Name: assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Эта работа была поддержана «санитарии значение цепи: Проектирование систем как эко-сообщество значение канализация» проект, ResearchInstitute для человечества и природы (RIHN, No.14200107 проекта).

1. Средний подготовка
<ol><li>Чтобы сделать средство культуры клеток (сыворотка содержащих средний), добавьте 4,7 г орла MEM порошка в 500 мл дистиллированной воды. Обработайте автоклавированием при температуре 120 ° C в течение 20 мин и пусть средних остыть до комнатной температуры. Добавить плода бычьим сывороточным (конечная концентрация: 10%), L-глютамин (2 мм), пенициллин, стрептомицин (1%) и бикарбонат натрия (1.125 г/Л). Хранить при 4 ° C на 1 месяц.</li>
	<li>Подготовьте сыворотки бесплатная среда для размножения вируса, как описано в шаге 1.1, но без плода бычьим сывороточным. Хранить при 4 ° C на 1 месяц.</li>
	<li>Для assay металлической пластинкы стерилизация автоклавированием 100 мл орла MEM среды (не содержащих фенол красный). Пусть средний остыть до комнатной температуры, а затем добавить 2% FBS, 2% стрептомицин, пенициллин, 4 мм L-глютамина и 2,25 г/Л NaHCO3. Хранить при 4 ° C.</li>
	<li>Для assay металлической пластинкы стерилизации 100 мл 2,5% агарозном геле в автоклаве. Подготовка геля в тот же день проводится assay металлической пластинкы. Храните гель на 47 ° C на водяной бане.</li>
</ol>2. клеточная культура
<ol><li>Удаление cryotube, содержащих MA104 клеточных линий из контейнера жидкого азота. Поместите cryotube в водяной бане при 37 ° C таять клетки. Добавьте 1 мл суспензии клеток в 20 мл сыворотки содержащих среды в колбе T75. Инкубируйте колбу в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 на 2 или 3 дней. Примечание: Около 106 клеток/мл концентрация окончательный клеток в суспензии.</li>
	<li>Как только монослой клеток достигает 80% confluency, удалить супернатант и вымыть клетки дважды с 5 мл 1 x Дульбекко в PBS (-фосфатный буфер).</li>
	<li>Добавить 4 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу и инкубировать при 37 ° C за 5 мин до отсоединения клетки из колбы. Передать суспензию клеток 15 мл трубки и центрифуги на 190 x g за 5 мин.</li>
	<li>Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулированных клетки (106 клеток) в 1 мл сыворотки содержащих средних подготовленных в 1.1. Разбавить ресуспензированы клетки в 100 раз с носителя.</li>
	<li>Добавьте 3 мл суспензии разреженных клеток в каждой скважине 6-ну (для assay металлической пластинкы) или 24-ну пластины (для assay клетки привязки), соответственно. Инкубируйте пластины в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров для 2 или 3 дней. Примечание: T75 колбу подходит для сбора образцов курс, потому что объем образца супернатант (1 мл) может быть проигнорировано по сравнению с общим объемом супернатанта (30 мл). Тем временем инфекционные титр вируса в каждом супернатант измеряется assay металлической пластинкы, которая обычно проводится с помощью 6-ну тарелку. 24-ну плита используется для assay клетки привязки.</li>
</ol>3. конкретные темпы ротавирусной инфекции
Примечание: Ротавирусная резус (RRV, генотип: G3P[3]) используется в настоящем Протоколе, потому что RRV можно быстро и легко образуют бляшки с MA104 клетками.
<ol><li>Место трубка, содержащая 1 мл суспензии вирус (107 ОРП/мл) в сыворотке бесплатно средней температуре-80 ° C в водяной бане при 37 ° C, чтобы разморозить. Добавьте 1 мкг/мкл трипсина из поджелудочной железы свиней в 1 мл вирус подвеска (окончательный трипсина концентрация составляет 4 мкг/мл), а затем вихря. Инкубируйте вирус подвеска при 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров на 30 мин. Примечание: Трипсина из других источников могут быть использованы, но эффект на ротавирус инфективности должен испытываться заранее.</li>
	<li>Разбавьте активации вируса подвеска с сыворотка свободный средних регулировать кратность инфекции (МВД) 0.1 ОРП/ячейку.</li>
	<li>Добавить 1 мл суспензии разреженных вирус MA104 клеточных линий (80% притока) в колбе T75 3 дней после ячейки покрытия (2.1), инкубации при 37 ° C для 1 h и осторожно встряхните флакон каждые 15 мин.</li>
	<li>Затем добавьте 30 мл сыворотки свободный носитель, содержащий 0,13 мкг/мл трипсина из поджелудочной железы свиней в колбу. Инкубируйте настой при 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров.</li>
	<li>Сбор 1 мл супернатант в колбу на 0, 6, 12, 18, 24 и 36 (или 48) h послеоперационные инфекции (hpi) и заменить супернатант в 1,5 мл пробирок с помощью пипетки.</li>
