Name: assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Detta arbete stöds av ”sanitet värde kedjan: designa sanitet system som Eco-Community värde systemet” projekt, ResearchInstitute för mänskligheten och naturen (RIHN, projektet No.14200107).

1. medium förberedelse
<ol><li>För att göra en cellodlingsmedium (serum-innehållande medium), tillsätt 4,7 g örnens MEM pulver till 500 mL destillerat vatten. Autoklav vid 120 ° C i 20 min och låt den medelstora svalna till rumstemperatur. Lägg till fostrets bovint serum (slutlig koncentration: 10%), L-glutamin (2 mM), Penicillin Streptomycin (1%) och natriumbikarbonat (1,125 g/L). Förvaras vid 4 ° C i 1 månad.</li>
	<li>Förbereda serumfritt medium för virus förökning som beskrivs i steg 1.1, men utan den fetala bovint serumen. Förvaras vid 4 ° C i 1 månad.</li>
	<li>För plack analysen, sterilisera 100 mL örnens MEM medium (icke-innehållande fenol röd) i autoklav. Låt medlet svalna till rumstemperatur, och sedan lägga till 2% FBS, 2% Penicillin Streptomycin, 4 mM L-glutamin och 2,25 g/L NaHCO3. Förvaras vid 4 ° C.</li>
	<li>För plack analysen, sterilisera 100 mL 2,5% agarosgel av autoklav. Förbereda gelen samma dag plack analysen utförs. Lagra gelen på 47 ° C i ett vattenbad.</li>
</ol>2. cellkultur
<ol><li>Ta bort en cryotube som innehåller MA104 cellinjer från behållaren med flytande kväve. Placera cryotube i ett vattenbad vid 37 ° C Tina cellerna. Tillsätt 1 mL cellsuspension till 20 mL serum-innehållande mediet i en T75 kolv. Inkubera kolven i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2 i 2 eller 3 dagar. Obs: Slutliga cellkoncentrationen i suspensionen är cirka 106 celler/mL.</li>
	<li>När den cell enskiktslager når 80% konfluens, avlägsna supernatanten och tvätta cellerna två gånger med 5 mL av 1 x Dulbecco's PBS (fosfatbuffrad saltlösning).</li>
	<li>Tillsätt 4 mL 0,05% trypsin-EDTA till kolven och inkubera vid 37 ° C i 5 min till lossa cellerna från kolven. Överföra cellsuspensionen till en 15 mL rör och centrifugera vid 190 x g under 5 minuter.</li>
	<li>Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleterat cellerna (106 celler) i 1 mL serum-innehållande medium beredda i 1.1. Späd de återsuspenderade cellerna på 100-fold med mediet.</li>
	<li>Tillsätt 3 mL av den utspädda cellsuspensionen till varje brunn 6-väl (för plack analysen) eller 24 brunnar (för cell-bindande analysen), respektive. Inkubera plattorna i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga i 2 eller 3 dagar. Obs: En T75-kolv passar att samla in proverna som tid-kurs eftersom provvolymen av supernatanten (1 mL) kan ignoreras jämfört med den totala supernatant volymen (30 mL). Under tiden mäts den smittsam titern av viruset i varje supernatanten genom den plack-test, som utförs vanligtvis med en 6-bra platta. En 24-well platta utnyttjas för cell-bindande analysen.</li>
</ol>3. särskilda tillväxttakten av Rotavirus
Obs: Rhesus rotavirus (RRV, genotyp: G3P[3]) utnyttjas i detta protokoll eftersom RRV kan snabbt och enkelt bilda plack med MA104 celler.
