Name: assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Bu eser "Sanitasyon değer Zinciri: tasarlama sanitasyon sistemleri olarak Eko-toplum değer sistemi" projesi, insanlık ve doğa (RIHN, Proje No.14200107) için ResearchInstitute tarafından desteklenmiştir.

1. orta hazırlık
<ol><li>Bir hücre kültür orta (serum içeren orta) yapmak için 500 mL distile su 4.7 g kartal MEM tozu ekleyin. Otoklav 120 ° c 20 dk ve oda sıcaklığında orta soğumaya bırakın. Fetal Sığır serum ekleyin (son konsantrasyonu: % 10), L-Glutamine (2 mM), penisilin streptomisin (% 1) ve sodyum bikarbonat (1,125 g/L). 4 ° C'de 1 ay için saklayın.</li>
	<li>Serum-Alerjik orta adım 1.1 ama fetal Sığır serum olmadan açıklandığı gibi virüs yayma için hazır olun. 4 ° C'de 1 ay için saklayın.</li>
	<li>Plak tahlil için kartal MEM Orta (sigara içeren fenol red) 100 mL tarafından ısıyla sterilize. Orta serin oda sıcaklığına ve % 2 eklemek izin FBS, %2 penisilin streptomisin, 4 mM L-glutamin ve 2.25 g/L NaHCO3. 4 ° C'de mağaza</li>
	<li>Plak tahlil için 100 mL % 2.5 özel jel otoklav tarafından sterilize. Jel plak tahlil yapılır aynı gün hazırlayın. 47 ° C'de jel bir su banyosunda saklayın.</li>
</ol>2. hücre kültürü
<ol><li>Sıvı azot konteyner MA104 hücre satırlarını içeren bir cryotube kaldırın. Cryotube su banyosu 37 ° C'de hücreler çözülme yerleştirin. Hücre süspansiyon 1 mL T75 şişe serum içeren ortamda 20 mL ekleyin. Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye için 2-3 gün kuluçkaya. Not: Son hücre süspansiyon içinde yaklaşık 106 hücre/mL bölgedir.</li>
	<li>Hücre monolayer % 80 confluency ulaştığında, süpernatant kaldırmak ve iki kez 5 mL 1 x Dulbecco'nın PBS (fosfat tamponlu tuz) de içeren hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Şişesi için 4 mL % 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve şişeye hücrelerden ayırmak 5 min için 37 ° C'de kuluçkaya. Hücre süspansiyon 15 mL tüp ve 5 min için 190 x g, santrifüj aktarın.</li>
	<li>Süpernatant atın ve 1 mL serum içeren orta hazırlanan 1.1 pelleted hücrelerde (106 hücreleri) resuspend. Resuspended hücreleri, 100-fold seyreltik orta ile.</li>
	<li>Seyreltilmiş hücre süspansiyon 3 mL 6-iyi (için plak tahlil) veya 24-şey tabak (hücre-bağlama tahlil) için her şey sırasıyla ekleyin. Bir kuluçka doymuş buhar altında 37 ° C ve % 5 CO2 tabak için 2-3 gün kuluçkaya. Not: Bir T75 şişesi süpernatant (1 mL) örnek hacmi toplam süpernatant birime (30 mL) göre göz ardı edilemez çünkü zaman ders örnekleri toplamak uygundur. Bu arada, her süpernatant virüs bulaşıcı titresi genellikle 6-şey plaka kullanılarak yapılır plak tahlil tarafından ölçülür. 24-şey plaka hücre bağlayıcı tahlil için kullanılmaktadır.</li>
</ol>3. belirli büyüme hızının Rotavirüs
Not: Rhesus Rotavirüs (RRV, genotip: G3P[3]) RRV plaklar MA104 hücreleri ile hızla ve kolayca oluşturabilir çünkü bu protokol için kullanılmaktadır.