	<li>Проведение заморозки (-80 ° C) и расплавить на водяной бане при 37 ° C цикла три раза. Затем центрифуга трубы на 12600 x g 10 мин при 4 ° C. Соберите супернатант.</li>
	<li>Фильтр супернатант с дистиллированной 0.2 мкм фильтр, чтобы удалить часть клетки. Храните супернатанта-80 ° C в холодильнике до применения к assay металлической пластинкы для измерения титр вируса.</li>
	<li>Место труб, содержащий собранные супернатант (шаг 3.5) в водяной бане при температуре 37 ° C. Добавить 4 мкг/мл трипсина в 1 мл раствора десятикратного разреженных образца и инкубировать при 37 ° C за 30 мин.</li>
	<li>В течение 30 минут инкубации в 3.8 чтобы начать assay металлической пластинкы для измерения титр вируса, полученные от времени курс образцов (шаг 3.5), вымойте клетки MA104 дважды в 6-ну плита с 2 мл ПБС после удаления сыворотки содержащих среднего.</li>
	<li>Серийно разбавить инкубирован образцы сыворотки бесплатно среднего и прививать 1 мл разбавленной пробы в каждой скважине. Инкубировать пластину для 90 минут при 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров и осторожно встряхивайте пластину каждые 15 мин.</li>
	<li>После инкубации удалите посевным материалом с 6-ну пластины. Добавьте 4 мкг/мл трипсина в средних, подготовленный в (шаг 1.3). Мягко, но сразу же добавьте 3 мл среды, смешанного с геля агарозы (соотношение составляет 1:1) в каждую лунку.</li>
	<li>Держите пластины при комнатной температуре для более чем 10 мин (до тех пор, пока гель агарозы становится твердой) и проинкубируйте 2 дней при 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров. Примечание: Залейте средство, смешанного с агар от края колодца.</li>
	<li>Добавьте 1 mL 0,015% нейтральные красный раствор разбавляют с ПБС в каждой скважине и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров. Удаление краски через 3 ч и инкубировать 1 день при 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров.</li>
	<li>На следующий день, подсчитать количество бляшек в каждой скважине и рассчитать ОРП/мл. Тщательно проверьте слияния клеток перед assay металлической пластинкы заверить налета чисел.</li>
</ol>4. клетки привязки Assay
Примечание: Этот протокол основан на докладе Gilling13.
<ol><li>Добавьте 1 мкг/мкл трипсина из поджелудочной железы свиней в 1 мл вирус подвеска (окончательный трипсина концентрация составляет 4 мкг/мл), а затем вихря (таким же образом как и 2.1). Разбавьте вирус подвеска с сыворотки свободный среднего для регулировки MOI 1 ОРП/клетка.</li>
	<li>Затем, вымыть клетки MA104 дважды на 24-ну пластины с 1 мл трис амортизированное saline (TBS; 2,53 г/Л Tris база, 6.54 г/Л NaCl, 0,3 г/Л хлористого калия, 0,046 г/л Na2HPO4 до 1 Л дистиллированной водой).</li>
	<li>Прививок 100 мкл разбавленного вирус подвески для каждой скважины 24-ну плиты с клеток и Инкубируйте на 4 ° C 90 мин, с нежным пожимая каждые 15 мин.</li>
	<li>Удалите вирус посевным материалом и вымыть клетки дважды с 1 мл раствора TBS. Чтобы извлечь двуцепочечные РНК (ds) ротавируса, добавить 140 мкл 1 x PBS и 560 мкл буфера извлечения РНК (см. Таблицу материалы) для каждой скважины. Mix адекватно с пипеткой (около 10 x, или до тех пор, пока туман или загрязнения ячеек в буфере не видел).</li>
	<li>После восстановления двойной мель РНК (dsRNA) по данным производителя протокол, место 1,5 мл пробирки, содержащие экстракт двуцепочечной ДНК на блоке тепла при 95 ° C за 5 мин до денатурировать двуцепочечной ДНК, а затем сразу же место трубы на льду и инкубировать для более чем 2 мин.</li>
	<li>Синтез cDNA с помощью обратной транскрипции Кит (см. Таблицу материалы). 4 мкл раствора денатурированного вирусной РНК для ПЦР-пробирки, содержащие 16 мкл смеси (Таблица 1) и тщательно перемешать его с пипетку, чтобы не создавать пузыри. Спин вниз трубы.</li>
	<li>Выполнение обратной транскрипции с тепловой циклователь на условиях, показано в таблице 2. Если cDNA сразу не используется, храните ПЦР-пробирки, содержащие cDNA в-20 ° C до 1 год.</li>
	<li>Использовать для количественного PCR праймеры (вперед 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', обратный; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 и щуп, вставив утоления (ПЦР зонды; 5'- / FAM/ATGAGCACA/утоления/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/ТАМРА-3'), ориентации 963-1049 региона NSP3 генома сегмента Ротавирусная (Ст3 штамм, GenBank: X81436). Примечание: Утоления вставляется в зонд, разработанный Цзэн et al.14
</li>
