Name: inducement and evaluation of a murine model of experimental myopia
Uploaded: 2019-01-22T14:30:00
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Nous remercions M.T. Pardue pour obtenir des conseils sur la SDOCT, F. Schaeffel pour obtenir des conseils sur les mesures de réfraction et de la courbure cornéenne, M. Sanshouo pour recréer les données de l’image en trois dimensions, M. Miyauchi ; K. Tsubota ; Y. Tanaka ; S. Kondo ; C. Shoda ; M. Ibuki ; Y. Miwa ; Y. Hagiwara ; A. Ishida ; Y. Tomita ; Y. Katada ; E. Yotsukura ; K. Takahashi ; et Y. Wang pour discussions critiques. Ce travail a été soutenu par inAid de subventions pour la recherche scientifique (KAKENHI, numéro 15K 10881) du ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie (MEXT), aux savoirs traditionnels. Ce travail est également soutenu par la subvention pour la recherche de la myopie de Tsubota Laboratory, Inc. (Tokyo, Japon).

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique sur la recherche d’Animal de la Keio University School of Medicine ont adhéré à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux en ophtalmique et Vision Research, les lignes directrices sur l’expérimentation animale à Keio L’université et la recherche de l’Animal : Reporting de In Vivo des expériences (arrivée) lignes directrices pour l’utilisation des animaux en recherche.
1. assembler les l...

<ol>
	<li>Dolgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myopia+boom.">The myopia boom.</a> Nature. 519 (7543), 276-278 (2015).</li><li>Ohno-Matsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathologic+Myopia.">Pathologic Myopia.</a> Asia-Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia, Pa). 5 (6), 415-423 (2016).</li><li>Morgan, I. G., Ashby, R. S., Nickla, D. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goggles+for+controlling+the+visual+environment+of+small+animals.">Goggles for controlling the visual environment of small animals.</a> Laboratory Animal Science. 44 (3), 292-294 (1994).</li><li>Tkatchenko, T. V., Tkatchenko, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine-xylazine+anesthesia+causes+hyperopic+refractive+shift+in+mice.">Ketamine-xylazine anesthesia causes hyperopic refractive shift in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 67-71 (2010).</li><li>Chou, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+elongation+of+eye+size+in+DBA/2J+mice+compared+with+C57BL/6J+mice:+in+vivo+analysis+with+whole-eye+OCT.">Postnatal elongation of eye size in DBA/2J mice compared with C57BL/6J mice: in vivo analysis with whole-eye OCT.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52 (6), 3604-3612 (2011).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+axial+length+measurements+in+mouse+eyes.">Assessment of axial length measurements in mouse eyes.</a> Optometry and Vision Science. 89 (3), 296-303 (2012).</li></ol>

Pour s’assurer que les lunettes à fixer solidement sur la tête de la souris, plusieurs étapes dans le présent protocole doivent être accordé une grande attention. Le périoste doit être retiré complètement avant d’utiliser le système adhésif dentaire. Le sang sur le crâne doivent également être nettoyé avec soin. Un peu fine tuning est acceptable tout de suite après l’application de l’adhésif, ne déplacez pas le bâton fréquemment avant le système adhésif sèche vers le haut. Suivez les instr...