<ol><li>Erimek için bir yer 37 ° C'de bir su banyosunda-80 ° C'de depolanan serum serbest ortamda virüs süspansiyon (107 pfu/mL), 1 mL içeren bir tüp. 1 µg/µL tripsin domuz pankreas virüs süspansiyon (son tripsin 4 µg/mL bölgedir) ve sonra girdap için 1 mL ekleyin. Doymuş buhar için 30 dk altında 37 ° C ve % 5 CO2 virüs süspansiyon kuluçkaya. Not: Tripsin diğer kaynaklardan kullanılabilir ancak Rotavirüs infektivite etkisi önceden test edilmesi gerekiyor.</li>
	<li>Enfeksiyon (MOI) 0.1 pfu/hücreye çeşitliliğini ayarlamak için bir serum-Alerjik orta ile aktif virüs süspansiyon sulandırmak.</li>
	<li>1 mL sulandırılmış virüs süspansiyon MA104 hücre (% 80 birleşmesi) bir T75 şişesi 3 gün sonra (2.1) kaplama hücre ekleme, 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya ve yavaşça salla şişeye her 15dk.</li>
	<li>Sonra bir domuz pankreas dan tripsin şişeye için 0,13 µg/mL içeren bir serum-Alerjik orta 30 mL ekleyin. Doymuş buhar altında 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye kuluçkaya.</li>
	<li>1 mL 0, 6, 12, 18, 24, şişeye süpernatant ve 36 (ve/veya 48) s sonrası enfeksiyon (HPI) toplamak ve süpernatant bir pipet kullanarak 1,5 mL tüpler değiştirin.</li>
	<li>Dondurma (-80 ° C) yapmak ve bir su banyosunda 37 ° C döngüsünde üç kez eritebilir. 12.600 x g 4 ° C'de 10 dakika için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant toplamak.</li>
	<li>Süpernatant hücre kesir kaldırmak için distile 0.2 µm filtre ile filtre. Süpernatant-80 ° C virüs titresi ölçmek için plak tahlil uygulamak kadar buzdolabında saklayın.</li>
	<li>Toplanan süpernatant (adım 3.5) 37 ° C'de bir su banyosunda içeren tüpler yerleştirin 4 µg/mL tripsin 10 kat seyreltilmiş örnek için bir 1 mL ekleyin ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>3,8, 30 dk kuluçka sırasında saat ders örnekleri (adım 3.5) elde edilen virüs titresi ölçmek için plak tahlil başlamak için MA104 hücrelerde iki kez 6-şey plaka 2 mL 1 x PBS ile serum içeren orta çıkardıktan sonra yıkayın.</li>
	<li>Seri olarak serum-Alerjik orta ile inkübe örnekleri sulandırmak ve 1 mL sulandırılmış örneğinin her kuyuya aşılamak. 90 dk 37 ° C ve doymuş buhar altında % 5 CO2 plaka kuluçkaya ve plaka her 15 dakikada hafifçe çalkalanır.</li>
	<li>Kuluçka sonra inoculum 6-şey plaka kaldırın. (Adım 1.3) hazırlanan orta 4 µg/mL tripsin ekleyin. Yavaşça ama hemen her şey için (oran 1: 1'dir) özel jel ile karışık orta 3 mL ekleyin.</li>
	<li>(Özel jel katı hale gelinceye kadar) plaka daha--dan 10 dakika oda sıcaklığında tutmak ve 37 ° C ve % 5 CO2 doymuş buhar altında 2 gün kuluçkaya. Not: Kuyunun kenarından agar ile karışık orta dökün.</li>
	<li>1 mL 1 x PBS için her şey ile seyreltilmiş %0,015 tarafsız kırmızı çözeltisi ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO2 doymuş buhar altında kuluçkaya. Boya 3 h sonra çıkarın ve 37 ° C ve % 5 CO2 doymuş buhar altında 1 gün kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, her iyi plaklar saymak ve pfu/mL hesaplayın. Hücre izdiham plak numaraları sağlamak için plak tahlil önce dikkatlice kontrol edin.</li>
</ol>4. hücre bağlayıcı tahlil
Not: Bu protokolü Gilling'ın raporu13tarihinde dayanır.
<ol><li>1 µg/µL tripsin bir domuz pankreas virüs süspansiyon (son tripsin 4 µg/mL bölgedir) ve sonra girdap için 1 mL (2.1 aynı şekilde) ekleyin. 1 pfu/hücre MOI ayarlamak için bir serum-Alerjik orta ile virüs süspansiyon sulandırmak.</li>
	<li>Sonra MA104 hücreleri Tris tamponlu tuz 1 ml ile 24-şey plaka üzerinde iki kez yıkayın (TBS; 2.53 g/L Tris taban, 6,54 g/M NaCl, 0.3 g/L KCl, 0,046 g/l 1 L distile su ile ulaşmak için Na2HPO4 ).</li>
	<li>Her şey bir 24-şey plaka hücreleri ile seyreltilmiş virüs süspansiyon 100 µL aşılamak ve nazik her 15dk sallayarak ile 90 dakika, 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Virüs inoculum kaldırmak ve hücreleri TBS. 1 mL ile iki kez yıkamak Çift iplikçikli Rotavirüs (ds) RNA ayıklamak için 1 PBS x 140 µL ve RNA ayıklama arabelleği 560 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) her şey için. Yeterli bir pipet (10 x hakkında veya sis veya kirletici hücre arabellek görmedim kadar) ile karıştırın.</li>
	<li>Üreticinin protokolüne göre çift iplikçikli RNA (dsRNA) geri aldıktan sonra yer dsRNA, tabiatını ve sonra hemen tüpler buza koyun ve fazla 2 için kuluçkaya 5 min için 95 ° c ısı blokta dsRNA özü içeren 1,5 mL tüpler Min.</li>
	<li>Ters transkripsiyon kullanarak cDNA sentez ( Tablo malzemelerigörmek) kit. Denatüre viral RNA çözüm 4 µL 16 µl karışımı (Tablo 1) içeren bir PCR tüp ve dikkatle kabarcıklar oluşturmamanız bir pipet ile karıştırın. Tüpler spin.</li>
	<li>Tablo 2' de gösterilen koşul altında termal cycler ile ters transkripsiyon gerçekleştirin. CDNA hemen kullanılmazsa cDNA-20 ° c ilâ 1 yıl için içeren PCR tüp depolamak.</li>
	<li>Astar kantitatif PCR için kullanın (ileri; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', ters; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 ve bir içki ekleme bir araştırma (qPCR sondalar; 5'- / FAM/ATGAGCACA/içki/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA /-3'), hedefleme 963-1049 bölge NSP3 genom segmentin Rotavirüs, (ST3 zorlanma, GenBank: X81436). Not: İçki Zeng vd.14 tarafından tasarlanmış sonda eklenir
</li>
	<li>Standart plazmid seri olarak sulandırmak (101 106 kopya/ml) PCR ile hemzemin su qPCR karışıma (Tablo 3) ve ana mix (20 µL/örnek) Tablo 4takip qPCR için yapmak.</li>
	<li>20 µL ana karışımı bir 96-şey PCR tabak iyi ve 10 kez pipetting tarafından cDNA örnekleri 5 µL veya standart plazmid 5 µL karıştırın. QPCR sistem Tablo 4' te gösterilen koşullara göre tepki başlar.</li>