<ol><li>Plats en tub innehållande 1 mL virus suspensionen (107 pfu/mL) i ett serumfritt medium lagras vid-80 ° C i ett vattenbad vid 37 ° C Tina. Tillsätt 1 µg/µL trypsin från svin bukspottkörteln till 1 mL av virussuspension (slutliga trypsin koncentration är 4 µg/mL) och sedan vortex. Inkubera virus suspensionen vid 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga för 30 min. Obs: Trypsin från andra källor kan användas, men effekten på rotavirus smittsamhet måste testas i förväg.</li>
	<li>Späd med aktiverat virus fjädringen med ett serumfritt medium att justera multiplicityen av infektion (MOI) till 0.1 pfu/cell.</li>
	<li>Tillsätt 1 mL utspädd virussuspension till MA104 cellinjer (80% konfluenta) i en T75 kolv 3 dagar efter cellen plätering (2.1), inkubera vid 37 ° C i 1 h och försiktigt skaka kolven varje 15 min.</li>
	<li>Lägg sedan till 30 mL ett serumfritt medium innehållande 0.13 µg/mL av trypsin från en svin bukspottkörtel till kolven. Inkubera kolven vid 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga.</li>
	<li>Samla in 1 mL av supernatanten i kolven vid 0, 6, 12, 18, 24 och 36 (eller 48) h efter infektion (hpi) och ersätta supernatanten i 1,5 mL rör med pipett.</li>
	<li>Genomför frysningen (-80 ° C) och smälter i ett vattenbad vid 37 ° C cykel tre gånger. Sedan Centrifugera rören vid 12.600 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Samla in supernatanten.</li>
	<li>Filtrera supernatanten med destillerat 0,2 µm filter att ta bort den cell-fraktionen. Lagra supernatanten-80 ° C i kylskåpet tills tillämpa det på plack analysen för att mäta virus titern.</li>
	<li>Placera rören som innehåller insamlade supernatanten (steg 3.5) i vattenbad vid 37 ° C. Tillsätt 4 µg/mL trypsin till en 1 mL 10-faldig utspädda provet och inkubera vid 37 ° C i 30 min.</li>
	<li>Under 30 min inkubering i 3,8, börja tvätta plack analysen för att mäta virus titern erhållits från tid kursen (steg 3.5), MA104 cellerna två gånger i en 6-well platta med 2 mL 1 x PBS efter ta bort mediet som innehåller serum.</li>
	<li>Seriellt späd ruvade proverna med ett serumfritt medium och Inokulera 1 mL av det utspädda provet i varje brunn. Inkubera plattan för 90 min vid 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga, och skaka försiktigt plattan varje 15 min.</li>
	<li>Efter inkubation, ta bort inokulatet från 6-väl plattan. Lägga till 4 µg/mL trypsin till medium bereddes i (steg 1.3). Försiktigt men omedelbart tillsätts 3 mL av det medium som blandas med agarosgel (förhållandet är 1:1) till varje brunn.</li>
	<li>Förvara plattan i rumstemperatur för mer än 10 min (tills agarosgel blir fast) och Inkubera under 2 dagar vid 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga. Obs: Häll det medium som blandas med agar från kanten av brunnen.</li>
	<li>Tillsätt 1 mL av 0,015% neutral röd lösningen späds med 1 x PBS till varje brunn och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga. Ta bort färgen efter 3 h och inkubera i 1 dag vid 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga.</li>
	<li>Nästa dag, räkna antalet plack i varje brunn och beräkna den pfu/mL. Kontrollera noga cell sammanflödet innan plack analysen att försäkra plack siffrorna.</li>
</ol>4. cell-bindande Assay
Obs: Detta protokoll baseras på Gillings rapport13.
<ol><li>Lägg till 1 µg/µL trypsin från en svin bukspottkörteln 1 ml av virussuspension (slutliga trypsin koncentration är 4 µg/mL) och sedan vortex (på samma sätt som i 2.1). Späd med virus fjädringen med ett serumfritt medium att justera MOI av 1 pfu/cell.</li>
	<li>Sedan tvätta MA104 cellerna två gånger på 24-väl tallrik med 1 ml Tris-buffrad koksaltlösning (TBS; 2,53 g/L Tris basera, 6.54 g/L NaCl, 0,3 g/L KCl, 0.046 g/l Na2HPO4 för att nå 1 L med destillerat vatten).</li>
	<li>Inokulera 100 µL utspädda virussuspension till varje brunn 24-well platta med celler, och inkubera vid 4 ° C i 90 minuter med varsam skakning varje 15 min.</li>
	<li>Ta bort det virus inokulatet och tvätta cellerna två gånger med 1 mL av TBS. För att extrahera dubbelsträngat (ds) RNA av rotavirus, lägga till 140 µL 1 x PBS och 560 µL av RNA extraktion bufferten (se Tabell för material) till varje brunn. Blanda tillräckligt med pipett (ca 10 x eller tills den haze eller förorening av celler i bufferten inte är sett).</li>
	<li>När du har återställt den dubbelsträngat RNA (dsRNA) enligt tillverkarens protokollet, placera de 1,5 mL rör som innehåller dsRNA extraktet på en värme block vid 95 ° C i 5 min att denaturera dsRNA, och sedan omedelbart placera rören på is och inkubera i mer än 2 min.</li>
	<li>Syntetisera cDNA med hjälp av en omvänd Transkription kit (se Tabell för material). Tillsätt 4 µL denaturerat viral RNA lösning i en PCR-rör som innehåller 16 µl av blandning (tabell 1) och blanda försiktigt med en pipett för att inte generera bubblor. Snurra ner rören.</li>
	<li>Utföra omvänd Transkription med en termocykel på villkor som anges i tabell 2. Om cDNA inte används omedelbart, lagra PCR-röret som innehåller cDNA vid-20 ° C upp till 1 år.</li>
	<li>Använda primers för kvantitativ PCR (framåt; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', omvänd; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 och en sond att infoga en törstsläckare (qPCR sonder; 5'- / FAM/ATGAGCACA/törstsläckare/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA /-3'), inriktning i 963 – 1049 regionen av NSP3 genomet segment av rotavirus (ST3 stam, GenBank: X81436). Obs: Törstsläckare sätts in sonden designad av Zeng et al.14
</li>
	<li>Späd standard plasmiden seriellt (101 106 kopior/ml) med PCR grade vatten till qPCR blandningen (tabell 3) och göra huvudmixen (20 µL/prov) för qPCR efter tabell 4.</li>
	<li>Tillsätt 20 µL av master mix i brunnen av en PCR-plattan med 96 brunnar och sedan blanda 5 µL av cDNA prover eller 5 µL standard plasmiden genom pipettering 10 gånger. Starta reaktionen av qPCR systemet enligt de villkor som framgår av tabell 4.</li>