	<li>Разбавленных стандартных плазмида серийно (101 до 106 копий/мл) с ПЦР класс воду в смесь ПЦР (Таблица 3) и сделать главный микс (20 мкл/образец) для ПЦР после таблицы 4.</li>
	<li>20 мкл мастер смеси хорошо 96-луночных ПЦР плиты, а затем смешать 5 мкл cDNA образцов или 5 мкл стандартных плазмида, закупорить 10 раз. Начало реакции ПЦР системы в соответствии с условиями, указанными в таблице 4.</li>
	<li>Чтобы вычислить ротавирусной генома, привязан к поверхности клеток MA104, проводить линейной регрессии между значениями Ct и известный геном количество стандартных плазмида и оценить количество образцов генома. Затем Рассчитайте коэффициент вириона чисел привязки к клеткам (Gt) для тех, кто в первоначальном посевным материалом (0G).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rna+Virus+Mutations.">Rna Virus Mutations.</a> Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).</li><li>Gouvea, V., Brantly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+rotavirus+a+population+of+reassortants?.">Is rotavirus a population of reassortants?.</a> Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).</li><li>Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-chlorine+disinfection+as+a+selection+pressure+on+norovirus.">Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).</li><li>Ghosh, S., Kobayashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genomic+analysis+of+rotavirus+strains:+current+status+and+future+prospects.">Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects.</a> Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).</li><li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2008+estimate+of+worldwide+rotavirus-associated+mortality+in+children+younger+than+5+years+before+the+introduction+of+universal+rotavirus+vaccination+programmes:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).</li><li>Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+and+correlates+of+protection+for+rotavirus+vaccines.">Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines.</a> Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).</li><li>Santos, N., Hoshino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+distribution+of+rotavirus+serotypes/+genotypes+and+its+implication+for+the+development+and+implementation+of+an+effective+rotavirus+vaccine.">Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine.</a> Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).</li><li>Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylodynamic+analyses+of+rotavirus+genotypes+G9+and+G12+underscore+their+potential+for+swift+global+spread.">Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread.</a> Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).</li><li>Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+molecular+epidemiology+of+rotavirus+infection+after+introduction+of+monovalent+rotavirus+vaccination+in+Scotland.">Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland.</a> Vaccine. 35, 156-163 (2017).</li><li>Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+rotaviruses+in+continuous+human+and+monkey+cell+lines+that+vary+in+their+expression+of+integrins.">Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins.</a> Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).</li><li>Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+a2b1+and+a4b1+can+mediate+SA11+rotavirus+attachment+and+entry+into+cells.">Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells.</a> Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).</li><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).</li><li>Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+antiviral+action+of+plant+antimicrobials+against+murine+norovirus.">Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).</li><li>Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+quantitative+RT-PCR+for+the+detection+of+rotavirus+in+acute+gastroenteritis.">One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis.</a> Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).</li><li>Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+evaluation+of+rotavirus-cell+interactions:+identification+of+an+enterocyte+ganglioside+fraction+that+mediates+group+A+porcine+rotavirus+recognition.">Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition.</a> Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).</li><li>Br&#252;ssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+milk+immunoglobulins+for+passive+immunity+to+infantile+rotavirus+gastroenteritis.">Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).