	<li>MA104 hücre yüzeyine bağlı Rotavirüs genom hesaplamak için standart bir plazmid bilinen genom sayısı Ct değerleri arasındaki doğrusal regresyon kuralları ve örnek'ın genom numarasını tahmin ediyoruz. Sonra bu ilk inoculum (G0) virion numaraları bağlama hücrelere (Gt) oranını hesaplamak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rna+Virus+Mutations.">Rna Virus Mutations.</a> Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).</li><li>Gouvea, V., Brantly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+rotavirus+a+population+of+reassortants?.">Is rotavirus a population of reassortants?.</a> Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).</li><li>Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-chlorine+disinfection+as+a+selection+pressure+on+norovirus.">Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).</li><li>Ghosh, S., Kobayashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genomic+analysis+of+rotavirus+strains:+current+status+and+future+prospects.">Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects.</a> Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).</li><li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2008+estimate+of+worldwide+rotavirus-associated+mortality+in+children+younger+than+5+years+before+the+introduction+of+universal+rotavirus+vaccination+programmes:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).</li><li>Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+and+correlates+of+protection+for+rotavirus+vaccines.">Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines.</a> Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).</li><li>Santos, N., Hoshino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+distribution+of+rotavirus+serotypes/+genotypes+and+its+implication+for+the+development+and+implementation+of+an+effective+rotavirus+vaccine.">Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine.</a> Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).</li><li>Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylodynamic+analyses+of+rotavirus+genotypes+G9+and+G12+underscore+their+potential+for+swift+global+spread.">Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread.</a> Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).</li><li>Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+molecular+epidemiology+of+rotavirus+infection+after+introduction+of+monovalent+rotavirus+vaccination+in+Scotland.">Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland.</a> Vaccine. 35, 156-163 (2017).</li><li>Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+rotaviruses+in+continuous+human+and+monkey+cell+lines+that+vary+in+their+expression+of+integrins.">Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins.</a> Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).</li><li>Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+a2b1+and+a4b1+can+mediate+SA11+rotavirus+attachment+and+entry+into+cells.">Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells.</a> Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).</li><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).</li><li>Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+antiviral+action+of+plant+antimicrobials+against+murine+norovirus.">Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).</li><li>Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+quantitative+RT-PCR+for+the+detection+of+rotavirus+in+acute+gastroenteritis.">One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis.</a> Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).</li><li>Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+evaluation+of+rotavirus-cell+interactions:+identification+of+an+enterocyte+ganglioside+fraction+that+mediates+group+A+porcine+rotavirus+recognition.">Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition.</a> Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).</li><li>Br&#252;ssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+milk+immunoglobulins+for+passive+immunity+to+infantile+rotavirus+gastroenteritis.">Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).</li><li>Outzen, H., Berglund, G. I., Smal&#229;s, A. O., Willassen, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+and+pH+sensitivity+of+trypsins+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+in+comparison+with+bovine+and+porcine+trypsin.">Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).</li><li>Saxena, K., Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).</li><li>Yin, Y., Bijvelds, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+rotavirus+infection+and+antiviral+therapy+using+primary+intestinal+organoids.">Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids.</a> Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Belirli büyüme hızını ölçmek için bizim iletişim kuralı önceki olanlardan daha kolaydır ve onların hücre kültür sistemi henüz kurulmuş sürece diğer virüsler için adapte edilebilir. Bu çalışmada, RRV kullanılan (G3P[3]) çünkü bu zorlanma plaklar insan rotaviruses daha kolay MA104 hücre hatları kullanırken oluşabilir. Bazı insan Rotavirüs suşları plak bu hücre kültürünü oluşamıyor. Bu nedenle, plak yöntemi yerine, birimi (FFU) tahlil15 veya medyan doku kültürü bulaşıcı doz (TCID50) oluşturan odak tahlil birçok Rotavirüs suşları16için uygulanabilir. Belirli büyüme oranı belirlemek için sunulan iletişim kuralı diğer virüs türleri için kullanılabilir ancak hiçbir kurulan hücre kültür sistemi kurulduğu virüsler için uygun değildir. Belirli büyüme oranı denemenin başlamadan önce virüs bulaşıcı titresi artmaya başladığında önceden bilmek daha iyi ve sabit bir ön test aşamasında ulaşır. Çok fazla plaklar varsa, plak tahlil tekrar virüs örnekleri seyreltme oranı değiştirdikten sonra yapılmalıdır. Örnekleri toplamak için saat sonrası enfeksiyon (HPI) are da önemli durağan faz ulaşmak için uygun bir zaman nokta cevapsız Eğer üstel büyüme aşaması eğimi göz ardı çünkü. Değiştirilmiş Gompertz modeli tarafından yaklaşım içinde bir katsayısı her zaman hesaplanır ve kontrol. Değiştirilmiş Gompertz modeli için fitness düşükse, değiştirilmiş lojistik modeli12 gibi diğer büyüme modelleri daha uygun olabilir.