	<li>För att beräkna rotavirus genomet bunden till MA104 cellytan, genomföra linjär regression mellan Ct-värden och antalet kända genomet från en standard plasmid och uppskatta provets genomet nummer. Sedan beräkna förhållandet mellan virion nummer bindningen till celler (Gt) till dem i den ursprungliga inokulatet (G0).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rna+Virus+Mutations.">Rna Virus Mutations.</a> Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).</li><li>Gouvea, V., Brantly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+rotavirus+a+population+of+reassortants?.">Is rotavirus a population of reassortants?.</a> Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).</li><li>Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-chlorine+disinfection+as+a+selection+pressure+on+norovirus.">Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).</li><li>Ghosh, S., Kobayashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genomic+analysis+of+rotavirus+strains:+current+status+and+future+prospects.">Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects.</a> Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).</li><li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2008+estimate+of+worldwide+rotavirus-associated+mortality+in+children+younger+than+5+years+before+the+introduction+of+universal+rotavirus+vaccination+programmes:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).</li><li>Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+and+correlates+of+protection+for+rotavirus+vaccines.">Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines.</a> Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).</li><li>Santos, N., Hoshino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+distribution+of+rotavirus+serotypes/+genotypes+and+its+implication+for+the+development+and+implementation+of+an+effective+rotavirus+vaccine.">Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine.</a> Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).</li><li>Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylodynamic+analyses+of+rotavirus+genotypes+G9+and+G12+underscore+their+potential+for+swift+global+spread.">Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread.</a> Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).</li><li>Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+molecular+epidemiology+of+rotavirus+infection+after+introduction+of+monovalent+rotavirus+vaccination+in+Scotland.">Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland.</a> Vaccine. 35, 156-163 (2017).</li><li>Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+rotaviruses+in+continuous+human+and+monkey+cell+lines+that+vary+in+their+expression+of+integrins.">Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins.</a> Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).</li><li>Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+a2b1+and+a4b1+can+mediate+SA11+rotavirus+attachment+and+entry+into+cells.">Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells.</a> Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).</li><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).</li><li>Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+antiviral+action+of+plant+antimicrobials+against+murine+norovirus.">Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).</li><li>Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+quantitative+RT-PCR+for+the+detection+of+rotavirus+in+acute+gastroenteritis.">One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis.</a> Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).</li><li>Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+evaluation+of+rotavirus-cell+interactions:+identification+of+an+enterocyte+ganglioside+fraction+that+mediates+group+A+porcine+rotavirus+recognition.">Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition.</a> Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).</li><li>Br&#252;ssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+milk+immunoglobulins+for+passive+immunity+to+infantile+rotavirus+gastroenteritis.">Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).</li><li>Outzen, H., Berglund, G. I., Smal&#229;s, A. O., Willassen, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+and+pH+sensitivity+of+trypsins+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+in+comparison+with+bovine+and+porcine+trypsin.">Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).</li><li>Saxena, K., Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).</li><li>Yin, Y., Bijvelds, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+rotavirus+infection+and+antiviral+therapy+using+primary+intestinal+organoids.">Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids.</a> Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Våra protokoll för mätning av den specifika tillväxttakten är lättare än tidigare och kan anpassas för andra virus såvida deras cellodlingssystem inte har ännu fastställts. I denna studie använde vi RRV (G3P[3]) eftersom denna stam kan bilda plack lättare än humant rotavirus när du använder MA104 cellinjer. Vissa humant rotavirus stammar kan inte bilda plack i denna cellinje. Därför i stället för plack analysen, kan fokus bildar (FFU) analys15 eller median vävnadsodling smittsamma enhetsdos (TCID50) analys tillämpas för många rotavirus stammar16. Presenterade protokollet för att fastställa specifika tillväxt kan användas för andra virustyper men är inte lämplig för virus för vilka inga etablerade cellodlingssystem är etablerad. Innan du börjar experimentet för specifika tillväxten, det är bättre att veta i förväg när viruset smittsamt titern börjar öka och når den stationära fasen i ett preliminärt test. Om det finns alltför många plack bör plack analysen utföras igen efter att ha ändrat spädning av de virus proverna. Timmar efter infektionen (hpi) att samla in prover är också viktiga eftersom lutningen på exponentiella tillväxtfasen kan underskattas om den rätta tidpunkten att nå den stationära fasen är missat. Genom en tillnärmning av den modifierade modellen Gompertz, bör alltid en determinationskoefficienten beräknas och kontrolleras. Om lämplighet att modifierade Gompertz modellen är låg, kan andra tillväxtmodeller såsom den modifierade logistiska modell12 vara att föredra.