</li><li>Outzen, H., Berglund, G. I., Smal&#229;s, A. O., Willassen, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+and+pH+sensitivity+of+trypsins+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+in+comparison+with+bovine+and+porcine+trypsin.">Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).</li><li>Saxena, K., Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).</li><li>Yin, Y., Bijvelds, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+rotavirus+infection+and+antiviral+therapy+using+primary+intestinal+organoids.">Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids.</a> Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Наш протокол для измерения темпов роста конкретных легче, чем предыдущие и могут быть адаптированы для других вирусов, если их системы культуры клеток еще не создана. В этом исследовании, мы использовали RRV (G3P[3]) потому, что этот штамм может сформировать металлические пластинкы легче, чем Ротавирусы человека при использовании MA104 клеточных линий. Некоторые штаммы человека ротавирусной не образуют бляшки в этой линии клетки. Таким образом вместо assay металлической пластинкы, фокус, образуя единицы (ФФУ) пробирного15 или медиана культуры ткани инфекционным дозы (TCID50) assay может применяться для многих ротавирусной штаммов16. Представленные протокол для определения конкретных прирост может использоваться для других типов вируса, но не подходит для вирусов, для которых создана система культуры не установленным клеток. Перед началом эксперимента для определенного роста, лучше заранее знать, когда вирус инфекционной титр начинает увеличить и достигает стационарной фазы в предварительном тесте. Если слишком много металлических пластинк присутствуют, assay металлической пластинкы должно проводиться снова после изменения расхода разрежающего образцов вируса. Часов после инфекции (hpi) для сбора проб также важны, потому что наклон фазы экспоненциального роста может быть недооценена, если пропустили точку надлежащего времени для достижения неподвижной фазой. В приближении, модифицированная модель Гомпертца коэффициент детерминации следует всегда рассчитывается и проверены. Если Фитнес для измененной модели Гомпертца является низкой, другие модели роста, такие как изменение логистической модели12 может быть предпочтительным.
В обработке клеток, при удалении вирусов или средний посевным материалом, PBS для стирки или агарозы гель для assay металлической пластинкы должны оперативно добавлены к каждому хорошо из плиты культуры клеток для предотвращения клетки от сухости. В то же время необходимо осторожно налить PBS или агарозы для ячейки не отсоединить от скважин. Этот шаг является самым важным в обоих анализов (шаг 3.9 и 3.11). Если assay металлической пластинкы имеет слишком много образцов, мы рекомендуем разделение геля агарозы (100 мл, рекомендуется каждый максимум) в несколько средних бутылки и согреться бутылки до тех пор, пока перед использованием с агарозы гель затвердевает в течение около 10 мин на номер Температура. Так как трипсина уязвим для высоких температур17, раствором трипсина следует добавить средне и агарозы для assay металлической пластинкы после надлежащего охлаждения.
В assay клетки привязки инкубаторов для привязки вирусом клетки должно быть сделано на 4 ° C для предотвращения вторжения клеток. По словам Gilling метод13клетки подвержены сушка при низких температурах, так нежно тряска необходимо каждые 15 минут во время инкубации. В РНК добыча комплект использованы здесь может быть заменен на другие наборы. Наклон стандартной кривой в RT-ПЦР должно быть примерно 3.3, и коэффициент определения должно быть больше чем 0,98. По сравнению с флуоресцентным микроскопом визуализировать локализации вирусов в клетки, assay является более быстрым и проще в использовании, потому что привязка флуоресцирующих веществ для вирусов не является необходимым.
Недавно человеческой кишечника enteroid (ГИЭ), аналогичные клеточный состав и функции как человека желудочно-кишечного эпителия, стала доступна для распространения ротавируса18. Использование HIE может позволить нам оценить конкретные темпы и способность клеток привязки не culturable штаммов ротавирусной инфекции. Кроме того оба эксперименты, описанные здесь может применяться для оценки воздействия препарата на обоих фенотипов19. Здесь представлены протоколы позволяют количественно обсудить изменения в значения параметров фенотип ротавирусной штаммов в разнообразных условиях.