Hücreleri, orta veya virüs inoculum kaldırırken ele, PBS plak tahlil için yıkama veya özel jel için hemen her birine eklenmelidir kuruluk hücrelerden önlemek için de bir hücre kültür plaka. Aynı zamanda, PBS veya özel hücrelere kuyulardan ayırmaz için hafifçe dökmek gerekir. Her iki deneyleri (adım 3,9 ve 3.11) en önemli adımdır. Plak tahlil de pek çok örnekleri vardır, özel jel (100 mL her maksimum tavsiye edilir) birkaç orta şişe ayırmaktan ve sadece özel beri kullanmadan önce jel Salonu'nda yaklaşık 10 dakika içinde katılaşmış kadar şişe sıcak tutmak önerilir sıcaklık. Tripsin yüksek sıcaklık17' ye savunmasız olduğu için bir orta ve aşağı yeterli soğutma sonra plak tahlil için özel bir tripsin çözüm eklenmesi gerekir.
Hücre bağlayıcı tahlil hücrelere virüs bağlama için kuluçka 4 ° C, hücreleri işgali önlemek için yapmanız gerekir. Gilling'ın yöntemi13göre nazik sallayarak her 15dk kuluçka sırasında gerekli bu yüzden düşük ısılarda, kurutma için eğilimli hücrelerdir. Burada kullanılan RNA ekstraksiyon kiti diğer kitleri için yedek olabilir. RT-qPCR standart eğri eğimi yaklaşık 3.3 olmalıdır ve belirleme katsayısı 0,98 fazlası olmalıdır. Yerelleştirme hücrelerdeki virüslerin görselleştirmek için floresans mikroskobu ile karşılaştırıldığında, tahlil daha hızlı ve daha kolay bağlama virüslere karşı Floresan maddelerin gerekli olmadığı için kullanın.
Son zamanlarda, bir benzer hücresel kompozisyon ve işlev sergileyen insan bağırsak enteroid (HIE), insan gastrointestinal epitel, Rotavirüs yayılım18için kullanılabilir hale gelmiştir. HIE kullanımı bize belirli büyüme oranı ve culturable Rotavirüs suşları hücre bağlama yeteneği değerlendirmek izin verebilir. Ayrıca, burada açıklanan her iki deneyler uyuşturucu etkileri her iki fenotipleri19değerlendirilmesi için uygulanabilir. Burada sunulan protokolleri kantitatif fenotip parametre değerleri farklı koşullar altında Rotavirüs suşlarının değişiklikleri tartışmak mümkün kılar.

RNA virüsleri onların mutasyon oranı,2 DNA tabanlı organizmalar daha yüksek olduğunu nedeniyle quasispecies1olarak, bilinen bir genetik olarak farklı nüfus oluşturmaktadır. Quasispecies nüfus yapısında nüfus genetik etkenler tarafından mutasyon, seçim basınç ve genetik sürüklenme gibi etkilenir. İçinde tek bir genetik soy suşları farklı fenotipleri nedeniyle genetik çeşitlilik gösterebilir. Örneğin, Rachmadi ve ark. serbest klor duyarlılığı bir plak saf yük S7-PP33kökenli fare norovirus suşları arasında farklı olduğunu gösterdi.
Rotaviruses (reoviridae ailesindeki cins Rotavirüs) Sigara saran ds RNA virüsleri quasispecies2şekillendirme vardır. 11 parçalı genleri4bu virüs var çünkü nüfus genetik faktörlerin yanı sıra yukarıda açıklanan, Rotavirüs genetik çeşitliliği genom reassortment etkiler. Rotaviruses esas olarak bebekler arasında ishale neden ve Bebek ölümleri 2013 yılında 250.0005hakkında tahmin edilmiştir. İki aşı birçok ülkede kullanılmakta olan ve Rotavirüs enfeksiyon yükünün azaltılmasında etkili olmuştur, ama bazı araştırmacılar şimdi aşı-kaçış mutantların6,7,8, varlığı görüşüyorlar 9. bu mutant karakterizasyonu aşı-kaçış mekanizmaları anlamak önemlidir.