La prévalence de la myopie a considérablement augmenté récemment, alors que le mécanisme de son apparition et la progression sont encore largement inconnu1. Le phénotype le plus caractéristique de la myopie est l’allongement de la longueur axiale (AL), ce qui augmente le risque de complications rétiniennes ou même cécité2. Pour mieux comprendre la pathogénie de la myopie et de développer des traitements efficaces, des modèles animaux robustes et myopes et évaluation de phénotype stable sont nécessaires.
En bref, deux méthodes existent pour induire des États myopes chez les animaux : forme-privation myopie (FDM) et myopie induite par l’objectif (LIM)3. Les premiers diffuseurs devant le œil des endroits ou sutures la paupière pour obscurcir l’image, ce qui influe sur le développement normal de le œil, ce qui entraîne un phénotype myopie. Les derniers endroits moins lentilles devant le œil pour déplacer le point focal derrière la rétine. La rétine détecte le déplacement de l’accent et s’allonge le globe oculaire pour réaligner la rétine et le point focal. Pour FDM, après que la paupière est fermée ou le diffuseur a été fixé devant le œil, presque aucun entretien supplémentaire n’est nécessaire. Pour LIM, la lentille doit être enlevé pour le nettoyage afin du pour maintenir transparent. Ainsi, FDM est relativement facile d’être induit sur le plan technique. Cependant, les mécanismes de FDM et LIM sont différents, et quelle méthode imite la myopie chez l’homme est mieux encore en débat3. Un des points forts de LIM est le phénotype plus fort comparé à FDM, au moins dans le cas des souris4.
Les animaux qui ont été utilisées pour induire la myopie incluent poussins5singes6, musaraignes d’arbre7, cochons d’Inde8et souris4. Compte tenu de la possibilité de manipulation génétique, des anticorps disponibles abondantes et faible coût d’élevage, souris aurait pu être le premier choix comme le modèle animal de la myopie. Toutefois, par rapport aux autres grands animaux, fixation des lentilles ou diffuseurs devant le œil de la souris est relativement difficile, surtout pour les jeunes souris tels que droit après le sevrage. Pour les expériences nécessitant l’administration de médicaments topiques ou mesures provisoires yeux multiples, il faut aussi de l’image soient amovibles. Un autre défi est le petit changement morphologique du globe oculaire de souris, qui a besoin de techniques sophistiquées et dispositifs à évaluer. A ce jour, différents induisant et mesurer les protocoles utilisés dans les équipes de recherche différentes rendent difficile de comparer et de répéter les résultats à travers des laboratoires. Un protocole standard avec précision est nécessaire.
Des travaux précédents décrit plusieurs méthodes pour résoudre les lentilles ou les diffuseurs devant le œil de souris, tels que collage9, couture10 et lunette visiocasques cadre11,12. Nous avons combiné l’exist visiocasques jumelles technics11,12,13 avec notre cadre nouvellement conçu pour élaborer un protocole d’induire pour induire une myopie expérimentale robuste et efficace chez les souris. Le protocole peut être appliqué à des souris jeunes peu après le sevrage au 21e jour (p21). Nous avons également optimisé les processus d’évaluation stable et précise des phénotypes, y compris la réfraction et AL. Nous espérons que ce protocole normalisé peut aider à faire les souris myopes un modèle plus facilement accessible pour la recherche de la myopie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>screw</td>
			<td>NBK</td>
			<td>SNZS-M1.4-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>washer</td>
			<td>MonotaRO</td>
			<td>42166397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nut</td>
			<td>MonotaRO</td>
			<td>42214243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stick</td>
			<td>DMM Make</td>
			<td>none</td>
			<td>designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frame</td>
			<td>DMM Make</td>
			<td>none</td>
			<td>designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenses</td>
			<td>RAINBOW CONTACT LENS</td>
			<td>none</td>
			<td>customized for mice use by the company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
			<td>OK MODEL</td>
			<td>MP 20g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dental adhesive resin cement</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>super bond</td>
			<td>contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infrared photorefractor</td>
			<td>Steinbeis Transfer Center</td>
			<td>none</td>
			<td>designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of T&#252;bingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral domain OCT</td>
			<td>Leica</td>
			<td>R4310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution</td>
			<td>Santen</td>
			<td>Mydrin-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>midazolam</td>
			<td>Sandoz K.K.</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>components for the anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medetomidine&#160;</td>
			<td>Orion Corporation</td>
			<td>Domitor</td>
			<td>components for the anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>butorphanol tartrate&#160;</td>
			<td>Meiji Seika Pharma</td>
			<td>Vetorphale</td>
			<td>components for the anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 % purified sodium hyaluronate</td>
			<td>Santen</td>
			<td>Hyalein</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Zenoaq</td>
			<td>antisedan</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducement and evaluation of a murine model of experimental myopia

