Name: inducement and evaluation of a murine model of experimental myopia
Uploaded: 2019-01-22T14:30:00
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Agradecemos a M.T. Pardue para obtener consejos sobre lo SDOCT, F. Schaeffel para asesoramiento sobre medidas de refracción y curvatura corneal, el Sr. Sanshouo para recrear los datos de estructura tridimensional, Miyauchi M.; K. Tsubota; Y. Tanaka; S. Kondo; C. Shoda; M. Ibuki; Y. Miwa; Y. Hagiwara; A. Ishida; Y. Tomita; Y. Katada; E. Yotsukura; K. Takahashi; y Y. Wang para los debates críticos. Este trabajo fue apoyado por inAid subvenciones para la investigación científica (KAKENHI, número 15K 10881) del Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (MEXT) a los CC.TT. Este trabajo también es apoyado por la beca de investigación de la miopía de laboratorio Tsubota, Inc. (Tokio).

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética en investigación Animal de la Facultad de medicina de la Universidad de Keio se adhirió a la declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica y la investigación de visión, las directrices institucionales sobre animales de experimentación en Keio Universidad y la investigación Animal: informes de en Vivo experimentos (llegar) directrices para el uso de animales en investigación.
1. montaje de los anteojos para rat...

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goggles+for+controlling+the+visual+environment+of+small+animals.">Goggles for controlling the visual environment of small animals.</a> Laboratory Animal Science. 44 (3), 292-294 (1994).</li><li>Tkatchenko, T. V., Tkatchenko, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine-xylazine+anesthesia+causes+hyperopic+refractive+shift+in+mice.">Ketamine-xylazine anesthesia causes hyperopic refractive shift in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 67-71 (2010).</li><li>Chou, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+elongation+of+eye+size+in+DBA/2J+mice+compared+with+C57BL/6J+mice:+in+vivo+analysis+with+whole-eye+OCT.">Postnatal elongation of eye size in DBA/2J mice compared with C57BL/6J mice: in vivo analysis with whole-eye OCT.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52 (6), 3604-3612 (2011).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+axial+length+measurements+in+mouse+eyes.">Assessment of axial length measurements in mouse eyes.</a> Optometry and Vision Science. 89 (3), 296-303 (2012).</li></ol>

Para asegurarse de que las gafas de fijación estable de la cabeza de ratón, varios pasos en este protocolo deben prestarse gran atención. El periostio debe eliminarse completamente antes de usar el sistema adhesivo dental. La sangre en el cráneo también deben limpiarse con cuidado. Mientras que una pequeña puesta a punto es aceptable después de la aplicación del adhesivo, no mueva el palo con frecuencia ante el sistema de adhesivo seco para arriba. Siga las instrucciones del sistema adhesivo cuidadosamente, espec...