Burada, iletişim kuralları belirli büyüme oranı ve fenotipik farklılıklar suşları/mutantlar arasında anlamak için Rotavirüs hücre bağlama yeteneği değerlendirmek için iki deneyleri için mevcut. Ama rotaviruses büyüme eğrisi önceki raporları10içinde sunulmuştur büyüme parametrelerini belirli büyüme hızı gibi genellikle değil ölçülür. Yürütülen bir hücre bağlayıcı tahlil daha önce immünfloresan boyama tekniği11içerir. Biz burada nicelik viral fenotipleri farklılığı tartışmak için bize izin plak tahlil ve RT-qPCR, kullanmanın daha kolay yöntemleri gösterir. Bu yöntemler Rotavirüs fenotipleri karakterizasyonu için uygundur ve nihayet yeni aşılar için birden fazla genotip etkili inşaatı için katkıda bulunabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7500 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-EPI</td>
			<td>Nakalai Tesque, Inc</td>
			<td>01101-34</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>194-02875</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05900</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s MEM &#34;Nissui&#34; <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg" /></td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05901</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward / Reverse primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>140-00932</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-) &#34;Nissui&#34;</td>
			<td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>_05913</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liguid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR039A</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td>
			<td>TAKARA Bio Inc.</td>
			<td>RR037A</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52904</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>199-05985</td>
			<td>Cell culture and Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>198-01675</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates 6-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Plaque assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Cell binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancrease</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0303-1G</td>
			<td>Activate for rotavirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the specific growth rate and cell-binding ability of rotavirus

Rotavirüs infantil ishal için ana etyolojik faktördür. Bir çift iplikçikli (ds) RNA virüsüdür ve quasispecies sayesinde onların yüksek mutasyon oranı olarak bilinen bir genetik olarak farklı nüfus oluşturur. Burada, belirli büyüme oranı ve Rotavirüs hücre bağlama yeteneği onun fenotipleri olarak ölçmek nasıl açıklar. Rotavirüs tripsin ile hücre reseptör tanımak için tedavi ve MA104 hücre kültürü aşılandı. Viral progenies, dahil olmak üzere süpernatant, zaman zaman toplanır. Plak tahlil virüs titresi onaylamak için kullanılır (plak oluşturan birim: pfu), her toplanan süpernatant. Belirli büyüme oranı zamanlı kurs veri olarak pfu/mL değiştirilmiş Gompertz modeli için yaklaştırarak tahmin edilmektedir. Hücre bağlayıcı tahlil MA104 hücreleri bir 24-şey plaka Rotavirüs ile enfekte ve 90 dakika Rotavirüs adsorpsiyon hücre reseptörleri için 4 ° C'de inkübe. Düşük sıcaklık konak hücre istila gelen Rotavirüs kısıtlayan. İlişkisiz virions kaldırmak için yıkadıktan sonra RNA hücre reseptörleri ardından cDNA sentezi ve Ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) bağlı virions üzerinden elde edilir. Bu protokoller virüs suşları arasında fenotipik farklılıklar soruşturma için uygulanabilir.

İki protokolleri belirli büyüme oranı ve hücre bağlayıcı tahlil plak-saf RRV suşları için genel bir bakış Şekil 1A ve 2A, sırasıyla gösterilir.
Tahlil için belirli büyüme oranı, son virüs titresi 10'dan fazla7 pfu/mL T75 şişesi üzerinde yayılıyor ulaşır. Maksimum konsantrasyon 107 pfu/mL düşükse, MA104 hücre Konflüan olabilir değil veya RRV de tripsin tarafından etkinleştirilemedi. Bazı büyüme modelleri bulaşıcı birimi verileri kullanarak belirli büyüme oranı tahmin etmek için kullanılabilir. Bu protokol için değiştirilmiş Gompertz model12 örnek olarak istihdam edilmektedir; <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
nerede N0 (104 pfu/mL Bu çalışmada) ile Nt (104 108 pfu/ml) 0 ile t virüsü bulaşıcı titresi (pfu/mL) vardır (örnek: 0, 6, 12, 18, 24, 36) HPI, sırasıyla, A asimptotik değerdir [günlük (N∞/N0 )] (örnek: 3-4), µ [1/h] belirli büyüme oranı, e Napier'ın sabittir ve λ gecikme süresi [h]. Modeli Parametreler çözücü işlevi gözlenen ve model değerleri arasındaki farkı karelerinin toplamı en aza indirir analiz yazılımı tarafından elde edilir. Şekil1B örnekte belirli büyüme oranı (µ) 0.197 [1/h] olduğu tahmin edilmektedir ve gecikme (λ) 6.61 [h] az kare yöntemi değiştirilmiş bir Gompertz modeli ve göreli virüs titresi ilk titresi (için sabit faz uygulayarak dönemdir oturum ölçek) (A) 3,15 [log (N∞/N0)] olduğunu. Toplamda 6 Rotavirüs klonlar test ettik ve belirli büyüme oranı tahmini değerleri 0,19 0,27 [1/h] arasında değişiyordu. Bunlar tahmini değerleri güvenilir olduklarından modeli uygun değerlerde belirlenmesi katsayısı 0,98 öte bir şey.