РНК-вирусов формируют генетически различных слоев населения, известный как quasispecies1, потому что их ставка мутации,2 , которая выше, чем у организмов, на основе ДНК. Структура населения в quasispecies зависит от генетических факторов народонаселения, включая мутации, давление отбора и генетического дрейфа. Штаммов в пределах одной генетической линии может показать разные фенотипы вследствие генетического разнообразия. Например Rachmadi et al. показали, что чувствительность свободного хлора разных мышиных норовирус штаммов, которые возникли от налета Очищенный сорт S7-PP33.
Ротавирусы (род ротавирусной инфекции в семье Реовирусы) являются не охватило ds РНК вирусов, образуя quasispecies2. Помимо населения генетические факторы, описанные выше геном реаасортации влияет генетического разнообразия ротавирусной, потому что этот вирус имеет 11 сегментированный геном4. Ротавирусы причиной диареи главным образом среди детей, и детская смертность в 2013 году были оценены около 250 0005. Две вакцины используются в ряде стран и была эффективной в снижении бремени ротавирусной инфекции, но некоторые исследователи сейчас обсуждаем присутствие вакцины побег мутантов,6,7,,8, 9. характеристика этих мутантов имеет важное значение для понимания механизмов вакцины бежать.
Здесь мы представляем протоколы для двух анализов для оценки конкретных рост и способность клеток привязки ротавирусной инфекции для того чтобы понять фенотипические различия среди штаммов/мутантов. Кривая роста Ротавирусы была представлена в предыдущих докладах10, но обычно не измеряются параметры роста таких конкретных прирост. Клетки привязки пробирного проведенных ранее включает immunofluorescent окрашивание техника11. Мы показываем здесь проще методы использования assay металлической пластинкы и RT-ПЦР, которые позволяют количественно обсуждать разницу в вирусные фенотипы. Эти методы подходят для характеристики ротавирусной фенотипы и наконец может способствовать строительству новых вакцин эффективны для нескольких генотипов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7500 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-EPI</td>
			<td>Nakalai Tesque, Inc</td>
			<td>01101-34</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>194-02875</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05900</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05901</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward / Reverse primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>140-00932</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-) &#34;Nissui&#34;</td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05913</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liguid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR039A</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR037A</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52904</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>199-05985</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>198-01675</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 6-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancrease</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0303-1G</td>
			<td>Activate for rotavirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus

Ротавирусной является основным этиологическим фактором для инфантильных понос. Это (ds) двуцепочечной РНК вируса и формирует генетически различных слоев населения, известный как quasispecies, ввиду их высокой мутации ставки. Здесь мы опишем, как измерить конкретные темпы и способность клеток привязки ротавирусной его фенотипов. Ротавирусная трактуется с трипсином признать клеточный рецептор и затем прививку в культуре клеток MA104. Супернатант, включая вирусный потомков, собирается с перерывами. Assay металлической пластинкы используется для подтверждения титр вируса (металлическ формируя единица: ОРП) из каждого собранного супернатант. Конкретные прирост оценивается путем установки времени курс данные ОРП/мл для измененной модели Гомпертца. В assay клетки привязки MA104 клетки в пластине 24-ну инфицированных ротавирусной и инкубированы для 90 мин при 4 ° C для адсорбции ротавирусной клеточными рецепторами. Низкая температура сдерживает ротавирусной инфекции от вторжения клетки-хозяина. После мытья удаление несвязанных вирионы, РНК добывается из вирионы придает рецепторы клеток, следуют синтеза cDNA и реверс транскрипция количественного PCR (RT-ПЦР). Эти протоколы могут применяться для расследования фенотипические различия между вирусных штаммов.

Обзор двух протоколов для конкретных темпов и клеток привязки assay налета-очищенная RRV штаммов показан на рисунке 1A и 2A, соответственно.
В assay для определенного роста окончательный вирус титр достигает более 107 ОРП/мл при распространении на колбу T75. Если максимальная концентрация меньше чем 107 ОРП/мл, MA104 клетки не могут стать вырожденная или RRV не был активирован, трипсина. Для оценки конкретных прирост с использованием инфекционных блок данных доступны некоторые модели роста. В этом протоколе модифицированных Гомпертца модель12 используется в качестве примера; <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
где N0 (104 ОРП/мл в этом исследовании) и Nt (104 -108 ОРП/мл) являются инфекционные титр вируса (ОРП/мл) на 0 и т (пример: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, соответственно, является асимптотического значения [журнала (N∞/n0 )] (пример: 3-4), мкг-это конкретные темпы [1/ч], e — константа Napier и λ является период задержки [h]. Параметры модели получаются путем расчета функции анализа программного обеспечения, которое уменьшает сумму квадратов разницы между значениями наблюдаемые и смоделированные. В примере на рисунке 1Bконкретные прирост (µ) оценивается в 0.197 [1/ч] и период задержки (λ)-6,61 [h], применяя метод наименее квадратных модифицированная модель Гомпертца и относительной вирус титр в стационарной фазы (начальный титр Вход шкала) (A) — 3,15 [журнала (N∞/n0)]. Мы протестировали 6 клонов ротавирусной инфекции в общей сложности, и расчетные значения конкретных прирост составлял от 0,19 до 0,27 [1/мин]. Эти расчетные значения являются надежными, потому что коэффициент определения значений в модели фурнитуры более чем 0,98.
RRV вирионы привязки к поверхности клетки были около 103 копий/мл (привязка эффективность составила около 1%) при использовании 24-ну пластины для assay клетки привязки (рис. 2B). Assay обычно проводится три раза для каждого образца, и если в образец наблюдается большая вариативность в номер копии, могут возникнуть некоторые проблемы как чрезмерно мойки и недостаточно активация RRV трипсином. Значение Ct ПЦР, превышающей около 36,0 не является предпочтительным и считается ниже предела обнаружения в наших условиях ПЦР.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Объем / 1 реакции</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 х PrimeScript буфера</td>
			<td>4.0 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript RT фермент смесь я</td>
			<td>1.0 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Праймера Oligo dT</td>
			<td>1.0 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Случайные 6 РВК</td>
			<td>4.0 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Деионизированная вода дистиллированная</td>
			<td>6.0 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>ssRNA образец</td>
			<td>4.0 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Итого</td>
			<td>20,0 МКЛ</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Мастер перемешать композиции для синтеза cDNA ротавирусной генома.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Температуры [° C]</td>
			<td>Время</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 мин</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 мин</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Реакция условие для синтеза cDNA ротавирусной генома.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Объем/1 реакция</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq премикс</td>
			<td>12.5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Грунтовка вперед (10 мкм)</td>
			<td>0.5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Обратный грунт (10 мкм)</td>
			<td>0.5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Зонд (10 мкм)</td>
			<td>0.5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ссылка краситель II</td>
			<td>0.5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Деионизированная вода дистиллированная</td>
			<td>5.5 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Образец cDNA</td>
			<td>5.0 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Итого</td>
			<td>25 МКЛ</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 3: Мастер перемешать состав для количественного PCR ротавирусной генома.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Температуры [° C]</td>
			<td>Время</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 мин</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">45 цикла</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 мин</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 мин</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 4: Реакция условие для количественного PCR ротавирусной генома.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> Рисунок 1: схема обзор оценки роста ротавирусная и кривая роста ротавирусной. (A) инфекционные единица ротавирусной измеряется с assay металлической пластинкы. (B) кривой (синяя линия) была аппроксимирована модифицированных Гомпертца модели, основанной на данных наблюдений в нашей лаборатории (белый круг). Темпы роста конкретных [µ]; 0.197 [h-1], отстают в период (λ); 6.61 [h], относительная вирус титр на стационарном этапе начальный титр (логарифмическая шкала) 3.15 [журнала (N∞/n0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> Рисунок 2: Схематичный обзор и представитель результат assay клетки привязки пяти RRV штаммов, очищенного от бляшек в нашей лаборатории. (A) A клетки культуры пластины прививанным с ротавирусом инкубировали при 4 ° C для ингибирования нашествия вирусов в клетки. После инкубации и удаление несвязанных вирусных частиц клеток подсчитать количество геномов, происходящих из связанных вирусных частиц на поверхности клеток с RT-ПЦР. (B) в результате клетки привязки пробирного был отображается как binding КПД (%), который был соотношение связанных вирусных частиц для тех, кто присутствует в посевным материалом. Смелые бар: средний, конца коробки: отклонение квартиль, конец строки: максимальная и минимальная. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Здесь мы представляем два протокола, один для измерения определенных темпов и другой для способности клеток привязки ротавирусной инфекции, используя assay металлической пластинкы и RT-ПЦР. Эти протоколы доступны для подтверждения различий в фенотипов ротавирусной штаммов.

