Name: assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00
Duration: 10 min 49 s
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Este trabalho foi apoiado pelo projeto "O saneamento valor cadeia: projetando sistemas como Eco-Comunidade valor saneamento", ResearchInstitute para a humanidade e a natureza (RIHN, projeto No.14200107).

1. preparação média
<ol><li>Para tornar um meio de cultura celular (contendo soro médio), adicione 4,7 g de pó MEM da águia para 500 mL de água destilada. Autoclave a 120 ° C por 20 min e deixe o médio fresco à temperatura ambiente. Adicionar o soro fetal bovino (concentração final: 10%), L-glutamina (2 mM), penicilina estreptomicina (1%) e bicarbonato de sódio (1,125 g/L). Armazenar a 4 ° C para 1 mês.</li>
	<li>Prepare o suporte de soro-livre para a propagação de vírus, conforme descrito na etapa 1.1, mas sem o soro fetal bovino. Armazenar a 4 ° C para 1 mês.</li>
	<li>Para o ensaio de placa, esterilize 100 mL de meio MEM da águia (não contendo vermelho de fenol) em autoclave. Deixe o meio arrefecer à temperatura ambiente e em seguida, adicione 2% FBS, 2% penicilina estreptomicina, 4 mM L-glutamina e 2,25 g/L NaHCO3. Loja a 4 ° C.</li>
	<li>Para o ensaio de placa, esterilize 100 mL de gel de agarose 2,5% por autoclave. Prepare o gel no mesmo dia em que o ensaio da chapa é conduzido. Armazene o gel a 47 ° C em banho-maria.</li>
</ol>2. cultura de pilha
<ol><li>Remova um criotubo contendo linhas de células MA104 do contêiner de nitrogênio líquido. Coloque o criotubo em banho-maria a 37 ° C para descongelar as células. Adicione 1 mL de suspensão de células para 20 mL do meio de soro contendo um balão T75. Incube o frasco em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por 2 ou 3 dias. Nota: A concentração celular final na suspensão é cerca de 106 células/mL.</li>
	<li>Uma vez que a monocamada celular atinge 80% confluência, remover o sobrenadante e lavar as células duas vezes com 5 mL de 1X PBS de Dulbecco (solução salina tamponada fosfato).</li>
	<li>Adicionar 4 mL de 0,05% do trypsin-EDTA no balão e incubar a 37 ° C por 5 min separar as células do recipiente. Transferi a suspensão de células para um tubo de 15 mL e centrifugar 190 x g por 5 min.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas (106 células) em 1 mL de soro contendo médio preparado em 1.1. Diluir as células ressuspensa em 100-fold com o meio.</li>
	<li>Adicione 3 mL de suspensão de célula diluídos a cada poço de 6-bem (para o ensaio da chapa) ou placas de 24 poços (para o ensaio de ligação de celular), respectivamente. Incube as placas em uma incubadora a 37 ° C e 5% CO2 sob o vapor saturado por 2 ou 3 dias. Nota: Um balão T75 é apropriado para coletar as amostras de tempo-curso porque o volume de amostra do líquido sobrenadante (1 mL) pode ser ignorado em comparação com o volume total de sobrenadante (30 mL). Enquanto isso, o título infeccioso do vírus em cada sobrenadante é medido pelo ensaio da chapa, que normalmente é realizado usando uma placa de 6. Uma placa de 24 é utilizada para o ensaio de ligação de celular.</li>
</ol>3. taxa de crescimento específico de rotavírus
Nota: Rotavírus Rhesus (RRV, genótipo: G3P[3]) é utilizada no presente protocolo porque RRV pode rapidamente e facilmente formam placas com células MA104.