Vid hantering av celler, när du tar bort det medium eller virus inokulatet, PBS för tvättning eller agaros gel för plack assay omgående måste läggas till varje väl av en cell kultur plattan att förhindra celler från torrhet. Samtidigt, måste du försiktigt hälla PBS eller agaros till celler inte att lossna från brunnar. Detta steg är det viktigaste i båda analyser (steg 3.9 och 3.11). Om plack analysen har alltför många prover, rekommenderar vi dela upp agarosgel (100 mL varje maximalt rekommenderas) i flera medelstora flaskor och varmhållning flaskorna förrän strax före användning sedan agaros gel är stelnat ca 10 min. på room temperatur. Eftersom trypsin är utsatta för höga temperaturer17, bör en trypsin-lösning läggas till ett medium och agarosgelelektrofores för plack analysen efter adekvat nedkylning.
I cell-bindande analysen, måste inkubationstiden för virus bindning till celler göras vid 4 ° C att förhindra invasionen av cellerna. Enligt Gillings metod13är cellerna benägna att torka vid låga temperaturer, så varsam skakning är nödvändigt varje 15 min under inkubation. I RNA extraktion kit utnyttjas här kan ersätta andra kit. Lutningen på standardkurvan i RT-qPCR bör vara cirka 3,3 och determinationskoefficienten bör vara mer än 0,98. Analysen jämfört med fluorescens Mikroskop att visualisera localizationen av virus i celler, och är snabbare och enklare att använda eftersom bindningen av fluorescerande ämnen att virus inte är nödvändigt.
Nyligen, human intestinal enteroid (HIE), uppvisar en liknande cellulära sammansättning och funktion som mänskliga mag epitel, blivit tillgänglig för rotavirus förökning18. Användning av HIE kan göra det möjligt för oss att utvärdera tillväxthastighet och cell-bindande förmåga av icke-odlingsbara stammar av rotavirus. Också, båda experimenten som beskrivs här kan tillämpas på utvärdering av läkemedelseffekter på båda fenotyper19. De protokoll som presenteras här gör det möjligt att kvantitativt diskutera förändringar i fenotyp parametervärdena för rotavirus stammar under varierande förhållanden.

RNA-virus utgör en genetiskt olika population, känd som quasispecies1, på grund av deras mutationshastighet,2 som är högre än för DNA-baserade organismer. Befolkningsstruktur i quasispecies påverkas av befolkningens genetiska faktorer, inklusive mutation, selektionstryck och genetisk drift. Stammar inom en enda genetiska härstamning kan visa olika fenotyper på grund av den genetiska mångfalden. Rachmadi et al. visade till exempel att fritt klor känslighet var annorlunda bland murina norovirus stammar som härstammar från en plack-renat stam S7-PP33.
Rotavirus (släkte rotavirus i reoviridae familj) är icke-höljebärande ds RNA virus bildar quasispecies2. Utöver befolkningen genetiska faktorer som beskrivs ovan, påverkar genomet genvariation den genetiska mångfalden av rotavirus eftersom detta virus har 11 segmenterade genomen4. Rotavirus orsakar diarré främst bland spädbarn och spädbarn dödsfall i 2013 uppskattades ca 250.0005. Två vacciner används i flera länder och har varit effektiva för att minska bördan av rotavirusinfektion, men vissa forskare nu diskuterar förekomsten av vaccinet-escape mutants6,7,8, 9. karakterisering av dessa mutanter är viktigt att förstå mekanismerna som vaccin-escape.