RRV virions hücre yüzeylere bağlama vardı yaklaşık 103 kopya/mL (verimlilik bağlama oldu yaklaşık % 1 ') 24-şey plaka (Şekil 2B) hücre bağlayıcı tahlil için kullanırken. Tahlil genellikle her örnek için üç kez yapılır ve kopya sayısı büyük bir farkı bir örnek görülmektedir, RRV aşırı yıkama ve yetersiz etkinleştirme tripsin tarafından gibi bazı sorunlar oluşabilir. Yaklaşık 36.0 aşan qPCR Ct değerini tercih değildir ve bizim qPCR durumda bir algılama sınırın altındaki kabul edilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Birim / 1 tepki</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript arabellek x 5</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript RT enzim ben Mix</td>
			<td>1.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo dT astar</td>
			<td>1.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rasgele 6 mers</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Deiyonize distile su</td>
			<td>6.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ssRNA örnek</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam</td>
			<td>20,0 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Master mix Rotavirüs genomunun cDNA sentezi için kompozisyon.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sıcaklık [° C]</td>
			<td>Zaman</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 dk</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 dk</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Tepki durumu cDNA sentezi için Rotavirüs genom.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Cilt/1 tepki</td>
		</tr>
<tr>
<td>Premiks Taq</td>
			<td>12.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>İleri astar (10 µM)</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ters astar (10 µM)</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonda (10 µM)</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Referans boya II</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Deiyonize distile su</td>
			<td>5.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA örnek</td>
			<td>5.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam</td>
			<td>25 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Master mix kantitatif PCR bileşimi Rotavirüs genom.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sıcaklık [° C]</td>
			<td>Zaman</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 dk</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">45 döngüsü</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 dk.</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 dk</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4: Tepki durumu kantitatif PCR Rotavirüs genom.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> Şekil 1: Rotavirüs büyüme tahmini ve Rotavirüs büyüme eğrisi şematik bakış. (A) Rotavirüs bulaşıcı birimi plak tahlil ile ölçülür. (B) eğrisi (mavi çizgi) bizim laboratuvar (beyaz daire) gözlenen verilerini temel alan değiştirilmiş Gompertz modeli tarafından yaklaşık olarak. Belirli büyüme oranı [µ]; 0.197 [s-1], gecikme süresi (λ); 6,61 [h], ilk titresi (günlük ölçek) için sabit faz göreli virüs titresi (A); 3,15 [log (N∞/N0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> Şekil 2: şematik genel bakış ve temsilcisi plaklar bizim laboratuvar gelen saf beş RRV suşlarının hücre bağlayıcı tahlil sonucu. (A) A hücre kültür plaka Rotavirüs ile aşılanmış 4 ° C'de virüs istilası hücrelere inhibe için inkübe 's. Kuluçka ve ilişkisiz viral parçacıkların hücrelere kaldırma sonra hücre yüzeyine RT-qPCR ile ilişkili viral parçacıkların kaynaklanan genleri sayısını ölçmek. (B) hücre bağlama sonucu tahlil bu inoculum içinde mevcut için ilişkili viral parçacıkların oranı olan verimlilik (%), bağlayıcı olarak görüntülenmiştir. Kalın çubuk: medyan, kutuları sonu: DÖRTTEBİRLİK açılım, satır sonu: maksimum ve minimum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus at JoVE.com

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Burada belirli büyüme oranı ve diğer Rotavirüs plak tahlil ve RT-qPCR kullanarak hücre bağlama yeteneği ölçmek için iki protokol mevcut. Bu protokoller fenotipleri farklılıkları Rotavirüs suşları arasında teyit için kullanılabilir.

