Name: assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00
Duration: 10 min 49 s
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Este trabajo fue financiado por el proyecto "El valor cadena: diseño saneamiento sistemas como Eco-comunidad valor sistema de saneamiento", ResearchInstitute para la humanidad y la naturaleza (RIHN, proyecto No.14200107).

1. medio preparación
<ol><li>Para hacer un medio de cultivo celular (medio que contiene el suero), añadir 4,7 g de MEM polvo Eagle en 500 mL de agua destilada. Autoclave a 120 ° C por 20 min y dejar que el medio se enfríe a temperatura ambiente. Añadir suero bovino fetal (concentración final: 10%), L-glutamina (2 mM), penicilina estreptomicina (1%) y bicarbonato de sodio (1,125 g/L). Almacenar a 4 ° C durante 1 mes.</li>
	<li>Preparar el medio libre de suero para la propagación de virus como se describe en el paso 1.1, pero sin el suero bovino fetal. Almacenar a 4 ° C durante 1 mes.</li>
	<li>Para el ensayo de placa, esterilice en autoclave los 100 mL de medio MEM del águila (no contiene rojo de fenol). Que el medio fresco a temperatura ambiente y luego agregar 2% SFB, 2% penicilina estreptomicina, 4 mM L-glutamina y 2,25 g/L de NaHCO3. Almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Para el ensayo de placa, esterilizar 100 mL de gel de agarosa al 2,5% por autoclave. Preparar el gel el mismo día que se lleva a cabo el ensayo de placa. Guarde el gel a 47 ° C en un baño de agua.</li>
</ol>2. cultivo celular
<ol><li>Quitar un criotubo que contiene líneas de células MA104 del contenedor de nitrógeno líquido. Coloque el criotubo en un baño de agua a 37 ° C para las células. Añadir 1 mL de la suspensión de células a 20 mL del medio que contiene el suero en un matraz T75. Incube el frasco en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2 para 2 o 3 días. Nota: La concentración final de células en la suspensión es alrededor de 106 células/mL.</li>
	<li>Una vez que la monocapa celular alcanza el 80% de confluencia, quite el sobrenadante y se lavan las células dos veces con 5 mL de 1 x PBS de Dulbecco (tamponada fosfato salino).</li>
	<li>Añadir 4 mL de tripsina 0,05%-EDTA al matraz e incubar a 37 ° C durante 5 min separar las células del frasco. Transferir la suspensión de células a un tubo de 15 mL y centrifugar a 190 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Desechar el sobrenadante y resuspender el peletizado células (106 ) en 1 mL de 1.1 preparados en medio que contiene el suero. Diluir las células resuspendidas en 100-fold con el medio.</li>
	<li>Añadir 3 mL de la suspensión diluida de células a cada pozo de 6 pozos (para el ensayo de placa) o placas de 24 pozos (para el ensayo de unión a la célula), respectivamente. Incubar las placas en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 en el vapor saturado durante 2 o 3 días. Nota: Un matraz T75 es adecuado para recoger las muestras del curso del tiempo, porque el volumen de muestra del sobrenadante (1 mL) puede ser ignorado en comparación con el volumen de sobrenadante total (30 mL). Mientras tanto, el título infeccioso del virus en cada sobrenadante se mide por el ensayo de placa, que generalmente se realiza mediante una placa de 6 pozos. Una placa de 24 pozos se utiliza para el ensayo de unión a la célula.</li>
</ol>3. tasa de crecimiento específico de Rotavirus
Nota: Rotavirus de rhesus (RRV, genotipo: G3P[3]) se utiliza en este protocolo porque RRV puede rápidamente y fácilmente forman placas con células MA104.