Анализы для конкретных рост и способность клеток привязки ротавирусной инфекции

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Используя представленные здесь анализы, можно оценить разницу в фенотипе среди штаммов ротавируса, где единичные штаммы изолированы. В частности, исследована фенотипическая смена дезинфицирующих штаммов ротавируса. Для достижения четких количественных результатов с помощью анализа бляшек крайне важно выбрать соответствующую комбинацию штамма ротавируса и сыворотки, в которой ротавирус хорошо приспособлен к сыворотке.Демонстрацией процедуры будет Сюн-суке Кадойя, докторант моей лаборатории. Удалите CryoTube, содержащий линии клеток MA104, из контейнера с жидким азотом. Поместите CryoTube в водяной бане при 37 градусах по Цельсию, чтобы разморозить клетки.Добавьте один миллилитр клеточной суспензии в 20 миллилитров сывороткосодержащей среды в колбе T75. Инкубировать колбу в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию и 5%CO2 в течение двух-трех дней. После того, как монослой клетки достигает 80% слияния, удалить супернатант и мыть клетки дважды с пятью миллилитров 1X Dulbecco в PBS.Добавьте четыре миллилитров 0,05%трипсина-ЭДТА в колбу и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут, чтобы отделить клетки от колбы. Перенесите подвеску клетки в 15 миллилитровую трубку и центрифугу при 190 г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулированное клеток в один миллилитр сыворотки, содержащей среду.Затем разбавить повторно сложенные клетки 100 раз со средой. Добавьте три миллилитров разбавленной клеточной суспензии к каждому хорошо из шести-хорошо пластины для налета анализа. Добавьте один миллилитр разбавленной клеточной суспензии к каждому колодец 24-хорошо пластины для клеточного связывания анализа.Инкубировать пластины в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5%CO2 недостаточнонасыщенном паре в течение двух-трех дней. Перенесите трубку, содержащую один миллилитр вирусной суспензии в безотхивной среде, из хранилища при температуре минус 80 градусов по Цельсию в водяную баню при температуре 37 градусов по Цельсию для оттаивания. Добавьте один микрограмм на микролитр трипсина из свиной поджелудочной железы в один миллилитр вирусной суспензии, а затем вихрь.Инкубация вирусной суспензии при 37 градусах Цельсия и 5%CO2 недостаточнонасыщенном паре в течение 30 минут. Разбавить активированную вирусную суспензию без сыворотки среды для регулировки множественности инфекции, или МВД, до 0,1 пфу на клетку. Добавьте один миллилитр разбавленной вирусной суспензии в клетки MA104 в колбе T75 через три дня после покрытия клеток.Инкубировать клетки с вирусом при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа, мягко встряхивая колбу каждые 15 минут. Затем добавьте 30 миллилитров среды без сыворотки, содержащей четыре микрограмма на миллилитр трипсина из свиной поджелудочной железы в колбу. Инкубировать колбу при 37 градусах цельсия и 5%CO2 недостаточнонасыщенном паре.Соберите один миллилитр супернатанта в колбе при нуле, шесть, 12, 18, 24 и 36 часов после инфекции, и замените супернатант в 1,5 миллилитров типах с помощью пипетки. Провести цикл замораживания-оттепели в течение 15 минут при температуре минус 80 градусов по Цельсию с последующим 15-минутным таянием на водяной бане при температуре 37 градусов по Цельсию. Затем центрифуга труб при 12 600 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.Соберите супернатанта. Фильтр supernatant с дистиллированной 0,2 микрон фильтр для удаления фракции клеток. Храните супернатант при температуре минус 80 градусов по Цельсию до нанесения его на налет для измерения вируса titer.Когда готовы выполнить налет анализа, поместите трубки, содержащие собранные supernatant в водяной бане при 37 градусов по Цельсию. Добавьте трипсин в один миллилитр 10-кратного разбавленного образца и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Во время этой 30-минутной инкубации тщательно промыть клетки MA104 в шести-хорошо пластины с двумя миллилитров 1X PBS после удаления сыворотки, содержащей среды.Серийно разбавляют инкубированные образцы средой без сыворотки и прививают по миллилитр разбавленного образца в каждую колодец. Инкубировать пластину в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия и 5%CO2 недостаточнонасыщенном паре, нежно встряхивая пластину каждые 15 минут. После инкубации снимите инокулум с шести-хорошо пластины.Добавьте четыре микрограмма на миллилитр трипсина в подготовленную среду. Аккуратно, но сразу же добавить три миллилитров среды смешивается с агарозным гелем для каждого хорошо. Разрешить агарозный гель затвердеть при комнатной температуре в течение более 10 минут.Затем инкубировать пластину в течение двух дней при 37 градусах по Цельсию и 5%CO2 недостаточнонасыщенных паров. Затем добавьте один миллилитр 0.015%Нейтральный красный раствор, разбавленный 1X PBS к каждой хорошо, и инкубировать с теми же условиями. Удалить краситель через три часа и продолжать инкубировать в течение одного дня.