Name: inducement and evaluation of a murine model of experimental myopia
Uploaded: 2019-01-22T14:30:00
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Ringraziamo M.T. Pardue per consigli su SDOCT, F. Schaeffel per consigli sulle misure di rifrazione e della curvatura corneale, il signor Sanshouo per ricreare i dati della struttura tridimensionale, Miyauchi M.; K. Tsubota; Y. Tanaka; S. Kondo; C. Shoda; M. Ibuki; Y. Miwa; Y. Hagiwara; R. Ishida; Y. Tomita; Y. Katada; E. Yotsukura; K. Takahashi; e Y. Wang per discussioni critiche. Questo lavoro è stato supportato da inAid di sovvenzioni per la ricerca scientifica (KAKENHI, numero 15K 10881) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT) di TK. Questo lavoro è anche supportato dalla concessione per la ricerca di miopia da laboratorio Tsubota, Inc (Tokyo Giappone).

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico sulla ricerca animale della scuola di medicina dell'Università di Keio aderito all'ARVO istruzione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research, le linee guida istituzionali sulla sperimentazione animale presso Keio Università e la ricerca di animale: Reporting di In Vivo esperimenti (arrivo) linee guida per l'uso di animali nella ricerca.
1. montaggio degli occhiali per topi
<ol><li>Preparare le parti necessarie per il m...

<ol>
	<li>Dolgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myopia+boom.">The myopia boom.</a> Nature. 519 (7543), 276-278 (2015).</li><li>Ohno-Matsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathologic+Myopia.">Pathologic Myopia.</a> Asia-Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia, Pa). 5 (6), 415-423 (2016).</li><li>Morgan, I. G., Ashby, R. S., Nickla, D. 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C., Williams, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+refractive+state+and+deprivation+myopia+in+two+strains+of+mice.">Measurement of refractive state and deprivation myopia in two strains of mice.</a> Optometry and Vision Science. 81 (2), 99-110 (2004).</li><li>Tkatchenko, T. V., Shen, Y., Tkatchenko, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+experimental+myopia+has+features+of+primate+myopia.">Mouse experimental myopia has features of primate myopia.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51 (3), 1297-1303 (2010).</li><li>Faulkner, A. E., Kim, M. K., Iuvone, P. M., Pardue, M. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goggles+for+controlling+the+visual+environment+of+small+animals.">Goggles for controlling the visual environment of small animals.</a> Laboratory Animal Science. 44 (3), 292-294 (1994).</li><li>Tkatchenko, T. V., Tkatchenko, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine-xylazine+anesthesia+causes+hyperopic+refractive+shift+in+mice.">Ketamine-xylazine anesthesia causes hyperopic refractive shift in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 67-71 (2010).</li><li>Chou, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+elongation+of+eye+size+in+DBA/2J+mice+compared+with+C57BL/6J+mice:+in+vivo+analysis+with+whole-eye+OCT.">Postnatal elongation of eye size in DBA/2J mice compared with C57BL/6J mice: in vivo analysis with whole-eye OCT.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52 (6), 3604-3612 (2011).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+axial+length+measurements+in+mouse+eyes.">Assessment of axial length measurements in mouse eyes.</a> Optometry and Vision Science. 89 (3), 296-303 (2012).</li></ol>

Per assicurarsi che gli occhiali per essere fissato stabilmente sulla testa del mouse, alcuni passaggi in questo protocollo devono essere prestato grande attenzione. Il periostio deve essere rimosso completamente prima di utilizzare il sistema adesivo dentale. Il sangue sul cranio anche bisogno di essere ripulito con cura. Mentre una regolazione fine poco è accettabile subito dopo l'applicazione dell'adesivo, non muovere lo stick frequentemente prima che il sistema adesivo asciugare. Seguire le istruzioni del sistema ad...