Belirli büyüme oranı ve hücre-bağlama yeteneği Rotavirüs deneyleri

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Burada sunulan tahliller kullanılarak, benzersiz suşların izole edildiği rotavirüs suşları arasındaki fenotip farkı değerlendirilebilir. Özellikle, rotavirüs dezenfektan dirençli suşların fenotik değişiklik araştırılır. Plak tahlilini kullanarak net kantitatif çıktılar elde etmek için, rotavirüs seruma iyi adapte olduğu uygun bir rotavirüs suş ve serum kombinasyonunu seçmek önemlidir.Prosedürü gösteren Syun-suke Kadoya, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak. Sıvı nitrojen kabından MA104 hücre hatları içeren bir CryoTube'u çıkarın. Hücreleri eritmek için CryoTube'u 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin.Bir T75 şişesinde serum içeren ortamın 20 mililitresine bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Şişeyi 37 santigrat derecede bir kuluçka makinesine ve %5 CO2'ye 2-3 gün kuluçkaya yatırın. Hücre monolayer% 80 birleşimi ulaştığında, supernatant çıkarın ve 1X Dulbecco PBS beş mililitre ile iki kez hücreleri yıkayın.Şişeye %0,05 tripsin-EDTA'nın dört mililitresini ekleyin ve hücreleri şişeden ayırmak için 37 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik bir tüp e ve santrifüjü 190 g'da beş dakika aktarın. Supernatant atın ve serum içeren orta bir mililitre peletli hücreleri resuspend.Daha sonra resuspended hücreleri 100 kat orta ile seyreltin. Plak teşpiçin altı kuyulu bir plakanın her kuyuya seyreltilmiş hücre süspansiyonunun üç mililitresini ekleyin. Hücre bağlayıcı teşp için 24 kuyulu bir plakanın her kuyuya seyreltilmiş hücre süspansiyonunun bir mililitresini ekleyin.Plakaları 37 santigrat derecede bir kuluçka makinesinde ve %5 CO2 az doymamış buhara iki veya üç gün kuluçkaya yatırın. Serumsuz ortamda bir mililitre virüs süspansiyonu içeren bir tüpü eksi 80 santigrat derecededepodan 37 santigrat derece su banyosuna aktarın. Domuz pankreasından bir mililitrevirüs süspansiyon ve daha sonra girdap tripsin mikrolitre başına bir mikrogram ekleyin.Virüs süspansiyonuna 37 santigrat derece ve %5 CO2 az doymamış buharı 30 dakika kuluçkaya yatırın. Enfeksiyon veya MOI'nin çokluğunu hücre başına 0,1 pfu'ya ayarlamak için aktif virüs süspansiyonunu serumsuz ortamla seyreltin. Hücre kaplamaüç gün sonra bir T75 şişesinde MA104 hücrelerine seyreltilmiş virüs süspansiyon bir mililitre ekleyin.Hücreleri 37 derecede virüsle bir saat boyunca tüplü olarak her 15 dakikada bir hafifçe sallayarak kuluçkaya yatırın. Sonra şişe pankreas tan şişetripsin tripsin mililitre başına dört mikrogram içeren bir serum içermeyen orta 30 mililitre ekleyin. Şişeyi 37 santigrat derece ve %5 CO2 az doymamış buharla kuluçkaya yatırın.Sıfır, altı, 12, 18, 24 ve 36 saat enfeksiyon sonrası şişede supernatant bir mililitre toplamak ve bir pipet kullanarak 1.5 mililitre türleri supernatant değiştirin. Eksi 80 santigrat derecede 15 dakika içinde donma-çözülme döngüsü ve ardından 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 15 dakikalık bir erime gerçekleştirin. Sonra tüpleri 12, 600 g'da 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.Supernatant toplamak. Hücre fraksiyonunu kaldırmak için distile 0,2 mikron filtre ile supernatant filtre. Virüs titresini ölçmek için plak testine uygulayana kadar süpernatantı eksi 80 santigrat derecede saklayın.Plak tayini yapmaya hazır olduğunuzda, toplanan süpernatantiçeren tüpleri 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. 10 kat seyreltilmiş örnek bir mililitre trypsin ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Bu 30 dakikalık kuluçka sırasında, serum içeren ortamı çıkardıktan sonra MA104 hücrelerini altı kuyulu bir tabakta 1X PBS'nin iki mililitresi ile dikkatlice yıkayın.