<ol><li>Lugar de um tubo contendo 1 mL de suspensão de vírus (107 pfu/mL) em meio livre de soro armazenado a-80 ° C em banho-maria a 37 ° C para descongelar. Adicione 1 µ g / µ l tripsina de pâncreas de suínos para 1 mL da suspensão de vírus (concentração final de tripsina é 4 µ g/mL) e em seguida vórtice. Incube a 37 ° C e 5% CO2 sob o vapor saturado por 30 min a suspensão de vírus. Nota: Tripsina de outras fontes pode ser usada, mas o efeito sobre a infecciosidade do rotavírus precisa ser testado com antecedência.</li>
	<li>Dilua a suspensão de vírus ativado com um meio livre de soro para ajustar a multiplicidade de infecção (MOI) a 0,1 pfu/célula.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de suspensão de vírus diluído para linhas de células MA104 (80% de confluencia) num balão T75 3 dias após a célula chapeamento (2.1), incubar a 37 ° C, durante 1 h e agite suavemente o frasco a cada 15 min.</li>
	<li>Em seguida, adicione 30 mL de um meio livre de soro contendo 0,13 µ g/mL de tripsina de um pâncreas de suínos para o balão. Incube o frasco a 37 ° C e 5% CO2 sob o vapor saturado.</li>
	<li>Coletar 1 mL do sobrenadante no frasco em 0, 6, 12, 18, 24 e 36 (e/ou 48) pós-infecção h (hpi) e substituir o sobrenadante em tubos de 1,5 mL com uma pipeta.</li>
	<li>Realizar o congelamento (-80 ° C) e derreter em banho-maria a 37 ° C ciclo três vezes. Centrifugar os tubos a 12.600 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Recolha o sobrenadante.</li>
	<li>Filtre o sobrenadante com um filtro de água destilada 0,2 µm para remover a fração de célula. Loja a-80 ° C sobrenadante na geladeira até aplicá-lo para o ensaio de placa para medir a concentração de vírus.</li>
	<li>Coloque os tubos contendo o sobrenadante coletado (passo 3.5) em banho maria a 37 ° C. Adicionar 4 tripsina µ g/mL para um 1 mL da amostra diluída 10 vezes e incubar a 37 ° C por 30 min.</li>
	<li>Durante a incubação 30 min em 3.8, para começar o ensaio da chapa para a medição do título de vírus obtido de amostras de curso do tempo (passo 3.5), lave as células MA104 duas vezes em uma placa de 6 com 2 mL de 1X PBS depois de retirar o meio contendo soro.</li>
	<li>Serialmente diluir as amostras incubadas com um meio livre de soro e inocular 1 mL da amostra diluída em cada poço. Incubar a placa por 90 min a 37 ° C e 5% CO2 sob o vapor saturado e agite suavemente a placa cada 15 min.</li>
	<li>Após a incubação, remova o inóculo a placa 6. Adicione 4 tripsina µ g/mL para o meio preparado (etapa 1.3). Suavemente, mas imediatamente adicione 3 mL do meio misturado com gel de agarose (a proporção é de 1:1) para cada poço.</li>
	<li>Manter a placa na temperatura de quarto por mais de 10 minutos (até que o gel de agarose, torna-se sólido) e incubar durante 2 dias a 37 ° C e 5% CO2 sob o vapor saturado. Nota: Despeje o meio misturado com ágar da borda do poço.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de 0.015% solução de vermelho neutro diluída com 1X PBS a cada poço e incubar a 37 ° C e 5% CO2 sob o vapor saturado. Remover o corante após 3h e incubar durante 1 dia em 37 ° C e 5% CO2 sob o vapor saturado.</li>
	<li>No dia seguinte, contar o número de placas em cada poço e calcular o pfu/mL. Verifique cuidadosamente a confluência de célula antes do ensaio de placa para assegurar os números da placa.</li>
</ol>4. célula de ensaio
Nota: Este protocolo é baseado em relatório13 do Gilling.