La prevalenza della miopia è aumentato drammaticamente recentemente, mentre il meccanismo di insorgenza e progressione sono ancora in gran parte sconosciuto1. Il fenotipo più caratteristico della miopia è l'allungamento della lunghezza assiale (AL), che aumenta il rischio per le complicazioni retiniche o persino cecità2. Per meglio comprendere la patogenesi della miopia e sviluppare trattamenti efficaci, modelli animali miope robusti e stabile fenotipo valutazione sono necessari.
In breve, esistono due metodi per indurre stati miopi negli animali: miopia forma-privazione (FDM) e miopia indotta da lente (LIM)3. L'ex posti diffusori davanti all'occhio o la palpebra per oscurare l'immagine, che influenza lo sviluppo normale del bulbo oculare, risultante in un fenotipo di miopia di suture. I posti quest'ultimi meno lenti davanti all'occhio per spostare il punto focale dietro la retina. La retina rileva lo spostamento della messa a fuoco e si allunga il bulbo oculare per riallineare la retina ed il punto focale. Per FDM, dopo che la palpebra è chiusa o il diffusore è stato fissato davanti all'occhio, quasi alcuna manutenzione non è necessaria. Per LIM, la lente deve essere tolto per la pulizia al fine di mantenerlo trasparente. Così, FDM è relativamente facile da essere indotto tecnicamente. Tuttavia, i meccanismi della FDM e LIM sono diversi, e quale metodo imita la miopia in umani meglio è ancora in discussione3. Uno dei punti di forza della LIM è il fenotipo più forte rispetto a FDM, almeno nel caso di topi4.
Gli animali che sono stati utilizzati per l'induzione della miopia includono pulcini5scimmie6, toporagni albero7, cavie8e topi4. Considerando la possibilità di manipolazione genetica, anticorpi disponibili abbondanti e low cost per allevamento, topi avrebbe potuto essere la prima scelta come modello animale di miopia. Tuttavia, rispetto agli altri animali più grandi, fissaggio lenti o diffusori davanti all'occhio del mouse è relativamente difficile soprattutto per giovani topi come diritto dopo lo svezzamento. Per gli esperimenti che hanno bisogno di farmaci topici o misurazioni multiple occhio ad interim, è anche necessario per il telaio di essere removibile. Un'altra sfida è il piccolo cambiamento morfologico del bulbo oculare del mouse, che ha bisogno di sofisticate tecniche e dispositivi per valutare. Ad oggi, diversi che inducono e protocolli utilizzati in vari gruppi di ricerca di misura lo rendono difficile da confrontare e ripetere i risultati attraverso laboratori. È necessario un protocollo standard con dettagli.
Precedenti lavori descrivono più metodi per correggere le lenti o diffusori davanti all'occhio del mouse, ad esempio di incollaggio9, impunture10 e goggle testa-montata telaio11,12. Abbiamo combinato le exist testa-montata goggle technics11,12,13 con il nostro telaio di nuova concezione per sviluppare un protocollo migliorato per l'induzione robusto ed efficiente miopia sperimentale nei topi. Il protocollo può essere applicato ai giovani topi presto dopo lo svezzamento al giorno postnatale 21 (p21). Abbiamo inoltre ottimizzato i processi per stabile e precisa valutazione dei fenotipi compreso la rifrazione e AL. Speriamo che questo protocollo standardizzato può contribuire a rendere miopi topi un modello più facilmente accessibile per la ricerca di miopia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>screw</td>
			<td>NBK</td>
			<td>SNZS-M1.4-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>washer</td>
			<td>MonotaRO</td>
			<td>42166397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nut</td>
			<td>MonotaRO</td>
			<td>42214243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stick</td>
			<td>DMM Make</td>
			<td>none</td>
			<td>designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frame</td>
			<td>DMM Make</td>
			<td>none</td>
			<td>designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenses</td>
			<td>RAINBOW CONTACT LENS</td>
			<td>none</td>
			<td>customized for mice use by the company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
			<td>OK MODEL</td>
			<td>MP 20g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dental adhesive resin cement</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>super bond</td>
			<td>contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infrared photorefractor</td>
			<td>Steinbeis Transfer Center</td>
			<td>none</td>
			<td>designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of T&#252;bingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral domain OCT</td>
			<td>Leica</td>
			<td>R4310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution</td>
			<td>Santen</td>
			<td>Mydrin-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>midazolam</td>
			<td>Sandoz K.K.</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>components for the anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medetomidine&#160;</td>
			<td>Orion Corporation</td>
			<td>Domitor</td>
			<td>components for the anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>butorphanol tartrate&#160;</td>
			<td>Meiji Seika Pharma</td>
			<td>Vetorphale</td>
			<td>components for the anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 % purified sodium hyaluronate</td>
			<td>Santen</td>
			<td>Hyalein</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Zenoaq</td>
			<td>antisedan</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducement and evaluation of a murine model of experimental myopia