Här presenterar vi protokoll för två analyser för utvärdering av tillväxthastighet och cell-bindande förmåga av rotavirus för att förstå de fenotypiska skillnaderna bland stammar/mutanter. Tillväxtkurvan av rotavirus har presenterats i tidigare rapporter10, men tillväxten parametrar såsom tillväxthastighet mäts inte vanligtvis. En cell-bindande analysen genomförs innebär tidigare Immunofluorescerande färgning teknik11. Vi visar här enklare metoder för att använda den plack assay och RT-qPCR, som tillåter oss att kvantitativt diskutera skillnaden i viral fenotyper. Dessa metoder är lämpliga för karakterisering av rotavirus fenotyper och kan slutligen bidra till byggandet av nya vacciner effektivt för flera genotyper.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7500 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-EPI</td>
			<td>Nakalai Tesque, Inc</td>
			<td>01101-34</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>194-02875</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05900</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05901</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward / Reverse primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>140-00932</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-) &#34;Nissui&#34;</td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05913</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liguid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR039A</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR037A</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52904</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>199-05985</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>198-01675</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 6-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancrease</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0303-1G</td>
			<td>Activate for rotavirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus

Rotavirus är den viktigaste etiologiska faktorn för infantil diarré. Det är en dubbelsträngat (ds) RNA-virus och bildar en genetiskt olika befolkning, känd som quasispecies, på grund av deras höga mutationshastighet. Här, beskriver vi hur man mäter specifika tillväxttakten och cell-bindande möjligheten av rotavirus som dess fenotyper. Rotavirus är behandlade med trypsin att erkänna cell receptorn och sedan inokuleras i MA104 cellkultur. Supernatanten, inklusive viral avkommor, samlas in periodvis. Plack analysen används för att bekräfta virus titern (plaque-forming unit: pfu) av varje insamlade supernatanten. Den specifika tillväxten uppskattas av passande tid-bandata pfu/ml till den modifierade Gompertz modellen. I analysen av cell-bindande, är MA104 celler i en 24-well platta infekterade med rotavirus och inkuberas i 90 minuter vid 4 ° C för rotavirus adsorption till cellreceptorer. En låg temperatur hindrar rotavirus från invaderande värdcellen. Efter tvättning för att avlägsna obunden virioner, ur RNA virioner bifogas cellreceptorer följt av cDNA syntes och omvänd-Transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR). Dessa protokoll kan användas för att utreda de fenotypiska skillnaderna mellan virusstammar.

En översikt av två protokoll för tillväxthastighet och cell-bindande haltbestämning av plack-renat RRV stammar visas i figur 1A och 2A, respektive.
I analysen för specifika tillväxttakten når slutliga virus antikroppnivåns mer än 107 pfu/mL när förökningsmaterial på T75 kolven. Om den maximala koncentrationen är lägre än 107 pfu/mL, MA104 cellen kan inte ha blivit konfluenta eller RRV aktiverades inte väl av trypsin. Vissa tillväxtmodeller finns för att uppskatta särskilda tillväxttakten med hjälp av infektiös enhetsdata. I detta protokoll, är den modifierade Gompertz modell12 anställd som exempel; <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
där N0 (104 pfu/mL i denna studie) och Nt (104 108 pfu/ml) är den virus smittsam titern (pfu/mL) vid 0 och t (exempel: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, respektive A är det asymptotiska värdet [logg (N∞/N0 )] (exempel: 3 till 4), µ är den specifika tillväxttakten [1/h], e är den Napiers konstant och λ är perioden fördröjning [h]. Modellparametrar erhålls genom funktionen Problemlösaren av programvaran analys, vilket minimerar summan av kvadraten på skillnaden mellan observerade och modellerade värden. I exemplet i figur 1Bspecifikt tillväxttakten (µ) uppskattas till 0.197 [1/h] och perioden fördröjning (λ) är 6.61 [h] genom att tillämpa metoden minst kvadrat till en modifierad Gompertz modell, och den relativa virus titern på den stationära fasen till den ursprungliga titer ( log skala) (A) är 3,15 [logg (N∞/N0)]. Vi har testat 6 rotavirus kloner sammanlagt, och de uppskattade värdena för den specifika tillväxttakten varierade från 0,19 till 0,27 [1/h]. Dessa beräknade värden är tillförlitlig eftersom koefficienten för bestämning värden i modell tillbehöret är mer än 0,98.