<ol><li>Adicione 1 µ g / µ l tripsina de um pâncreas de suínos para 1 mL da suspensão de vírus (concentração final de tripsina é 4 µ g/mL) e em seguida vórtice (na mesma maneira como no 2.1). Dilua a suspensão de vírus com um meio livre de soro para ajustar o MOI de 1 pfu/célula.</li>
	<li>Em seguida, lavar as células MA104 duas vezes na placa de 24 com 1 ml de tampão salino Tris (TBS; 2,53 g/L Tris base, 6,54 g/L NaCl, 0,3 g/L de KCl, Na2HPO4 para chegar a 1 L com água destilada de 0,046 g/l).</li>
	<li>Inocular a 100 µ l de suspensão de vírus diluídos a cada poço de uma placa com células de 24 e incubar a 4 ° C por 90 min, com agitação suave cada 15 min.</li>
	<li>Remover o inóculo de vírus e lavar as células duas vezes com 1 mL de TBS. Para extrair a dupla-hélice do RNA (ds) do rotavírus, adicionar 140 µ l de 1X PBS e 560 µ l de buffer de extração de RNA (ver Tabela de materiais) para cada poço. Misture adequadamente com uma pipeta (cerca de 10x ou até que a névoa ou o contaminante de células no buffer não é visto).</li>
	<li>Depois de se recuperar o RNA encalhado dobro (dsRNA) de acordo com o protocolo do fabricante, coloque os tubos de 1,5 mL contendo o extrato de dsRNA sobre um bloco de calor a 95 ° C por 5 min desnaturar o dsRNA, imediatamente coloque os tubos no gelo e incubar durante mais de 2 min.</li>
	<li>Sintetizar o cDNA usando uma transcrição reversa kit (veja a Tabela de materiais). Adicionar 4 µ l da solução de RNA viral desnaturada para um tubo PCR contendo 16 µ l da mistura (tabela 1) e misturar cuidadosamente com uma pipeta para não gerar bolhas. Spin para baixo os tubos.</li>
	<li>Execute a transcrição reversa com um termociclador sob a condição mostrada na tabela 2. Se o cDNA não for usado imediatamente, armazene o tubo do PCR contendo o cDNA a-20 ° C por até 1 ano.</li>
	<li>Usar os primers para PCR quantitativo (para a frente; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', reverso; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 e uma sonda inserindo um quencher (qPCR sondas; 5'- / FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA-3'), direcionamento a 963 – 1049 região do segmento do genoma NSP3 de rotavírus (estirpe ST3, GenBank: X81436). Nota: Quencher é inserida a sonda desenhada por Zeng et al.14
</li>
	<li>Diluir o plasmídeo padrão em série (101 106 cópias/ml) com PCR, grau de água para a mistura de qPCR (tabela 3) e fazer a mistura de mestre (20 µ l/amostra) para qPCR tabela 4a seguir.</li>
	<li>Adicionar 20 µ l do mix mestre para o poço de uma placa PCR de 96 poços e em seguida, misture 5 µ l de amostras de cDNA ou 5 µ l do plasmídeo padrão pipetando 10 vezes. Inicie a reação do sistema qPCR de acordo com as condições mostrada na tabela 4.</li>
	<li>Para calcular o genoma de rotavírus vinculado à superfície de células MA104, regressão linear entre os valores de Ct e o número de genoma conhecido de um plasmídeo padrão de conduta e estimar o número de genoma do exemplo. Em seguida, calcule a relação de ligação de números do virion a células (Gt) no inóculo inicial (G0).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rna+Virus+Mutations.">Rna Virus Mutations.</a> Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).</li><li>Gouvea, V., Brantly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+rotavirus+a+population+of+reassortants?.">Is rotavirus a population of reassortants?.</a> Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).</li><li>Rachmadi, A. 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I., Smal&#229;s, A. O., Willassen, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+and+pH+sensitivity+of+trypsins+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+in+comparison+with+bovine+and+porcine+trypsin.">Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).</li><li>Saxena, K., Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).</li><li>Yin, Y., Bijvelds, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+rotavirus+infection+and+antiviral+therapy+using+primary+intestinal+organoids.">Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids.</a> Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Nosso protocolo para medir a taxa de crescimento específico é mais fácil do que as anteriores e pode ser adaptado para outros vírus, a menos que seu sistema de cultura de células ainda não foi estabelecido. Neste estudo, nós usamos RRV (G3P[3]) porque esta cepa pode formar placas mais fácil do que o rotavírus humanos quando usando linhas de células MA104. Algumas cepas de rotavírus humano não podem formar placa nesta linha de celular. Portanto, em vez de ensaio da chapa, o foco formando (FFU) ensaio15 ou mediana cultura do tecido infecciosa dose unitária (TCID50) ensaio pode ser aplicado para muitas cepas de rotavírus16. O protocolo apresentado para determinação da taxa de crescimento específico pode ser usado para outros tipos de vírus, mas não é adequado para o vírus para o qual não é estabelecido a nenhum sistema de cultura celulares estabelecidas. Antes de iniciar o experimento para a taxa de crescimento específico, é melhor saber com antecedência quando o título de vírus infecciosos começa a aumentar e atingir a fase estacionária em um teste preliminar. Se também muitas placas estão presentes, o ensaio de placa deve efectuar-se novamente depois de alterar a taxa de diluição das amostras de vírus. A pós-infecção horas (hpi) para coletar amostras também são importantes porque a inclinação da fase de crescimento exponencial pode ser subestimada, se o ponto de tempo adequado para alcançar a fase estacionária é perdido. Na aproximação pelo modelo de Gompertz modificado, um coeficiente de determinação sempre deve ser calculado e verificado. Se a aptidão para o modelo de Gompertz modificado é baixa, outros modelos de crescimento, tais como o modelo logístico modificado12 podem ser preferíveis.