<ol><li>Coloque un tubo que contenga 1 mL de la suspensión de virus (107 pfu/mL) en un medio libre de suero almacenada a-80 ° C en un baño de agua a 37 ° C para descongelar. Añadir 1 μg/μl tripsina del páncreas porcino 1 ml de la suspensión de virus (concentración de tripsina final es 4 μg/mL) y luego el vórtice. Incubar la suspensión de virus a 37 ° C y 5% de CO2 en el vapor saturado durante 30 minutos. Nota: Tripsina de otras fuentes puede ser utilizado, pero el efecto sobre la infectividad del rotavirus debe probarse de antemano.</li>
	<li>Diluir la suspensión de virus activado con un medio libre de suero para ajustar la multiplicidad de infección (MOI) a 0.1 UFP/célula.</li>
	<li>Añadir 1 mL de la suspensión de virus diluido a líneas de células MA104 (80% confluente) en un matraz T75 3 días después de la celda (2,1) de la galjanoplastia, incubar a 37 ° C durante 1 h y agite suavemente el frasco cada 15 minutos.</li>
	<li>Luego, Añadir 30 mL de un medio libre de suero que contiene 0,13 μg/mL de tripsina de un páncreas porcino al matraz. Incube el frasco a 37 ° C y 5% de CO2 en el vapor saturado.</li>
	<li>Recoger 1 mL del sobrenadante en el matraz a 0, 6, 12, 18, 24 y 36 (o 48) h post-infección (hpi) y vuelva a colocar el sobrenadante en los tubos de 1,5 mL con una pipeta.</li>
	<li>Llevar a cabo la congelación (-80 ° C) y fundir en un baño de agua a 37 ° C ciclo tres veces. Luego centrifugar los tubos a 12.600 x g por 10 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante.</li>
	<li>Filtrar el sobrenadante con un filtro de 0.2 μm destilada para remover la fracción de la célula. Guarde el sobrenadante-80 ° C en el refrigerador hasta aplicar el ensayo de placa para medir la concentración de virus.</li>
	<li>Colocar los tubos que contienen el sobrenadante recogido (paso 3.5) en baño de agua a 37 ° C. Añadir 4 tripsina μg/mL a 1 mL de muestra diluida 10 veces e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
	<li>Durante la incubación de 30 min en 3.8, para comenzar el ensayo de placa para medir la concentración de virus obtenida de muestras del curso de tiempo (paso 3.5), se lavan las células MA104 dos veces en una placa de 6 pozos con 2 mL de 1 x PBS después de retirar el medio que contiene el suero.</li>
	<li>En serie Diluya las muestras incubadas con un medio libre de suero e inocular 1 mL de la muestra diluida en cada pocillo. Incube la placa durante 90 minutos a 37 ° C y 5% CO2 en el vapor saturado y agitar suavemente la placa cada 15 minutos.</li>
	<li>Después de la incubación, retirar el inóculo de la placa de 6 pozos. Añadir 4 tripsina μg/mL al medio preparado (paso 1.3). Suavemente pero inmediatamente Agregue 3 mL del medio mezclado con gel de agarosa (la proporción es 1:1) a cada pocillo.</li>
	<li>Mantener la placa a temperatura ambiente durante más de 10 minutos (hasta que el gel de agarosa se convierte en sólido) e incubar durante 2 días a 37 ° C y 5% de CO2 en el vapor saturado. Nota: Vierta el medio mezclado con agar desde el borde del pozo.</li>
	<li>Añadir 1 mL de la solución de rojo neutro de 0.015% diluida con 1 x PBS a cada pocillo e incubar a 37 ° C y 5% de CO2 en el vapor saturado. Quitar el tinte después de 3 horas e incubar durante 1 día a 37 ° C y 5% de CO2 en el vapor saturado.</li>
	<li>Al día siguiente, contar el número de placas en cada pozo y calcular la pfu/mL. Revise cuidadosamente la confluencia celular antes del ensayo de placa para asegurar al número de placa.</li>
</ol>4. Unión a célula de ensayo
Nota: Este protocolo se basa en informe13 de Gilling.