RRV virioner binda till cellytan var cirka 103 kopior/mL (bindande effektivitet var omkring 1%) när du använder en 24-well platta för cell-bindande analysen (figur 2B). Analysen utförs vanligtvis tre gånger för varje prov, och om en stor varians i kopienumret observeras i ett prov, vissa problem såsom över tvätt- och otillräckliga aktivering av RRV av trypsin kan förekomma. Ct värdet av qPCR överstiger ungefär 36,0 är inte att föredra och anses vara nedanför en detektionsgräns i vår qPCR skick.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volym / 1 reaktion</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x PrimeScript buffert</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript RT enzym blanda jag</td>
			<td>1,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo dT Primer</td>
			<td>1,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Slumpmässiga 6 mers</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avjoniserat vatten</td>
			<td>6,0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ssRNA prov</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td>20,0 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Master blanda sammansättning för cDNA syntes av rotavirus genomet.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur [° C]</td>
			<td>Tid</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Reaktion villkor för cDNA syntes av rotavirus genomet.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Volym/1 reaktion</td>
		</tr>
<tr>
<td>Premix Taq</td>
			<td>12.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forward primer (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reverse primer (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonden (10 µM)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Referens Dye II</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avjoniserat vatten</td>
			<td>5.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA prov</td>
			<td>5.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td>25 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Master blanda sammansättning för kvantitativa PCR av rotavirus en arvsmassa.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatur [° C]</td>
			<td>Tid</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">45 cykel</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 4: Reaktion villkor för kvantitativ PCR för rotavirus en arvsmassa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> Figur 1: Schematisk översikt av uppskattningen av rotavirus tillväxt och tillväxtkurvan av rotavirus. (A), infektiös enheten av rotavirus mäts med plack-analys. (B) kurvan (blå linje) approximerades av modifierade Gompertz modell baserat på observerade data i vårt laboratorium (vita cirklar). Den specifika tillväxttakten [µ]; 0.197 [h-1], släpa period (λ); 6.61 [h], relativa virus titern på den stationära fasen till ursprungliga titern (logaritmisk skala) A. 3.15 [logg (N∞/N0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> Figur 2: Schematisk översikt och representativa resultat av cell-bindande analysen av fem RRV stammar renats från plack i vårt laboratorium. (A) A cell kultur plattan inokuleras med rotavirus inkuberas vid 4 ° C för att hämma virus invasionen in i cellerna. Efter inkubation och ta bort de obundna viruspartiklarna till celler, kvantifiera antalet genomen med ursprung från bundna viruspartiklar till cellytan med RT-qPCR. (B) resultatet av cell-bindningen assay visades som bindande effektivitet (%), vilket var förhållandet mellan bundna viruspartiklar att de närvarande i inokulatet. Fet bar: medianvärde, slutet av lådor: kvartil avvikelse, slutet av raden: maximum och minimum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Här presenterar vi två protokoll, en för att mäta den specifika tillväxttakten och den andra för rotavirus med hjälp av plack assay och RT-qPCR cell-bindande förmåga. Dessa protokoll finns tillgängliga för att bekräfta skillnaderna i fenotyper mellan rotavirus stammar.