Na manipulação de células, ao remover o inóculo médio ou vírus, a PBS para lavar ou agarose gel para ensaio de placa deve ser prontamente adicionados a cada um bem de uma placa de cultura de células para evitar que as células da secura. Ao mesmo tempo, você deve derramar delicadamente PBS ou agarose para células não para desconectar-se de poços. Este passo é o mais importante em ambos os ensaios (passo 3.9 e 3.11). Se o ensaio da chapa tem também muitas amostras, recomendamos subdividindo o gel de agarose (100ml cada máximo é recomendado) em várias garrafas médias e aquecer as garrafas até imediatamente antes da utilização desde agarose gel é solidificado dentro de cerca de 10 minutos no quarto temperatura. Tripsina é vulnerável a altas temperaturas,17, uma solução de tripsina deve ser adicionada a um médio e agarose para o ensaio de placa depois de arrefecer adequadamente.
No ensaio de ligação de celular, a incubação para ligação do vírus às células deve ser feita a 4 ° C para evitar a invasão das células. De acordo com o método de13, do Gilling células são propensas a secar em temperaturas baixas, por agitação suave é necessário cada 15 minutos durante a incubação. O kit de extração de RNA utilizado aqui pode ser substituído por outros kits. O declive da curva padrão em RT-qPCR deve ser aproximadamente 3.3, e o coeficiente de determinação deve ser superior a 0.98. Comparado com o microscópio de fluorescência para visualizar a localização do vírus nas células, o ensaio é mais rápida e fácil de usar porque a ligação de substâncias fluorescentes para vírus não é necessária.
Recentemente, enteroid intestinal humana (HIE), exibindo uma função e composição celular similar como epitélio gastrointestinal humano, tornou-se disponível para rotavírus propagação18. O uso de HIE pode permitir-nos avaliar a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de cepas não-viáveis de rotavírus. Além disso, os dois experimentos descritos aqui podem ser aplicados à avaliação dos efeitos da droga em ambos os fenótipos19. Os protocolos aqui apresentados tornam possível discutir quantitativamente as alterações nos valores de parâmetro do fenótipo das cepas de rotavírus em variadas condições.

Vírus de RNA formam uma população geneticamente diversa, conhecida como quasispecies1, por causa de sua taxa de mutação,2 que é maior do que de organismos baseados em DNA. Estrutura populacional em quasispecies é afetada por fatores genéticos população, incluindo a mutação, a pressão de seleção e deriva genética. As tensões dentro de uma única linhagem genética podem mostrar diferentes fenótipos devido à diversidade genética. Por exemplo, luzimeire et al mostrou que a sensibilidade de cloro livre foi diferente entre cepas de norovírus murino que se originou de uma estirpe de placa-purificado S7-PP33.
Rotavírus (rotavírus de género na família reoviridae) são vírus não-envelopado ds RNA formando quasispecies2. Além dos factores genéticos de população acima descritos, rearranjo do genoma afeta a diversidade genética de rotavírus porque este vírus tem 11 genomas segmentados4. Rotavírus causam diarreia, principalmente entre os bebés, e mortes infantis em 2013 foram estimados cerca de 250.0005. Duas vacinas estão em uso em vários países e têm sido eficazes na redução da carga de infecção por rotavírus, mas alguns pesquisadores a discutir a presença de vacina-fuga mutantes6,7,8, 9. a caracterização desses mutantes é importante compreender os mecanismos de fuga-vacina.