<ol><li>Añadir 1 μg/μl tripsina de un páncreas porcino 1 ml de la suspensión de virus (concentración de tripsina final es 4 μg/mL) y luego el vórtice (de la misma manera como en 2.1). Diluir la suspensión de virus con un medio libre de suero para ajustar el MOI de 1 UFP/célula.</li>
	<li>Luego, lavar las células MA104 dos veces en placa de 24 pozos con 1 ml de solución salina tamponada con Tris (TBS; 2,53 g/L Tris base, 6,54 g/L de NaCl, KCl, de 0,3 g/L 0,046 g/l de Na2HPO4 para llegar a 1 L con agua destilada).</li>
	<li>Sembrar 100 μl de suspensión de virus diluido en cada pocillo de una placa de 24 pocillos con células e incubar a 4 ° C por 90 min, con agitación suave cada 15 minutos.</li>
	<li>Eliminar el inóculo de virus y se lavan las células dos veces con 1 mL de TBS. Para extraer el bicatenario (ds) RNA de los rotavirus, añadir 140 μl de 1 x PBS y 560 μl del buffer de extracción de RNA (véase Tabla de materiales) a cada pocillo. Mezcle adecuadamente con una pipeta (sobre x 10 o hasta que la bruma o contaminante de las células en el buffer no se ve).</li>
	<li>Después de recuperar el RNA trenzado doble (dsRNA) según protocolo del fabricante, coloque los tubos de 1.5 mL que contiene el extracto dsRNA en un bloque térmico a 95 ° C por 5 min desnaturalizar el dsRNA, inmediatamente Coloque los tubos en hielo e incube durante más de 2 min.</li>
	<li>Sintetizar el cDNA usando una transcripción reversa kit (véase Tabla de materiales). Añadir 4 μL de la solución de RNA viral desnaturalizada a un tubo PCR que contiene 16 μl de mezcla (tabla 1) y mezclar cuidadosamente con una pipeta para no generar burbujas. Desactivación de los tubos.</li>
	<li>Realizar la transcripción inversa con un termociclador bajo condición que se muestra en la tabla 2. Si el cDNA no se utiliza inmediatamente, guarde el tubo PCR que contiene el cDNA a-20 ° C hasta por 1 año.</li>
	<li>Utilizar los cebadores para la PCR cuantitativa (Forward 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', inversa; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 y una sonda de inserción de un quencher (qPCR sondas; 5'- / FAM/ATGAGCACA/extintor/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA-3'), dirigida a la 963 – 1049 región de NSP3 segmentos de genoma de rotavirus (cepa ST3, GenBank: X81436). Nota: Quencher se inserta en la punta de prueba diseñado por Zeng et al.14
</li>
	<li>Diluir el plásmido estándar en serie (101 a 106 copias/mL) con PCR grado agua a la mezcla de qPCR (tabla 3) y hacer la mezcla principal (20 μl/muestra) para qPCR siguiente tabla 4.</li>
	<li>Añadir 20 μl de la mezcla principal al pozo de una placa PCR de 96 pocillos y luego mezcle 5 μl de las muestras de cDNA o 5 μl del plásmido estándar mediante pipeteo 10 veces. Iniciar la reacción del sistema qPCR según las condiciones que se muestra en la tabla 4.</li>
	<li>Para calcular el genoma de rotavirus a la superficie de las células MA104, realizar regresión lineal entre los valores de Ct y el número de genoma conocido de un plásmido estándar y estimar el número de genoma. Luego calcular la razón de atascamiento de números de virión células (Gt) que en el inóculo inicial (G0).</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestro protocolo para la medición de la tasa de crecimiento específico es más fácil que las anteriores y puede ser adaptado para otros virus a menos que no se ha establecido su sistema del cultivo celular. En este estudio, utilizamos el RRV (G3P[3]) porque esta cepa puede formar placas más fácil que los rotavirus humanos al utilizar líneas de células MA104. Algunas cepas de rotavirus humano no pueden formar placa en esta línea celular. Por lo tanto, en lugar del ensayo de placa, el enfoque de formación de unidad (FFU) ensayo15 o mediana cultura tejido dosis infecciosa (TCID50) ensayo puede ser aplicado para muchas de las cepas de rotavirus16. El protocolo presentado para determinar la tasa de crecimiento específico puede ser utilizado para otros tipos de virus pero no es conveniente para el virus para que no se establezca ningún sistema del cultivo celular establecida. Antes de iniciar el experimento para la tasa de crecimiento específico, es mejor saber de antemano cuando el título infeccioso del virus comienza a aumentar y alcanza la fase estacionaria en una prueba preliminar. Si hay demasiadas placas, debe realizarse el ensayo de placa otra vez después de cambiar la tasa de dilución de las muestras de virus. La horas posinfección (hpi) para recoger muestras también son importantes porque la pendiente de la fase de crecimiento exponencial puede ser subestimada si se pierde el momento adecuado para llegar a la fase estacionaria. En la aproximación por el modelo de Gompertz modificado, un coeficiente de determinación siempre ser calculado y comprobado. Si la aptitud para el modelo de Gompertz modificado es baja, otros modelos de crecimiento como el modelo logístico modificado12 pueden ser preferibles.