Analyser för de specifika tillväxttakt och Cell-bindande förmåga Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Med hjälp av de analyser som presenteras här, kan skillnaden i fenotyp bland rotavirus stammar utvärderas, där unika stammar isoleras. Specifikt undersöks den fenotypiska förändringen av desinfektionsmedelsresistenta stammar av rotavirus. För att uppnå tydliga kvantitativa utdata med hjälp av plackens analysen är det avgörande att välja en lämplig kombination av rotavirusstam och serum, i vilken rotaviruset är väl anpassat till serumet.Demonstrerar ingreppet blir Syun-suke Kadoya, en doktorand från mitt laboratorium. Ta bort en CryoTube som innehåller MA104 cellinjer från behållaren flytande kväve. Placera CryoTube i ett vattenbad vid 37 grader Celsius för att tina cellerna.Tillsätt en milliliter av cellupphängningen till 20 milliliter av det seruminnehållande mediet i en T75-kolv. Inkubera kolven i en inkubator i 37 grader Celsius och 5%CO2 i två till tre dagar. När cellens monolayer når 80%konfluency, ta bort supernatanten och tvätta cellerna två gånger med fem milliliter av 1X Dulbeccos PBS.Tillsätt fyra milliliter på 0,05%trypsin-EDTA till kolven, och inkubera i 37 grader Celsius i fem minuter för att lossa cellerna från kolven. Överför cellupphängningen till ett 15 milliliterrör, och centrifug vid 190 g i fem minuter. Kassera supernatanten och resuspend de pelleterade cellerna i en milliliter av seruminnehållande medium.Späd sedan de återanvända cellerna 100-faldigt med mediet. Tillsätt tre milliliter av den utspädda cellupphängningen till varje brunn av en sex-brunnsplatta för plaketten. Tillsätt en milliliter av den utspädda cellfjädringen till varje brunn av en 24-brunnsplatta för cellbindande analysen.Inkubera plattorna i en inkubator vid 37 grader Celsius och 5%CO2 undersättad ånga i två eller tre dagar. Överför ett rör som innehåller en milliliter av virus suspensionen i serumfritt medium från lagring vid minus 80 grader Celsius till en 37 grader Celsius vattenbad att tina. Tillsätt ett mikrogram per mikroliter trypsin från svin bukspottkörteln till en milliliter av viruset suspension och sedan virvel.Inkubera viruset suspension vid 37 grader Celsius och 5%CO2 undermättade ånga i 30 minuter. Späd den aktiverade virusfjädringen med serumfritt medium för att justera infektionsmultiden, eller MOI, till 0,1 pfu per cell. Tillsätt en milliliter av den utspädda virusfjädringen till MA104-celler i en T75-kolv tre dagar efter cellplätering.Inkubera cellerna med virus vid 37 grader Celsius i en timme, försiktigt skaka kolven var 15 minuter. Tillsätt sedan 30 milliliter av ett serumfritt medium som innehåller fyra mikrogram per milliliter trypsin från svinpanspottkörteln till kolven. Inkubera kolven i 37 grader Celsius och 5%CO2 underättad ånga.Samla en milliliter av supernatanten i kolven vid noll, sex, 12, 18, 24 och 36 timmar efter infektion, och byt ut supernatanten i de 1,5 millilitertyperna med hjälp av en pipett. Genomför en frys-töcykel inom 15 minuter vid minus 80 grader Celsius följt av en 15-minuters smältning i ett vattenbad vid 37 grader Celsius. Sedan centrifugera rören på 12, 600 g i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Samla supernatanten. Filtrera supernatanten med ett destillerat 0,2 mikronfilter för att avlägsna cellfraktionen. Förvara supernatanten vid minus 80 grader Celsius tills den appliceras på plackanalysen för mätning av virustiteren.När du är redo att utföra plaketten analysen, placera rören som innehåller den insamlade supernatanten i ett vattenbad vid 37 grader Celsius. Tillsätt trypsin till en milliliter av 10-faldigt utspädt prov, och inkubera i 37 grader Celsius i 30 minuter. Under denna 30-minuters inkubation tvättar du försiktigt MA104-cellerna i en sex-brunnsplatta med två milliliter på 1X PBS efter att det seruminnehållande mediet avlägsnats.Seriellt späd de inkuberade proverna med serumfritt medium och inokulera en milliliter av det utspädda provet i varje brunn. Inkubera plattan i 90 minuter vid 37 grader Celsius och 5%CO2 undersättad ånga, försiktigt skaka plattan var 15 minuter. Efter inkubationen, avlägsna inokulatet från sex-brunnsplattan.Tillsätt fyra mikrogram per milliliter trypsin till det förberedda mediet. Försiktigt men tillsätt omedelbart tre milliliter av mediet blandat med agarosgel till varje brunn. Låt agarosgeln stelna vid rumstemperatur i mer än 10 minuter.Sedan inkubera plattan i två dagar vid 37 grader Celsius och 5%CO2 undersaturated ånga. Därefter lägger du till en milliliter på 0,015%Neutral Röd lösning utspädd med 1X PBS till varje brunn, och inkubera med samma villkor. Ta bort färgämnet efter tre timmar och fortsätt att inkubera under en dag.Nästa dag, räkna antalet plack i varje brunn och beräkna pfu per milliliter. Kontrollera försiktigt cellen sammanflödet innan plack analysen för att försäkra plack nummer. För cell-bindande analys, tillsätt ett mikrogram per mikroliter