Modello murino della miopia può essere un potente strumento per la ricerca di miopia a causa della manipolazione genetica relativamente facile. Un modo per indurre la miopia negli animali è di mettere chiaro meno lenti davanti gli occhi per settimane (miopia indotta da lente, LIM). Tuttavia, ancora esistenti protocolli di incitamento e di valutazione variano da laboratorio a laboratorio. Qui, abbiamo descritto un metodo altamente pratico e riproducibile per indurre gli occhiali LIM in topi facendo uso di nuova concepito. Le correzioni di metodo la lente stabilmente davanti all'occhio del mouse mentre consente l'obiettivo di essere tolto per la pulizia o d'attualità droga amministrazione. Il fenotipo è robusto ed efficiente, e la varianza è piccola. Il metodo qui descritto può essere applicato ai topi subito dopo lo svezzamento che estende la durata possibile per esperimenti. Abbiamo anche dato tecnico fornisce consulenza per il raggiungimento di risultati riproducibili in rifrazione e misurazioni di lunghezza assiale. Ci auguriamo che il protocollo passo dopo passo descritto qui e l'articolo dettagliato può aiutare i ricercatori a eseguire esperimenti di miopia con miopia più scorrevole e rendere i dati comparabili attraverso laboratori.

Al momento del check in primo luogo, se tutte le parti necessarie sono preparate (Figura 1a). Un esempio di un pezzo di eyeglasses assemblato è mostrato in Figura 1b. Fatta eccezione per il corpo principale dei telai e il dado, tutte le altre parti sono USA e gettare per ogni mouse. Un insieme degli occhiali completati è illustrato nella Figura 1 c. Modificare l'angolo tra i due telai per adattare ...

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Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia

In questo protocollo, si descrive il processo completo di occhiali di incentivo in topi facendo uso di nuova concepito sperimentale miopia e la tecnica necessaria per il raggiungimento di risultati stabili e riproducibili in misure di parametri oculari.