En la manipulación de las células, al retirar el medio o el virus de inóculo, el PBS para lavado o agarose gel para ensayo de placa debe agregarse puntualmente a cada pozo de una placa de cultivo celular para evitar que las células de la sequedad. Al mismo tiempo, debe verter suavemente PBS o agarosa a células no para extraerla de los pozos. Este paso es el más importante en ambos ensayos (paso 3.9 y 3.11). Si el ensayo de placa tiene demasiadas muestras, se recomiendan subdividir el gel de agarosa (100 mL cada máximo es recomendable) en varias botellas de medio y mantener las botellas calientes hasta justo antes de uso desde agarosa gel se solidifica dentro de unos 10 minutos en la sala de temperatura. Dado que la tripsina es vulnerable a las altas temperaturas17, una solución de tripsina se debe agregar a un medio y la agarosa para el ensayo de placa después de enfriar adecuadamente.
En el ensayo de unión a la célula, la incubación por la Unión del virus a células debe realizarse a 4 º C para evitar la invasión de las células. Según método de Gilling13células son propensas a la sequedad a baja temperatura, por agitación suave es necesario cada 15 min durante la incubación. El kit de extracción de RNA utilizado aquí puede sustituirse por otros equipos. La pendiente de la curva estándar en RT-qPCR debe ser aproximadamente de 3.3 y el coeficiente de determinación debe ser más de 0.98. En comparación con el microscopio de fluorescencia para visualizar la localización del virus en las células, el ensayo es más rápida y más fácil de usar porque no hay Unión de sustancias fluorescentes a los virus.
Recientemente, enteroide intestinal humano (HIE), exhibiendo una similar composición celular y función como epitelio gastrointestinal humano, se ha convertido en disponible para la propagación de rotavirus18. El uso de HIE puede permitirnos evaluar la tasa de crecimiento específico y la capacidad de unión a células de cepas no cultivables de rotavirus. También, ambos experimentos descritos aquí podrán aplicarse a la evaluación de los efectos de la droga en ambos fenotipos19. Los protocolos presentados aquí permiten analizar cuantitativamente los cambios en los valores de parámetro de fenotipo de las cepas de rotavirus en variadas condiciones.

Virus de ARN forman una población genéticamente diversa, conocida como quasispecies1, debido a su tasa de mutación,2 que es más alto que el de los organismos basada en ADN. Estructura de la población en quasispecies es afectada por los factores genéticos de la población, incluyendo la presión de selección, la mutación y la deriva genética. Las cepas dentro de un solo linaje genético pueden mostrar diferentes fenotipos debido a la diversidad genética. Por ejemplo, Rachmadi et al demostró que cloro libre sensibilidad fue diferente entre cepas de norovirus murino que se originaron de una cepa purificada placa S7-PP33.
Rotavirus (rotavirus de género en la familia reoviridae) son virus no-envueltos ds RNA formando quasiespecies2. Además de los factores genéticos de la población descritos, reordenamiento del genoma afecta la diversidad genética de rotavirus porque este virus tiene 11 genomas segmentados4. Rotavirus causan diarrea principalmente entre los neonatos, y las muertes infantiles en el 2013 se estimaron sobre 250.0005. Dos vacunas están en uso en varios países y han sido eficaces en la reducción de la carga de la infección por rotavirus, pero algunos investigadores ahora están discutiendo la presencia de vacuna-escape mutantes6,7,8, 9. la caracterización de estos mutantes es importante comprender los mecanismos de escape de la vacuna.