trypsin från en porcine bukspottkörtel till en milliliter av viruset suspension, och sedan virvel.Späd virusfjädringen med serumfritt medium för att justera MOI till en pfu per cell. Tvätta MA104-cellerna två gånger i en 24-brunnsplatta med en milliliter trisbuffrad saltlösning. Nu inokulera cellerna med 100 mikroliter av utspädd virus suspension i varje brunn av 24-brunnsplattan.Inkubera plattan i fyra grader Celsius i 90 minuter med varsam skakning var 15: e minut. Ta bort viruset inokulat, och tvätta cellerna två gånger med en milliliter tris-buffrad saltlösning. För att extrahera det dubbelsträngade RNA av rotaviruset, tillsätt 140 mikroliter av 1X PBS och 560 mikroliter av RNA extraktionsbufferten till varje brunn.Blanda tillräckligt med en pipett tills disen av celler i bufferten inte ses. Efter att ha återhämtat sig den dubbelsträngade RNA, enligt tillverkarens protokoll, placera 1,5 milliliter rör, som innehåller dubbelsträngade RNA extrakt, på ett värmeblock vid 95 grader Celsius i fem minuter för att denaturera RNA. Placera sedan omedelbart rören på is och inkubera i mer än två minuter.Syntetisera cDNA genom att använda en omvänd transkriptionssats. Tillsätt fyra mikroliter av denaturerad viral RNA-lösning till ett PCR-rör som innehåller 16 mikroliter reaktionsblandning, och blanda det försiktigt med en pipett för att inte generera bubblor. Efter att ha snurrat ner rören, utför den omvända transkriptionen med en termocykler.För kvantitativ PCR, använd en quencher-insättande sond som riktar sig till 963 till 1, 049 regionen av NSP3 genomet segmentet av rotavirus. Seriellt späda standardplasmid med PCR-grade vatten, och fortsätt att göra master mix för kvantitativa PCR. Lägg till 20 mikroliter av mastermixen till brunnarna i en 96-väl PCR-platta.Blanda sedan fem mikroliter cDNA-prover eller fem mikroliter av standardplasmiden genom pipettering 10 gånger. Utför kvantitativ PCR enligt villkoren i textprotokollet. Beräkna slutligen det rotavirusgenom som är bundet till CELLEN MA104-ytan enligt beskrivningen i textprotokollet.Visas här är en tillväxtkurva av rotavirus. Genom att tillämpa den minst kvadratiska metoden på en modifierad Gompertz-modell beräknas den specifika tillväxttakten vara 0,197, och eftersläpningsperioden beräknas vara 6,61 timmar. Den relativa virustitern vid den stationära fasen till den inledande titern är 3,15.Av de sex testade rotavirusklonerna varierade de uppskattade värdena för den specifika tillväxttakten från 0,19 till 0,27. Dessa uppskattade värden är tillförlitliga eftersom bestämningsvärdenas koefficient i modellpassning är mer än 0,98. Resultatet av cell-bindande analysen visas som bindande effektivitet, vilket är förhållandet mellan bundna viruspartiklar till de som finns i inokulat.Våra RV virions bindning till cell ytor är ca 10, 000 kopior per milliliter med en bindande effektivitet på cirka 1%när du använder en 24-brunns platta för cell-bindande analys. Eftersom odlade celler är känsliga för fysiska påfrestningar, noga med att hälla bufferten och agar försiktigt men snabbt. I huvudsak har ett nytt system för virusen införts.Med hjälp av detta system kan vi utvärdera den verkliga cellbindande förmågan och specifik tillväxthastighet med instrument. Vårt protokoll är fördelaktigt att mäta den fenotypiska drag. Genom att kontrollera olika av nyupprättade stammar kan du hjälpa till att utvärdera dess nya vacciner för virusen.Virusen betecknas som BSL-2 patogener, så du kommer att behöva förbereda BSL-2 experimentella rum för att utföra denna procedur.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Kvantitativa analyser av alla influensa typ A Viral Hemagglutinins och neuroaminidaser använda Universal antikroppar i enkla mätmetoder Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Analyser för identifiering av nya Virushämmande medel mot blåtungevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: hög kapacitet Kvantifiering av Colony Tillväxt och Lag Tid

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-medierad Isothermal Amplification (LAMP) Analyser för de artspecifika Upptäckt av<em&gt; Eimeria</em&gt; Som infekterar Kycklingar

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Parvis Tillväxt Konkurrens analys för att bestämma replikerings Fitness av humant immunbristvirus

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Tidig viralt inträde Analyser för identifiering och utvärdering av antivirala föreningarna

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitativa och kvantitativa analyser för att upptäcka och karakterisering av protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Snabb och särskild bedömning av halogene peroxidasaktiviteten i Leukocyte berikad blodprover

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Analyser för studerar roll för Aktiebolaget Trav &amp; galopp i bakteriell vidhäftning och Serum motstånd

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...