На следующий день подсчитайте количество бляшек в каждой пластинке и рассчитайте пфу на миллилитр. Тщательно проверьте слияние клеток до анализа бляшки, чтобы убедиться в количестве бляшек. Для клеточного анализа добавьте один микрограмм на микролитр трипсина из свиной поджелудочной железы в один миллилитр вирусной суспензии, а затем вихрь.Разбавить вирусную суспензию средой без сыворотки, чтобы настроить МВД до одного пфу на клетку. Вымойте клетки MA104 дважды в 24-хорошо пластины с одним миллилитр трис-буфера солевого раствора. Теперь привить клетки 100 микролитров разбавленной вирусной суспензии в каждый колодец 24-хорошо пластины.Инкубировать пластину при четырех градусах по Цельсию в течение 90 минут с нежной тряской каждые 15 минут. Удалить вирус inoculum, и мыть клетки в два раза с одним миллилитр трис-буфера солевого раствора. Для извлечения двухструйной РНК ротавируса добавьте в каждую колодец 140 микролитров 1X PBS и 560 микролитров буфера извлечения РНК.Смешайте адекватно с пипеткой, пока дымка клеток в буфере не видел. После восстановления двухместной РНК, в соответствии с протоколом производителя, поместите 1,5 миллилитровые трубки, содержащие двухструйный экстракт РНК, на тепловом блоке при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут, чтобы денатуратура РНК. Затем сразу же поместите трубки на лед и инкубировать в течение более двух минут.Синтезировать cDNA с помощью комплекта обратной транскрипции. Добавьте четыре микролитров денатурированного вирусного РНК-раствора в трубку ПЦР, содержащую 16 микролитров реакционной смеси, и тщательно смешайте ее с пипеткой, чтобы не генерировать пузырьки. После вращения вниз по трубам, выполнить обратную транскрипцию с термоциклером.Для количественного ПЦР используйте зонд, вставленный в утоление, ориентированный на область 963 к 1049 сегмента ротавируса генома NSP3. Серийно разбавить стандартную плазмиду с ПЦР-класса воды, и приступить к сделать мастер смесь для количественных ПЦР. Добавьте 20 микролитров мастер-микса к колодцам 96-колодец ПЦР пластины.Затем смешайте пять микролитров образцов кДНК или пять микролитров стандартной плазмиды, трубя 10 раз. Выполняем количественный ПЦР в соответствии с условиями текстового протокола. Наконец, вычислите геном ротавируса, связанный с поверхностью клетки MA104, как описано в текстовом протоколе.Здесь показана кривая роста ротавируса. Применяя наименее квадратный метод к модифицированной модели Гомперца, конкретные темпы роста оцениваются в 0,197, а период отставания оценивается в 6,61 часа. Относительный вирус titer на стационарной фазе к первоначально titer 3.15.Из шести проверенных клонов ротавируса оценочные значения конкретных темпов роста варьировались от 0,19 до 0,27. Эти оценочные значения являются надежными, поскольку коэффициент значений определения в примерке модели составляет более 0,98. Результатом клеточно-связывающего анализа отображается как связывающая эффективность, которая представляет если соотношение связанных вирусных частиц и частиц, присутствующих в инокуле.Наша привязка RV virions к поверхностям клеток составляет около 10 000 копий на миллилитр с связывающей эффективностью около 1%при использовании пластины из 24 колодец для анализа связывания клеток. Так как культивируемые клетки чувствительны к физическим нагрузкам, позаботьтесь, чтобы залить буфер и агар мягко, но быстро. По существу, была введена новая система для вирусов.Используя эту систему, мы можем оценить реальную способность связывания клеток и конкретные темпы роста с помощью инструментов. Наш протокол выгоден в измерении фенотипической черты. Проверяя различные новые штаммы, вы можете помочь оценить его новые вакцины для вирусов.Вирусы обозначены как патогены BSL-2, поэтому вам нужно будет подготовить экспериментальные помещения BSL-2 для выполнения этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Количественный анализ всех гриппа типа Вирусный Hemagglutinins и нейраминидазы использованием универсального антител в простом Анализы Blot Слот

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Анализы для идентификации новых видов Antivirals против вируса катаральной лихорадки овец

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: Высокая пропускная Количественная оценка колонии роста и время запаздывания

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-опосредованной изотермический амплификации (ЛАМП) Анализы на конкретные виды обнаружения<em&gt; Eimeria</em&gt;, Которые заражают цыплят

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Парные Рост конкуренции Анализ для определения репликации Фитнес человека вируса иммунодефицита

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Раннее проникновение вируса Анализы для идентификации и оценки антивирусных соединений

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Качественный и количественный анализы для обнаружения и определения характеристик белка Противомикробные

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Быстрая и конкретная оценка галогенирующего пероксидазной активности в лейкоцитами обогащается проб крови

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Анализы для изучения роли Vitronectin в бактериальной адгезии и сопротивление сыворотки

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...