Aquí, presentamos protocolos para dos ensayos para evaluar la tasa de crecimiento específico y la capacidad de unión a la célula del rotavirus para entender las diferencias fenotípicas entre cepas/mutantes. La curva de crecimiento de los rotavirus ha sido presentada en anteriores informes10, pero no se miden usualmente los parámetros de crecimiento tales como la tasa de crecimiento específico. Un ensayo de unión a la célula llevado a cabo anteriormente consiste en la tinción inmunofluorescente de técnica11. Aquí mostramos los métodos más fácil de utilizar el ensayo de placa y RT-qPCR, que permiten analizar cuantitativamente la diferencia de fenotipos virales. Estos métodos son apropiados para la caracterización de fenotipos de rotavirus y finalmente pueden contribuir a la construcción de nuevas vacunas eficaces para varios genotipos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7500 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-EPI</td>
			<td>Nakalai Tesque, Inc</td>
			<td>01101-34</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>194-02875</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05900</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05901</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward / Reverse primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>140-00932</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-) &#34;Nissui&#34;</td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05913</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liguid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR039A</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR037A</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52904</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>199-05985</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>198-01675</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 6-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancrease</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0303-1G</td>
			<td>Activate for rotavirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus

El rotavirus es el principal factor etiológico para la diarrea infantil. Es un virus de ARN de doble cadena (ds) y forma una población genéticamente diversa, conocida como quasispecies, debido a su tasa de mutación alta. Aquí, describimos cómo medir la tasa de crecimiento específico y la capacidad de unión a la célula del rotavirus como sus fenotipos. Rotavirus es tratado con tripsina para reconocer el receptor de la célula y luego se inocula en cultivo de células MA104. Intermitentemente se recoge el sobrenadante, incluyendo progenie viral. El ensayo de placa se utiliza para confirmar el título del virus (unidad formadora de placa: pfu) de cada sobrenadante recogido. La tasa de crecimiento se estima ajustando datos del tiempo-curso de pfu/mL para el modelo de Gompertz modificado. En el ensayo de unión a la célula, células MA104 en un plato 24-well son infectadas con rotavirus y se incubaron durante 90 minutos a 4 ° C para la adsorción de rotavirus a receptores celulares. Una baja temperatura refrena rotavirus de invadir la célula huésped. Después de lavar para eliminar los viriones, RNA se extrae de viriones que se une a receptores celulares, seguidos por la síntesis de cDNA y PCR cuantitativa de la reverso-transcripción (RT-qPCR). Estos protocolos pueden aplicarse para investigar las diferencias fenotípicas entre cepas virales.

Un resumen de dos protocolos para la tasa de crecimiento y ensayo de unión a la célula de placa purificada RRV variedades se muestra en la figura 1A y 2A, respectivamente.
En el análisis de la tasa de crecimiento específico, el título final de virus alcanza más de 107 pfu/mL cuando propagar en el matraz T75. Si la máxima concentración es menor que7 10 pfu/mL, las células MA104 no pueden ser confluentes o RRV no fue activada por tripsina. Algunos modelos de crecimiento están disponibles para estimar la tasa de crecimiento específico, utilizando los datos de la unidad infecciosas. En el presente Protocolo, el de modelo de Gompertz modificado12 se emplea como ejemplo; <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
donde N0 (10 a4 pfu/mL en este estudio) y Nt (104 a8 10 pfu/mL) son el título infeccioso del virus (pfu/mL) en 0 y t (ejemplo: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, respectivamente, A es el valor asintótico [log (N∞/N0 )] (ejemplo: 3 a 4), μ es la tasa de crecimiento específico [1/h], e es la constante de Napier y λ es el período de retraso [h]. Parámetros del modelo se obtienen mediante la función solver del software de análisis, que minimiza la suma de cuadrados de la diferencia entre los valores observados y modelados. En el ejemplo en la figura 1B, la tasa de crecimiento específico (μ) se estima 0.197 [1/h] y el periodo de desfase (λ) es 6.61 [h] aplicando el método menos cuadrado para un modelo de Gompertz modificado y la concentración relativa de virus en la fase estacionaria a la inicial del título ( registrar escala) (A) es 3.15 [log (N∞/n0)]. Hemos probado 6 clones de rotavirus en total, y los valores estimados de la tasa de crecimiento específico oscilan entre 0.19 y 0.27 [1/h]. Estos estimados valores son confiables debido a que el coeficiente de los valores de determinación en el ajuste del modelo es más de 0.98.