İnmiş numuneleri serumsuz ortamla seri olarak seyreltin ve seyreltilmiş numunenin bir mililitresini her kuyuya aşıla. Plakayı 37 santigrat derecede 90 dakika kuluçkaya yatırın ve %5 CO2 doymuş buharı, her 15 dakikada bir yavaşça sallayarak. Kuluçkadan sonra, altı kuyulu plakadan inokülçıkarın.Hazırlanan ortama tripsin mililitrebaşına dört mikrogram ekleyin. Yavaşça ama hemen her iyi agarose jel ile karışık orta üç mililitre ekleyin. Agarose jel fazla 10 dakika oda sıcaklığında katılaşmak için izin verin.Daha sonra plakayı 37 santigrat derecede iki gün kuluçkaya yatırın ve %5 CO2 az doymuş buhar. Daha sonra, her kuyuya 1X PBS ile seyreltilmiş bir mililitre 0,015% Nötr Kırmızı çözelti ekleyin ve aynı koşullarda kuluçkaya yatırın. Üç saat sonra boyaçıkarın ve bir gün kuluçkaya devam edin.Ertesi gün, her kuyudaki plak sayısını sayın ve mililitre başına pfu hesaplayın. Plak numaralarını temin etmek için plak tetkikinden önce hücre birleşimini dikkatlice kontrol edin. Hücre bağlayıcı testi için, bir domuz pankreasından bir mililitrevirüs süspansiyonuna tripsin mikrolitresi başına bir mikrogram ekleyin ve sonra girdap.Hücre başına bir pfu MOI ayarlamak için serum içermeyen orta ile virüs süspansiyon seyreltin. MA104 hücrelerini 24 kuyulu bir tabakta bir mililitre tris-tamponlu tuzlu ile iki kez yıkayın. Şimdi hücreleri 100 mikrolitre seyreltilmiş virüs süspansiyonuyla 24 kuyunun her kuyusu yla aşılamaya devam edin.Her 15 dakikada bir hafifsal sallayarak 90 dakika boyunca dört santigrat derecede plaka kuluçka. Virüs inoculum çıkarın ve tris-tamponlu tuzlu bir mililitre ile iki kez hücreleri yıkayın. Rotavirüs çift iplikli RNA ayıklamak için, her kuyuya 1X PBS 140 mikrolitre ve 560 mikrolitre RNA ekstraksiyon tamponekleyin.Tampondaki hücrelerin sisi görülmeden bir pipetle yeterince karıştırın. Çift iplikçikli RNA'yı geri kurtardıktan sonra, üreticinin protokolüne göre, rna'yı dennature'da 5 dakika boyunca 95 derecede bir ısı bloğuna, çift iplikli RNA ekstresi içeren 1,5 mililitrelik tüpler yerleştirin. Sonra hemen buz tüpleri yerleştirin ve iki dakikadan fazla kuluçka.Ters transkripsiyon kiti kullanarak cDNA sentezin. 16 mikrolitre reaksiyon karışımı içeren bir PCR tüpüne dört mikrolitre denatüre viral RNA çözeltisi ekleyin ve kabarcıklar oluşturmamak için bir pipetle dikkatlice karıştırın. Tüpler aşağı döndükten sonra, bir termocycler ile ters transkripsiyon gerçekleştirin.Kantitatif PCR için, rotavirüsün NSP3 genom segmentinin 963-1, 049 bölgesini hedefleyen bir quencher-ekleme probu kullanın. Standart plazmidi PCR dereceli suyla seri olarak seyreltin ve kantitatif PCR için ana karışımı yapmaya devam edin. 96 kuyulu PCR plakanın kuyularına 20 mikrolitre ana karışım ekleyin.Daha sonra 10 kez borulama ile beş mikrolitre cDNA numunesi veya standart plazmidin beş mikrolitresini karıştırın. Metin protokolündeki koşullara göre nicel PCR gerçekleştirin. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi MA104 hücre yüzeyine bağlı rotavirüs genomunu hesaplayın.Burada gösterilen rotavirüs bir büyüme eğrisidir. Değiştirilmiş bir Gompertz modeline en az kare yöntemi uygulanarak, belirli büyüme hızı0,197 ve gecikme süresi 6,61 saat olarak tahmin edilmektedir. İlk titrer için sabit fazda göreceli virüs titresi 3.15'tir.Test edilen altı rotavirüs klonu arasında, belirli büyüme oranının tahmini değerleri 0,19 ile 0,27 arasında değişmektedir. Model montajındaki kararlılık değerlerinin katsayısı 0,98'den fazla olduğundan, bu tahmini değerler güvenilirdir. Hücre bağlayıcı lık teşbinin sonucu, bağlı viral parçacıkların inokülde bulunanlara oranı olan bağlayıcı verimlilik olarak görüntülenir.Hücre yüzeylerine bağlanan RV virions hücre bağlayıcı töz için 24 kuyuplaka kullanırken yaklaşık% 1 bağlayıcı verimliliği ile mililitre başına yaklaşık 10.000 kopya vardır. Ekili hücreler fiziksel streslere duyarlı olduğundan, tampon ve agar yavaşça ama hızlı bir şekilde dökmek için dikkat edin. Esasen, virüsler için yeni bir sistem tanıtıldı.Bu sistemi kullanarak, gerçek hücre bağlama yeteneğini ve belirli büyüme oranını enstrümanlarla değerlendirebiliriz. Protokolümüz, henotibik özelliğin ölçülmesinde avantajlıdır. Yeni ortaya çıkan suşları farklı kontrol ederek, virüsler için yeni aşıları değerlendirmek için yardımcı olabilir.Virüsler BSL-2 patojenleri olarak belirlenmiştir, bu nedenle bu işlemi gerçekleştirmek için BSL-2 deneysel odalar hazırlamanız gerekir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: Yüksek verim Colony Büyüme niceliksel ve Zaman Lag

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Türler özgü Algılama Loop-aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP) Tahliller<em&gt; Eimeria</em&gt; Tavuklar bulaştırmak ki

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Vitronectin bakteriyel yapışma ve Serum direnç rolü eğitim için deneyleri

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...