Modèle murin de la myopie peut être un outil puissant pour la recherche de la myopie à cause de la manipulation génétique relativement facile. Une façon d’inciter la myopie chez les animaux est de mettre clairement moins les verres devant les yeux pendant des semaines (induite par la lentille myope, LIM). Cependant, les protocoles existants d’incitation et d’évaluation varient d’un laboratoire à. Ici, nous avons décrit une méthode très pratique et reproductible pour induire des lunettes LIM chez la souris à l’aide nouvellement conçu. Les correctifs de méthode permet à la lentille stablement en face de l’oeil de la souris tout en la lentille à être enlevé pour le nettoyage ou topique drug administration. Le phénotype est robuste et efficace, et la variance est faible. La méthode décrite ici peut être appliquée à des souris juste après le sevrage qui prolonge la durée possible des expériences. Nous avons également donné technique conseille d’obtenir des résultats reproductibles en réfraction et mesure la longueur axiale. Nous espérons que le protocole étape par étape décrit ici et l’article détaillé peut aider les chercheurs à réaliser des expériences de myopie avec une myopie plus fluide et rendre les données comparables dans l’ensemble de laboratoires.

At a tout d’abord, vérifiez si toutes les pièces nécessaires sont préparés (Figure 1 a). Un exemple d’un morceau de lunettes assemblés est illustré dans la Figure 1 b. À l’exception de la partie principale des cadres et l’écrou, toutes les autres pièces sont jetables pour chaque souris. Un ensemble de lunettes dûment remplis est montré dans la Figure 1C. Changer l’angle entre le...

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Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia

Dans ce protocole, nous décrivons le processus complet de lunettes de vue myopie expérimentale chez la souris à l’aide de l’incitation nouvellement conçue et la technique nécessaire pour la réalisation des résultats stables et reproductibles dans la mesure des paramètres oculaire.

