beregner du rotavirusgenomet som er bundet til MA104-celleoverflaten som beskrevet i tekstprotokollen.Vist her er en vekstkurve av rotavirus. Ved å bruke den minst kvadratiske metoden på en modifisert Gompertz-modell, er den spesifikke vekstraten anslått til å være 0,197, og etterslepperioden er anslått til 6,61 timer. Den relative virustitreren i den stasjonære fasen til den første titeren er 3,15.Av de seks testede rotavirusklonene varierte de estimerte verdiene for den spesifikke vekstraten fra 0,19 til 0,27. Disse estimerte verdiene er pålitelige fordi koeffisienten av fastsettelsesverdier i modelltilpasning er mer enn 0,98. Resultatet av cellebindingsanalysen vises som bindende effektivitet, som er forholdet mellom bundne viruspartikler og de som er tilstede i inokulumet.Våre RV virions binding til celleoverflater er ca 10,000 eksemplarer per milliliter med en bindende effektivitet på rundt 1%når du bruker en 24-brønns plate for cellebindende analysen. Siden kultiverte celler er følsomme for fysiske påkjenninger, vær forsiktig å helle bufferen og agaren forsiktig, men raskt. I hovedsak har et nytt system for virusene blitt introdusert.Ved hjelp av dette systemet kan vi evaluere den virkelige cellebindende evnen og spesifikk vekstrate med instrumenter. Vår protokoll er en fordel i å måle fenotypisk egenskap. Ved å sjekke forskjellige av nylig fremvoksende stammer, kan du bidra til å evaluere sine nye vaksiner for virusene.Virusene er utpekt som BSL-2 patogener, så du må forberede BSL-2 eksperimentelle rom for å utføre denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Analyser for identifisering av nye antivirale midler mot blåtungevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: High-throughput Kvantifisering av Colony Vekst og oppholdstid

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediert Isotermisk forsterkning (LAMP) Analyser for Artenes spesifikke Påvisning av<em&gt; Eimeria</em&gt; Som infiserer Kyllinger

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Parvise Vekst Konkurranse analyse for Bestemme Replication Fitness av humant immunsviktvirus

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Tidlig Viral Entry Analyser for identifisering og evaluering av Antiviral Forbindelser

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative analyser for påvisning og karakterisering av Protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Rask og konkret vurdering av halogene peroxydaseaktivitet i Leukocytt-anriket blodprøver

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Analyser for å studere rollen til Vitronectin i bakteriell vedheft og Serum motstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...