Aqui, apresentamos os protocolos para dois ensaios para avaliar a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus a fim de compreender as diferenças fenotípicas entre estirpes/mutantes. A curva de crescimento de rotavírus foi apresentada em anteriores relatórios10, mas geralmente não medem parâmetros de crescimento, tais como taxa de crescimento específico. Um célula-ensaio realizado anteriormente envolve o de técnica de coloração imunofluorescente11. Aqui mostramos os métodos mais fáceis de usar o ensaio da chapa e RT-qPCR, que nos permitem discutir quantitativamente a diferença em fenótipos virais. Estes métodos são apropriados para a caracterização de fenótipos de rotavírus e finalmente podem contribuir para a construção de novas vacinas eficazes para vários genótipos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7500 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-EPI</td>
			<td>Nakalai Tesque, Inc</td>
			<td>01101-34</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>194-02875</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05900</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05901</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward / Reverse primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>140-00932</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-) &#34;Nissui&#34;</td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05913</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liguid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR039A</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR037A</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52904</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>199-05985</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>198-01675</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 6-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancrease</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0303-1G</td>
			<td>Activate for rotavirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus

Contra o rotavírus é o principal fator etiológico para a diarreia infantil. É um vírus de RNA double-stranded (ds) e constitui uma população geneticamente diversa, conhecida como quasispecies, devido à sua taxa de mutação de alta. Aqui, descrevemos como medir a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus como seus fenótipos. Rotavírus é tratado com tripsina, a reconhecer o receptor de células e em seguida inoculado em cultura de células MA104. O sobrenadante, incluindo progênies virais, é coletado intermitentemente. O ensaio da chapa é usado para confirmar o título de vírus (unidade de deformação: pfu) de cada coletado sobrenadante. A taxa de crescimento específico é estimada por encaixe de dados tempo-curso de pfu/mL para o modelo de Gompertz modificado. No ensaio de ligação de celular, células MA104 em uma placa de 24 são infectadas com rotavírus e incubadas durante 90 min a 4 ° C para a adsorção de rotavírus para receptores celulares. Baixa temperatura impede de rotavírus de invadir a célula hospedeira. Após a lavagem para remover virions desacoplados, RNA é extraído de virions anexados a receptores celulares, seguidos de síntese do cDNA e transcrição reversa PCR quantitativo (RT-qPCR). Estes protocolos podem ser aplicados para investigar as diferenças fenotípicas entre estirpes virais.

Uma visão geral de dois protocolos para a taxa de crescimento específico e célula-ensaio de placa-purificado cepas RRV é mostrada na figura 1A e 2A, respectivamente.
No ensaio para a taxa de crescimento específico, o título de vírus final atinge mais de 107 pfu/mL ao propagar no frasco T75. Se a concentração máxima é inferior a 107 pfu/mL, a célula de MA104 pode não ter se tornado confluente ou RRV não foi ativada pela tripsina. Alguns modelos de crescimento estão disponíveis para estimar a taxa de crescimento específico usando os dados de unidade infecciosa. Neste protocolo, o de modelo de Gompertz modificado12 é empregado como um exemplo; <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
onde N0 (104 pfu/mL neste estudo) e Nt (104 108 pfu/ml) são o título vírus infecciosos (pfu/mL) em 0 e t (exemplo: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, respectivamente, o A é o valor assimptótico [log (N∞/N0 )] (exemplo: 3-4), μ é a taxa de crescimento específico [1/h], e é constante o Napier e λ é o período de atraso [h]. Parâmetros do modelo são obtidos pela função solver do software de análise, o que minimiza a soma dos quadrados da diferença entre os valores observados e modelados. No exemplo da figura 1B, a taxa de crescimento específico (µ) é estimada em 0,197 [1/h] e o período de defasagem (λ) é 6,61 [h] aplicando o método menos quadrado para um modelo de Gompertz modificado e o título de vírus relativo na fase estacionária para a concentração inicial ( escala de log) (A) é 3,15 [log (N∞/n0)]. Nós testamos 6 clones de rotavírus no total, e os valores estimados da taxa de crescimento específico variaram entre 0,19 e 0,27 [1/h]. Estes estimados valores são confiáveis porque o coeficiente de valores determinação na montagem do modelo é mais do que de 0,98.