Incentivo e la valutazione di un modello murino di miopia sperimentale

Murine model of myopia can be a powerful tool for myopia research because of the comparatively easy genetic manipulation. One way to induce myopia in ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave sull'induzione e la valutazione della miopia indotta dalle lenti nei topi. Come come stabilizzare le lenti. La fase principale numero uno di questa tecnica è che tutti i passaggi sono stati ottimizzati e standardizzati consentendo l'acquisizione di risultati precisi, riproducibili e comparabili tra i laboratori.Generalmente, le persone nuove a questo metodo sono difficili poiché è molto difficile incollare gli occhiali sulle teste del mouse in modo stabile senza alcuna pratica. Per ogni mouse, preparare quanto segue. Un bastoncino di nylon montato sulla testa.Un telaio in titanio più alto e uno inferiore. Due lenti con i poteri appropriati secondo lo scopo dell'esperimento. Una vite di dimensioni M1.4 di lunghezza 10 mm.Un dado per la vite di dimensioni M1.4. 1 rondella semplice per la vite di dimensioni M1.4 spessa 0,3 millimetri. E due punte artificiali dell'unghia.Per assemblare il telaio degli occhiali giusti, disporre una punta dell'unghia per affrontare la direzione esterna per ottenere il miglior effetto protettivo. Quindi, regola l'angolo tra la punta dell'unghia e il telaio a circa 130 gradi per evitare di mascherare il campo della vista del mouse. Utilizzando l'adesivo cianoacrilato, aderire alla punta artificiale dell'unghia al telaio e lasciare asciugare completamente l'adesivo per 12 ore.Utilizzare i tagliaunghie per tagliare la punta dell'unghia completamente aderendo a circa una forma di uno per un centimetro e posizionare l'obiettivo sul telaio. Iniettare l'adesivo cianoacrilato dal bordo dell'obiettivo e lasciare che l'adesivo si diffonda dalla tensione superficiale. Quando l'adesivo è asciutto, stringere la vite nel bastone di nylon insieme alla lavatrice dal lato piatto del bastone.Quindi preparare il telaio sinistro nello stesso modo con la punta delle dita angolata nella direzione opposta della punta del telaio destro. Per la misurazione basale della rifrazione nella lunghezza assiale, applicare una goccia di agente midritico, contenente cinque milligrammi per millilitro tropicamide e cinque milligrammi per millilitro fenilefrina cloridrato su ciascun lato del bulbo oculare per dilatare la pupilla. Attendere almeno cinque minuti prima dell'anestesia generale e regolare la direzione di uno degli occhi all'interno del mirino di un rifrattore fotografico a infrarossi per posizionare la prima immagine purkinje al centro della pupilla e misurare la rifrazione lungo l'asse ottico.Dopo aver misurato l'altro occhio nello stesso modo, posizionare il mouse nel sistema di tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale e definire la lunghezza assiale come la distanza dal vortice corneale al limite più luminoso vicino al nervo ottico. Per fissare il telaio della maschera precedentemente preparato sul mouse, applicare prima una goccia di goccia di ialuronato di sodio purificato allo 0,1% su ogni occhio e posizionare il mento del mouse anestetizzato su una superficie inclinata in modo che il piano iniziale del cranio sia orizzontale. Utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di 70%etanolo per sterilizzare i capelli e il cuoio capelluto, tra le orecchie e gli occhi, e fare un'incisione di 0,8 cm quadrati nella pelle, tra le orecchie e gli occhi, per esporre il cranio.Utilizzare il liquido di incisione dentale in un batuffolo di cotone per rimuovere il periostio e utilizzare un paio di montature senza lenti per aiutare a fissare il bastone nella posizione giusta, regolando attentamente la posizione dei telai per assicurarsi che entrambi gli occhi si trovano al centro delle cornici vuote. Utilizzare un sistema adesivo dentale auto-cura per attaccare il bastone sulla testa del mouse e attendere circa cinque minuti prima di rimuovere attentamente il telaio e il dado senza cambiare la posizione del bastone. Quindi iniettare 0,75 milligrammi per chilogrammo di atipamazolo cloridrato per via intraperitoneale per aiutare il topo a riprendersi dall'anestesia più rapidamente e posizionare il mouse in una gabbia individuale fino a completo recupero.24 ore dopo l'intervento chirurgico, afferrare il bastone e posizionare le montature con lenti sull'animale per avviare l'induzione della miopia. Quindi posizionare una rete tra il topo e il fondo della gabbia per filtrare gli scarti alimentari e monitorare quotidianamente il peso corporeo e il comportamento lordo, confrontando i topi miopi con gli stessi topi invecchiati e incontaminati durante l'intero processo sperimentale. Rimuovere il telaio e pulire le lenti e la punta dell'unghia con tamponi di cotone almeno due volte a settimana per mantenere la trasparenza delle lenti.Qui viene mostrato un set di occhiali completati. L'angolo tra i due fotogrammi può essere regolato per adattarsi a topi di età diverse. Dopo aver posizionato gli occhiali sul telaio come dimostrato, i due pezzi di occhiali dovrebbero essere abbastanza simmetrici.Per questa misurazione della rifrazione in un occhio di topo indotta da un obiettivo a 30 diottrie negative per tre settimane, a partire dal giorno post-natale 21, lo sguardo è stato controllato vicino a zero gradi sia nell'asse x che in quello y, indicando che il mouse stava vedendo proprio di fronte alla fotocamera. Tutta questa immagine oculare, scattata da un sistema di tomografia a coerenza ottica a dominio spettrale, sintonizzata per i topi, consente di definire ogni parte dell'occhio. In questo esperimento rappresentativo, le lenti a 30 diottrie negative hanno indotto un forte spostamento miopico sia nelle misure di rifrazione che di lunghezza assiale, rispetto alle lenti a diottrie zero.Il cambiamento nella rifrazione raggiunse il picco nella prima settimana e rimase piatto per le due settimane successive, mentre la differenza tra il cambiamento dell'occhio miope e le lunghezze assiali degli occhi di controllo fu significativa dalla prima settimana e divenne sempre più grande nelle due settimane successive. Durante il tentativo della procedura, è importante ricordare di seguire da vicino le istruzioni per misurare la rifrazione e la lente assiale, per consentire al risultato di essere comparabile tra i laboratori sperimentali. Dopo il suo sviluppo la tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della miopia per esplorare il meccanismo patogeno in, non solo topi ordinari, ma anche topi geneticamente modificati.

Research

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Neuroscience

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