Viriones RRV vinculantes a las superficies de células fueron unos 103 copias/mL (enlace eficiencia rondaba el 1%) cuando se utiliza una placa de 24 pocillos para el ensayo de unión a la célula (figura 2B). El ensayo se realiza tres veces para cada muestra, y si se observa una gran variación en el número de copia en una muestra, pueden producirse algunos problemas tales como exceso de lavado e insuficiente activación de RRV por tripsina. El valor de Ct de qPCR superior a aproximadamente 36.0 no es preferible y se considera para estar debajo de un límite de detección en nuestra condición de qPCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volumen / 1 reacción</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x Buffer de PrimeScript</td>
			<td>4,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript RT enzima mezcla I</td>
			<td>1,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo dT cartilla</td>
			<td>1,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Random 6 mers</td>
			<td>4,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua destilada desionizada</td>
			<td>6.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>muestra de ssRNA</td>
			<td>4,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>20.0 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Master mix composición para síntesis de cDNA del genoma de rotavirus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura [° C]</td>
			<td>hora</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Condición de reacción para la síntesis del cDNA del genoma de rotavirus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volumen/1 reacción</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mezcla preparada de antemano Taq</td>
			<td>12.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer avance (10 μm)</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer revés (10 μm)</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonda (10 μm)</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinte de referencia II</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua destilada desionizada</td>
			<td>5.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>muestra de cDNA</td>
			<td>5.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>25 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Master mix composición para PCR cuantitativa de un genoma de rotavirus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura [° C]</td>
			<td>hora</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">ciclo 45</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 4: Condiciones de reacción para PCR cuantitativa de un genoma de rotavirus.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> Figura 1: esquema Resumen de la estimación de crecimiento de rotavirus y la curva de crecimiento del rotavirus. (A) la unidad de infecciosa del rotavirus se mide con el ensayo de placa. (B) la curva (línea azul) es aproximada por el modelo de Gompertz modificado, basado en datos observados en nuestro laboratorio (círculo blanco). La tasa de crecimiento específico [μ]; 0.197 [h-1], período lag (λ); 6.61 [h], la concentración relativa de virus en la fase estacionaria a la concentración inicial (escala log) (A); 3.15 [log (N∞/n0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> Figura 2: Resumen esquemático y representativo resultado el ensayo de unión a la célula de cinco cepas RRV purificados de placas en el laboratorio. (A) A placa de cultivo celular inoculada con rotavirus se incuba a 4 º C para inhibir la invasión de virus en las células. Después de la incubación y eliminando las partículas virales a las células, cuantificar el número de genomas procedentes de partículas virales enlazadas a la superficie de la célula con RT-qPCR. (B) el resultado de la Unión a célula ensayo aparecía como obligatoria la eficiencia (%), que era la proporción de partículas virales enlazadas a los presentes en el inóculo. Barra negrita: mediana, final de cajas: desviación cuartil, final de línea: máxima y mínima. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Aquí presentamos dos protocolos, uno para medir la tasa de crecimiento específico y la otra para la capacidad de unión a la célula del rotavirus utilizando el ensayo de placa y RT-qPCR. Estos protocolos están disponibles para confirmar las diferencias de fenotipos entre cepas de rotavirus.