Virions RRV vinculando a superfícies de células foram cerca de 103 cópias/mL (vinculando a eficiência foi de cerca 1%) quando usando uma placa de 24 para o ensaio de ligação de celular (Figura 2B). O ensaio é geralmente realizado três vezes para cada amostra, e se uma grande variação do número de cópia é observada em uma amostra, podem ocorrer alguns problemas como excesso de lavagem e insuficiente de ativação da RRV por tripsina. O valor de Ct da qPCR superior a cerca de 36,0 não é preferível e é considerado como abaixo de um limite de detecção em nossa condição de qPCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volume / 1 reação</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x PrimeScript Buffer</td>
			<td>Μ l 4.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript RT enzima mistura eu</td>
			<td>1,0 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo dT Primer</td>
			<td>1,0 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 mers aleatórias</td>
			<td>Μ l 4.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água destilada deionizada</td>
			<td>6,0 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>amostra de ssRNA</td>
			<td>Μ l 4.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>20,0 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Master mix de composição para a síntese do cDNA do genoma de rotavírus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura [° C]</td>
			<td>Tempo</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Condição de reação para a síntese do cDNA do genoma de rotavírus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Reação de volume/1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A pré-mistura Taq</td>
			<td>12,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Encaminhar a cartilha (10 µM)</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primeira demão reverso (10 µM)</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonda (10 µM)</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tintura de referência II</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água destilada deionizada</td>
			<td>5.5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>amostra de cDNA</td>
			<td>Μ l 5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>25 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Master mix de composição para PCR quantitativo de rotavírus um genoma.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura [° C]</td>
			<td>Tempo</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">ciclo 45</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4: Condição de reação de PCR quantitativo de rotavírus um genoma.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> Figura 1: visão geral esquemática da estimativa de crescimento de rotavírus e a curva de crescimento de rotavírus. (A), a unidade infecciosa de rotavírus é medido com o ensaio da chapa. (B), a curva (linha azul) foi aproximado pelo modelo de Gompertz modificado com base em dados observados em nosso laboratório (círculo branco). A taxa de crescimento específico [µ]; 0,197 [h-1], período lag (λ); 6,61 [h], o título de vírus relativo na fase estacionária com o título inicial final (escala log) (A); 3.15 [log (N∞/n0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> Figura 2: visão geral esquemática e resultado representativo de ligação de célula obter cinco estirpes RRV purificada das placas em nosso laboratório. (A), A placa de cultura de células inoculada com rotavírus é incubada a 4 ° C para inibir a invasão de vírus nas células. Após a incubação e removendo partículas virais não vinculadas às células, quantificar o número de genomas proveniente de partículas virais acopladas à superfície da célula com RT-qPCR. (B) o resultado da célula-ligação ensaio foi exibido como vinculando a eficiência (%), que foi a proporção de partículas virais acopladas aos presentes no inóculo. Bar em negrito: mediana, fim das caixas: desvio quartil, fim da linha: máximo e mínimo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Aqui nós apresentamos dois protocolos, um para medir a taxa de crescimento específico e outro para a capacidade de ligação de celular de rotavírus usando o ensaio de placa e RT-qPCR. Esses protocolos são disponível para confirmar as diferenças de fenótipos entre cepas de rotavírus.