L’incitation et l’évaluation d’un modèle murin de la myopie expérimentale

Murine model of myopia can be a powerful tool for myopia research because of the comparatively easy genetic manipulation. One way to induce myopia in ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’incitation et l’évaluation de la myopie induite par la lentille chez la souris. Comme la façon de stabiliser les lentilles. La principale étape numéro un de cette technique est que toutes les étapes ont été optimisées et normalisées permettant l’acquisition de résultats précis, reproductibles et comparables entre les laboratoires.Généralement, les gens nouveaux à cette méthode est la lutte car il est très difficile de coller les lunettes sur les têtes de souris stably sans aucune pratique. Pour chaque souris, préparez ce qui suit. Un bâton de nylon monté sur la tête.Un cadre en titane plus haut et un cadre inférieur en titane. Deux lentilles avec les pouvoirs appropriés selon le but de l’expérience. Une vis de taille M1.4 de longueur de 10 mm.Un écrou pour la vis de taille M1.4. 1 laveuse ordinaire pour la vis de taille M1.4 de 0,3 millimètre d’épaisseur. Et deux pointes artificielles d’ongles.Pour assembler le cadre droit des lunettes, disposez une pointe d’ongle pour faire face à la direction extérieure pour obtenir le meilleur effet protecteur. Et, ajustez l’angle entre la pointe de l’ongle et le cadre à environ 130 degrés pour éviter de masquer le champ de vision de la souris. À l’aide de l’adhésif cyanoacrylate, adhérez à la pointe artificielle de l’ongle vers le cadre et laissez l’adhésif sécher complètement pendant 12 heures.Utilisez des tondeuses à ongles pour couper la pointe de l’ongle entièrement adhéré à environ une forme d’un par un centimètre et placer la lentille sur le cadre. Injecter l’adhésif cyanoacrylate du bord de la lentille et laisser l’adhésif se propager par tension de surface. Lorsque l’adhésif est sec, serrer la vis dans le bâton de nylon avec la rondelle du côté plat du bâton.Ensuite, préparez le cadre gauche de la même manière avec le bout des doigts incliné dans la direction opposée de la pointe du cadre droit. Pour la mesure de base de la réfraction dans la longueur axiale, appliquez une goutte d’agent mydriatique, contenant cinq milligrammes par tropicamide millilitre et cinq milligrammes par hydrochlorure milliliter de phényléphrine de chaque côté du globe oculaire pour dilater la pupille. Attendez au moins cinq minutes avant l’anesthésie générale et ajustez la direction de l’un des yeux dans le viseur d’un réfractaire photo infrarouge pour positionner la première image purkinje au centre de la pupille et mesurer la réfraction le long de l’axe optique.Après avoir mesuré l’autre œil de la même manière, placez la souris dans le système de tomographie optique de cohérence du domaine spectral et définissez la longueur axiaale comme la distance entre le vortex cornéen et la limite la plus brillante près du nerf optique. Pour fixer le cadre de lunettes précédemment préparé sur la souris, appliquez d’abord une goutte de 0,1 % de goutte d’oeil hyaluronate de sodium purifiée à chaque œil et placez le menton de la souris anesthésiée sur une surface inclinée de sorte que le plan initial du crâne soit horizontal. Utilisez un coton-tige trempé avec 70% d’éthanol pour stériliser les cheveux et le cuir chevelu, entre les oreilles et les yeux, et faire une incision de 0,8 cm carré dans la peau, entre les oreilles et les yeux, pour exposer le crâne.Utilisez du liquide de gravure dentaire dans un coton-tige pour enlever le périoste et utilisez une paire de cadres sans lentilles pour aider à fixer le bâton sur la bonne position, en ajustant soigneusement la position des cadres pour s’assurer que les deux yeux sont au milieu des cadres vides. Utilisez un système d’adhésif dentaire auto-soin pour fixer le bâton sur la tête de la souris et attendre environ cinq minutes avant d’enlever soigneusement le cadre et l’écrou sans changer la position du bâton. Injectez ensuite 0,75 milligramme par kilogramme d’hydrochlorure d’atipamazole intraperitoneally pour aider la souris à se remettre de l’anesthésie plus rapidement et placer la souris dans une cage individuelle jusqu’à ce qu’elle soit complètement récupérée.24 heures après la chirurgie, saisir le bâton et placer les cadres avec des lentilles sur l’animal pour initier l’induction de myopie. Ensuite, placez un filet entre la souris et le fond de la cage pour filtrer les restes de nourriture et surveiller le poids corporel et le comportement brut quotidiennement, en comparant les souris myopes avec les mêmes souris âgées et intactes pendant tout le processus expérimental. Retirez le cadre et nettoyez les lentilles et la pointe des ongles avec des cotons-tiges au moins deux fois par semaine pour maintenir la transparence des lentilles.Ici, un ensemble de lunettes complètes est montré. L’angle entre les deux cadres peut être ajusté pour s’adapter aux souris d’âges différents. Après avoir placé les lunettes sur le cadre comme démontré, les deux morceaux de lunettes doivent être assez symétriques.Pour cette mesure de réfraction dans un œil de souris induite par un objectif négatif de 30 dioptres pendant trois semaines, à partir du jour postnatal 21, le regard a été contrôlé à près de zéro degré dans l’axe x et y, ce qui indique que la souris voyait juste en face de la caméra. Toute cette image oculaire, prise par un système spectral de tomographie optique de cohérence de domaine, accordée pour les souris, permet de définir chaque partie de l’œil. Dans cette expérience représentative, les lentilles négatives de 30 dioptres ont induit un changement myope fort dans les mesures de réfraction et de longueur axiaale, comparées aux lentilles de dioptre zéro.Le changement dans la réfraction a culminé dans la première semaine et est resté plat pendant les deux semaines suivantes, alors que la différence entre le changement de l’oeil myope et les longueurs axials d’oeil de contrôle était significative de la première semaine et est devenue plus grande et plus grande dans les deux semaines suivantes. Tout en essayant la procédure, il est important de se rappeler de suivre de près les instructions pour mesurer la réfraction et la lentille axiaale, pour permettre au résultat d’être comparable dans les laboratoires expérimentaux. Après son développement, la technique ouvre la voie à des chercheurs dans le domaine de la myopie pour explorer le mécanisme pathogène chez, non seulement les souris ordinaires, mais aussi les souris génétiquement modifiées.

Research

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