Análisis de la tasa de crecimiento específico y la capacidad de unión a la célula del Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Utilizando los ensayos presentados aquí, se puede evaluar la diferencia en el fenotipo entre las cepas de rotavirus, donde se aíslan las cepas únicas. Específicamente, se investiga el cambio fenotípico de cepas de rotavirus resistentes al desinfectante. Para lograr salidas cuantitativas claras utilizando el ensayo de placa, es fundamental seleccionar una combinación adecuada de cepa de rotavirus y suero, en la que el rotavirus esté bien adaptado al suero.Demostrar el procedimiento será Syun-suke Kadoya, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Retire un CryoTube que contenga líneas celulares MA104 del recipiente de nitrógeno líquido. Coloque el CryoTube en un baño de agua a 37 grados centígrados para descongelar las células.Añadir un mililitro de la suspensión celular a 20 mililitros del medio que contiene suero en un matraz T75. Incubar el matraz en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante dos o tres días. Una vez que la monocapa celular alcance el 80% de confluencia, retire el sobrenadante y lave las células dos veces con cinco mililitros de PBS de 1X Dulbecco.Añadir cuatro mililitros de 0.05%trypsin-EDTA al matraz, e incubar a 37 grados Celsius durante cinco minutos para separar las células del matraz. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugar a 190 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células peletadas en un mililitro de medio que contiene suero.Luego diluir las células resuspendidas 100 veces con el medio. Agregue tres mililitros de la suspensión celular diluida a cada pozo de una placa de seis pozos para el ensayo de placa. Agregue un mililitro de la suspensión celular diluida a cada pozo de una placa de 24 pozos para el ensayo de unión celular.Incubar las placas en una incubadora a 37 grados centígrados y vapor subsaturado de 5%CO2 durante dos o tres días. Transfiera un tubo que contenga un mililitro de suspensión del virus en medio libre de suero de almacenamiento a menos 80 grados centígrados a un baño de agua de 37 grados centígrados para descongelar. Añadir un microgramo por microlitro de tripsina del páncreas porcino a un mililitro de la suspensión del virus y luego vórtice.Incubar la suspensión del virus a 37 grados centígrados y al 5%de CO2 de vapor subsaturado durante 30 minutos. Diluir la suspensión del virus activado con un medio libre de suero para ajustar la multiplicidad de infección, o MOI, a 0,1 pfu por célula. Añadir un mililitro de la suspensión del virus diluido a las células MA104 en un matraz T75 tres días después del enchapado celular.Incubar las células con virus a 37 grados centígrados durante una hora, agitando suavemente el matraz cada 15 minutos. A continuación, añada 30 mililitros de un medio libre de suero que contenga cuatro microgramos por mililitro de tripsina desde el páncreas porcino al matraz. Incubar el matraz a 37 grados centígrados y 5%co2 de vapor insaturado.Recoger un mililitro del sobrenadante en el matraz en cero, seis, 12, 18, 24 y 36 horas después de la infección, y reemplazar el sobrenadante en los tipos de 1,5 mililitros utilizando una pipeta. Llevar a cabo un ciclo de congelación y descongelación en 15 minutos a menos 80 grados Centígrados seguido de un derretimiento de 15 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Luego centrifugar los tubos a 12, 600 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Recoge el sobrenadante. Filtrar el sobrenadante con un filtro destilado de 0,2 micras para eliminar la fracción celular. Almacene el sobrenadante a menos 80 grados Centígrados hasta que lo aplique al ensayo de placa para medir el título del virus.Cuando esté listo para realizar el ensayo de placa, coloque los tubos que contienen el sobrenadante recogido en un baño de agua a 37 grados centígrados. Añadir la trippsina a un mililitro de muestra diluida de 10 veces, e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Durante esta incubación de 30 minutos, lave cuidadosamente las células MA104 en una placa de seis pocillos con dos mililitros de 1X PBS después de retirar el medio que contiene suero.Diluir en serie las muestras incubadas con medio libre de suero e inocular un mililitro de la muestra diluida en cada pozo. Incubar la placa durante 90 minutos a 37 grados Celsius y 5%CO2 de vapor subsaturado, agitando suavemente la placa cada 15 minutos. Después de la incubación, retire el inóculo de la placa de seis pocillos.Añadir cuatro microgramos por mililitro de trippsina al medio preparado. Añadir suavemente pero inmediatamente tres mililitros del medio mezclado