Ensaios para a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Utilizando os ensaios aqui apresentados, a diferença no fenótipo entre as cepas de rotavírus pode ser avaliada, onde cepas únicas são isoladas. Especificamente, a alteração fenotípica de cepas resistentes a desinfetantes de rotavírus é investigada. Para obter saídas quantitativas claras usando o ensaio da placa, é fundamental selecionar uma combinação apropriada de cepa de rotavírus e soro, na qual o rotavírus está bem adaptado ao soro.Demonstrando o procedimento será Syun-suke Kadoya, um estudante de doutorado do meu laboratório. Remova um CrioTube contendo linhas celulares MA104 do recipiente de nitrogênio líquido. Coloque o CrioTube em um banho de água a 37 graus Celsius para descongelar as células.Adicione um mililitro da suspensão celular a 20 mililitros do meio contendo soro em um frasco T75. Incubar o frasco em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por dois a três dias. Uma vez que o monocamado de célula atinja 80% de confluência, remova o supernatante e lave as células duas vezes com cinco mililitros de PBS de 1X Dulbecco.Adicione quatro mililitros de 0,05% trypsin-EDTA ao frasco, e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos para separar as células do frasco. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 190 g por cinco minutos. Descarte o supernasce e resuspenque as células pelotas em um mililitro de meio contendo soro.Em seguida, diluir as células resuspended 100 vezes com o meio. Adicione três mililitros da suspensão da célula diluída a cada poço de uma placa de seis poços para o ensaio da placa. Adicione um mililitro da suspensão celular diluída a cada poço de uma placa de 24 poços para o ensaio de ligação celular.Incubar as placas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 vapor subsaturado por dois ou três dias. Transfira um tubo contendo um mililitro da suspensão do vírus em meio livre de soro do armazenamento a menos 80 graus Celsius para um banho de água de 37 graus Celsius para descongelar. Adicione um micrograma por microfeitor de trippsina do pâncreas suíno a um mililitro da suspensão do vírus e, em seguida, vórtice.Incubar a suspensão do vírus a 37 graus Celsius e 5% de CO2 subsaturado vapor por 30 minutos. Diluir a suspensão ativada do vírus com meio livre de soro para ajustar a multiplicidade de infecção, ou MOI, para 0,1 pfu por célula. Adicione um mililitro da suspensão do vírus diluído às células MA104 em um frasco T75 três dias após o revestimento celular.Incubar as células com vírus a 37 graus Celsius por uma hora, agitando suavemente o frasco a cada 15 minutos. Em seguida, adicione 30 mililitros de um meio livre de soro contendo quatro microgramas por mililitro de trippsina do pâncreas suíno ao frasco. Incubar o frasco a 37 graus Celsius e 5% de CO2 subsaturado vapor.Colete um mililitro do supernacido no frasco a zero, seis, 12, 18, 24 e 36 horas após infecção, e substitua o supernacido nos tipos de 1,5 mililitro usando uma pipeta. Conduza um ciclo de congelamento dentro de 15 minutos a menos 80 graus Celsius seguido de um derretimento de 15 minutos em um banho de água a 37 graus Celsius. Em seguida, centrifugar os tubos a 12.600 g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Pegue o supernatante. Filtre o supernascer com um filtro destilado de 0,2 mícnico para remover a fração celular. Armazene o supernaspeio a menos 80 graus Celsius até aplicá-lo no ensaio da placa para medir o titulador do vírus.Quando estiver pronto para realizar o ensaio da placa, coloque os tubos contendo o supernanato coletado em um banho de água a 37 graus Celsius. Adicione trippsina a um mililitro de amostra diluída de 10 vezes e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Durante esta incubação de 30 minutos, lave cuidadosamente as células MA104 em uma placa de seis poços com dois mililitros de PBS 1X depois de remover o meio contendo soro.Diluir em série as amostras incubadas com meio livre de soro e inocular um mililitro da amostra diluída em cada poço. Incubar a placa por 90 minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2 vapor subsaturado, agitando suavemente a placa a cada 15 minutos. Após a incubação, remova o inóculo da placa de seis poços.Adicione quatro microgramas por mililitro de trippsina ao meio preparado. Suavemente, mas imediatamente adicione três mililitros do meio misturado com gel de agarose a cada poço. Deixe o gel de agarose solidificar à temperatura ambiente por mais de 10 minutos.Em seguida, incubar a placa por dois dias a 37 graus Celsius e 5% de CO2 vapor subsaturado. Em seguida, adicione um mililitro de solução vermelha neutra de 0,015% diluída com PBS 1X para cada poço, e incubar com as mesmas condições. Retire o corante após três horas e continue incubando por um dia.No dia seguinte, conte o número de placas em cada poço e calcule o pfu por mililitro. Verifique cuidadosamente a confluência celular antes do ensaio da placa para garantir os números da placa. Para o ensaio de ligação celular, adicione um micrograma por microfeitor de trippsina de um pâncreas suíno a um mililitro da suspensão do vírus e, em seguida, vórtice.Diluir a suspensão do vírus com meio livre de soro para ajustar o MOI a um pfu por célula. Lave as células MA104 duas vezes em uma placa de 24 poços com um mililitro de soro fisiológico tris-tamponado. Agora inocular as células com 100 microliters de suspensão do vírus diluído em cada poço da placa de 24 poços.Incubar a placa a quatro graus Celsius por 90 minutos com agitação suave a cada 15 minutos. Remova o inóculo do vírus e lave as células duas vezes com um mililitro de soro fisiológico com três tampões. Para extrair o RNA de dupla renda do rotavírus, adicione 140 microliters de 1X PBS e 560 microliters do tampão de extração de RNA a cada poço.Misture adequadamente com uma pipeta até que a neblina das células no buffer não seja vista. Depois de recuperar o RNA de duplar encalhada, de acordo com o protocolo do fabricante, coloque os tubos de 1,5 mililitro, contendo o extrato de RNA de duplar, em um bloco de calor a 95 graus Celsius por cinco minutos para desnaturar o RNA. Em seguida, coloque imediatamente os tubos no gelo e incubar por mais de dois minutos.Sintetize o cDNA usando um kit de transcrição reversa. Adicione quatro microliters de solução deRNA viral desnaturada a um tubo PCR contendo 16 microliters de mistura de reação, e misture-o cuidadosamente com uma pipeta para não gerar bolhas. Depois de girar os tubos, realize a transcrição reversa com um termociclador.Para PCR quantitativo, use uma sonda de inserção de saciador visando a região 963 a 1.049 do segmento de genoma NSP3 de rotavírus. Diluir o plasmídeo padrão com água de grau PCR, e proceder a fazer a mistura mestre para PCR quantitativo. Adicione 20 microliters da mistura mestre aos poços de uma placa PCR de 96 poços.Em seguida, misture cinco microliters de amostras de cDNA ou cinco microliters do plasmídeo padrão por pipetação 10 vezes. Realizar PCR quantitativo de acordo com as condições do protocolo de texto. Finalmente, calcule o genoma rotavírus ligado à superfície celular MA104, conforme descrito no protocolo de texto.Mostrado aqui é uma curva de crescimento do rotavírus. Aplicando o método menos quadrado a um modelo Gompertz modificado, estima-se que a taxa de crescimento específica seja de 0,197, e o período de defasagem é estimado em 6,61 horas. O titulador relativo do vírus na fase estacionária do título inicial é 3.15.Dos seis clones de rotavírus testados, os valores estimados da taxa de crescimento específica variaram de 0,19 a 0,27. Esses valores estimados são confiáveis porque o coeficiente de valores de determinação no encaixe do modelo é superior a 0,98. O resultado do ensaio de ligação celular é exibido como eficiência de ligação, que é a razão de partículas virais ligadas às presentes no inóculo.Nossos virions RV ligando-se a superfícies celulares são cerca de 10.000 cópias por mililitro com uma eficiência de ligação de cerca de 1% ao usar uma placa de 24 poços para o ensaio de ligação celular. Uma vez que as células cultivadas são sensíveis a estresses físicos, tome cuidado para derramar o tampão e ágar suavemente, mas rapidamente. Essencialmente, um novo sistema para os vírus foi introduzido.Usando este sistema, podemos avaliar a capacidade real de ligação celular e taxa de crescimento específica com instrumentos. Nosso protocolo é vantajoso em medir o traço fenotípico. Ao verificar diferentes cepas recém-emergentes, você pode ajudar a avaliar suas novas vacinas para os vírus.Os vírus são designados como patógenos BSL-2, então você precisará preparar salas experimentais BSL-2 para realizar este procedimento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Imunologia e Infecção

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Ensaios para a identificação de novos antivirais contra a febre catarral ovina vírus

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ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

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Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectam Galinhas

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