con gel de agarosa a cada pozo. Deje que el gel de agarosa se solidifique a temperatura ambiente durante más de 10 minutos.Luego incubar la placa durante dos días a 37 grados Celsius y 5%CO2 vapor subsaturado. A continuación, añadir un mililitro de 0.015%Neutral Red solución diluida con 1X PBS a cada pozo, e incubar con las mismas condiciones. Retire el tinte después de tres horas y continúe incubando durante un día.Al día siguiente, cuente el número de placas en cada pozo y calcule el pfu por mililitro. Revise cuidadosamente la confluencia celular antes del ensayo de placa para asegurar los números de placa. Para el ensayo de unión celular, agregue un microgramo por microlitro de tripsina de un páncreas porcino a un mililitro de la suspensión del virus, y luego vórtice.Diluir la suspensión del virus con un medio libre de suero para ajustar el MOI a un pfu por célula. Lave las células MA104 dos veces en una placa de 24 pozos con un mililitro de solución salina tris-buffered. Ahora inocular las células con 100 microlitros de suspensión de virus diluido en cada pozo de la placa de 24 pozos.Incubar la placa a cuatro grados centígrados durante 90 minutos con un suave temblor cada 15 minutos. Retire el inóculo del virus y lave las células dos veces con un mililitro de solución salina con tris-buffered. Para extraer el ARN de doble cadena del rotavirus, agregue 140 microlitros de 1X PBS y 560 microlitros del tampón de extracción de ARN a cada pozo.Mezclar adecuadamente con una pipeta hasta que no se vea la neblina de las células en el búfer. Después de recuperar el ARN de doble cadena, de acuerdo con el protocolo del fabricante, coloque los tubos de 1,5 mililitros, que contienen el extracto de ARN de doble cadena, en un bloque de calor a 95 grados centígrados durante cinco minutos para desnaturalizar el ARN. A continuación, coloque inmediatamente los tubos sobre hielo e incubar durante más de dos minutos.Sintetice el ADNc utilizando un kit de transcripción inversa. Añadir cuatro microlitros de solución de ARN viral desnaturalado a un tubo de PCR que contenga 16 microlitros de mezcla de reacción, y mezclarlos cuidadosamente con una pipeta para no generar burbujas. Después de girar por los tubos, realice la transcripción inversa con un termociclador.Para la PCR cuantitativa, utilice una sonda quencher-inserting dirigida a la región 963 a 1, 049 del segmento del genoma NSP3 del rotavirus. Diluir en serie el plásmido estándar con agua de grado PCR, y proceder a hacer la mezcla maestra para PCR cuantitativo. Agregue 20 microlitros de la mezcla maestra a los pozos de una placa PCR de 96 pozos.A continuación, mezcle cinco microlitros de muestras de ADNn a o cinco microlitros del plásmido estándar pipeteando 10 veces. Realice pcR cuantitativo de acuerdo con las condiciones del protocolo de texto. Por último, calcule el genoma del rotavirus enlazado a la superficie celular MA104 como se describe en el protocolo de texto.Aquí se muestra una curva de crecimiento del rotavirus. Al aplicar el método mínimo cuadrado a un modelo Gompertz modificado, se estima que la tasa de crecimiento específica es de 0,197, y el período de retraso se estima en 6,61 horas. El título de virus relativo en la fase estacionaria hasta el título inicial es 3.15.De los seis clones de rotavirus analizados, los valores estimados de la tasa de crecimiento específica oscilaron entre 0,19 y 0,27. Estos valores estimados son fiables porque el coeficiente de valores de determinación en el empalme del modelo es superior a 0,98. El resultado del ensayo de unión celular se muestra como una eficiencia de unión, que es la relación entre las partículas virales unidas y las presentes en el inóculo.Nuestros viriones RV que se une a superficies celulares son de aproximadamente 10.000 copias por mililitro con una eficiencia de unión de alrededor del 1% cuando se utiliza una placa de 24 pozos para el ensayo de unión de celdas. Dado que las células cultivadas son sensibles al estrés físico, tenga cuidado de verter el tampón y el agar suavemente pero rápidamente. Esencialmente, se ha introducido un nuevo sistema para los virus.Usando este sistema, podemos evaluar la capacidad real de unión celular y la tasa de crecimiento específica con instrumentos. Nuestro protocolo es ventajoso en la medición del rasgo fenotípico. Al comprobar diferentes cepas recién surgientes, puede ayudar a evaluar sus nuevas vacunas para los virus.Los virus se designan como patógenos BSL-2, por lo que tendrá que preparar salas experimentales BSL-2 para realizar este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Investigación

Inmunología e Infección

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