La prevalencia de la miopía ha aumentado drásticamente recientemente, mientras que el mecanismo de su aparición y la progresión son todavía en gran parte desconocido1. El fenotipo más característico de la miopía es el alargamiento de la longitud axial (AL), que aumenta el riesgo de complicaciones retinianas o incluso ceguera2. Para mejor comprender la patogénesis de la miopía y desarrollar tratamientos eficaces, robustos modelos animales miopes y evaluación del fenotipo estable son necesarios.
Brevemente, existen dos métodos para inducir estados miopes en animales: forma privación miopía (FDM) y miopía inducida por la lente (LIM)3. El primero coloca difusores delante de los ojos o suturas de los párpados para ocultar la imagen, que influye en el desarrollo normal del globo ocular, resultando en un fenotipo de miopía. Los últimos lugares menos lentes delante del ojo para mover el punto focal detrás de la retina. La retina detecta el cambio del foco y alarga el globo ocular para realinear la retina y el punto focal. FDM, después de que el párpado se cierra o se ha solucionado el difusor delante del ojo, casi ningún tipo de mantenimiento adicional es necesario. Para LIM, el objetivo debe quitarse para la limpieza para mantener transparente. Así, es relativamente fácil inducir técnicamente FDM. Sin embargo, los mecanismos de la FDM y LIM son diferentes, y el mejor método que imita la miopía en humanos sigue siendo objeto de debate3. Uno de los puntos fuertes de LIM es el fenotipo más fuerte en comparación con FDM, por lo menos en el caso de ratones4.
Animales que se han utilizado para inducir la miopía incluyen pollos5, monos6, las musarañas de árbol7, conejillos de Indias8y ratones4. Teniendo en cuenta la posibilidad de manipulación genética, abundantes anticuerpos disponibles y bajo costo para la cría de ratones podrían haber sido la primera opción como el modelo animal de la miopía. Sin embargo, en comparación con otros animales más grandes, fijación de lentes o difusores delante de los ojos de ratón es relativamente difícil especialmente para los jóvenes ratones como derecho después del destete. Para los experimentos que necesitan la administración de medicamentos tópicos o múltiples medidas provisionales ojo, también es necesario para el marco a ser extraíble. Otro reto es el cambio morfológico pequeño del globo del ojo de ratón, que requiere sofisticadas técnicas y dispositivos para evaluar. Hasta la fecha, induciendo diferentes y protocolos utilizados en equipos de investigación diferentes de medición hacen difícil comparar y repetir los resultados a través de laboratorios. Es necesario un protocolo estándar con detalles.
Trabajos anteriores describen varios métodos para fijar lentes o difusores delante del ojo de ratón, como pegar9, costura10 y montado en la cabeza los anteojos marco11,12. Combinamos gafas montado en la cabeza existen técnicas11,12,13 con nuestro marco de nuevo diseño para el desarrollo de un protocolo ameliorated para inducir miopía experimental robusta y eficaz en ratones. El protocolo se puede aplicar a ratones jóvenes pronto después del destete en el día postnatal 21 (p21). También hemos optimizado los procesos para la evaluación precisa y estable de fenotipos como la refracción y AL. Esperamos que este protocolo estandarizado puede ayudar a hacer ratones miopes un modelo más accesible para la investigación de la miopía.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>screw</td>
			<td>NBK</td>
			<td>SNZS-M1.4-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>washer</td>
			<td>MonotaRO</td>
			<td>42166397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nut</td>
			<td>MonotaRO</td>
			<td>42214243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stick</td>
			<td>DMM Make</td>
			<td>none</td>
			<td>designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frame</td>
			<td>DMM Make</td>
			<td>none</td>
			<td>designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenses</td>
			<td>RAINBOW CONTACT LENS</td>
			<td>none</td>
			<td>customized for mice use by the company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
			<td>OK MODEL</td>
			<td>MP 20g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dental adhesive resin cement</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>super bond</td>
			<td>contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infrared photorefractor</td>
			<td>Steinbeis Transfer Center</td>
			<td>none</td>
			<td>designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of T&#252;bingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral domain OCT</td>
			<td>Leica</td>
			<td>R4310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution</td>
			<td>Santen</td>
			<td>Mydrin-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>midazolam</td>
			<td>Sandoz K.K.</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>components for the anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medetomidine&#160;</td>
			<td>Orion Corporation</td>
			<td>Domitor</td>
			<td>components for the anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>butorphanol tartrate&#160;</td>
			<td>Meiji Seika Pharma</td>
			<td>Vetorphale</td>
			<td>components for the anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 % purified sodium hyaluronate</td>
			<td>Santen</td>
			<td>Hyalein</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Zenoaq</td>
			<td>antisedan</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducement and evaluation of a murine model of experimental myopia

Modelo murino de la miopía puede ser una poderosa herramienta para la investigación de la miopía debido a la relativamente fácil manipulación genética. Una forma de inducir miopía en animales es poner claro menos lentes al frente de los ojos durante semanas (inducida por la lente de miopía, LIM). Sin embargo, han conservado protocolos de inducción y evaluación varían de laboratorio a laboratorio. Aquí, describimos un método muy práctico y reproducible para inducir anteojos LIM en ratones con nuevo diseñada. Las correcciones del método el objetivo estable frente a los ojos de ratón mientras que permite la lente a quitarse para la limpieza o tópico drogas administración. El fenotipo es robusto y eficiente, y la varianza es pequeña. El método aquí descrito puede aplicarse a los ratones justo después del destete que extiende la duración posible para los experimentos. También dimos técnica aconseja para lograr resultados reproducibles en refracción y medición de longitud axial. Esperamos el protocolo paso a paso descrito aquí y el artículo detallado puede ayudar a los investigadores a realizar experimentos de miopía con miopía más suavemente y hacer los datos comparables entre laboratorios.

En primer lugar, compruebe si todas las piezas están preparadas (Figura 1a). En la Figura 1bse muestra un ejemplo de un pedazo de anteojos montados. Excepto el cuerpo principal de los marcos y la tuerca, todas las demás partes son desechables para cada ratón. Un conjunto de lentes completadas se muestra en la figura 1C. Cambiar el ángulo entre los dos bastidores para el ratón con diferentes edad...

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Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia

En este protocolo, describimos el proceso completo de gafas de inducción en ratones usando nuevo diseñada experimental de miopía y la técnica necesaria para el logro de resultados estables y reproducibles en las mediciones de parámetros oculares.

Aplicación y evaluación de un modelo murino de miopía Experimental

Murine model of myopia can be a powerful tool for myopia research because of the comparatively easy genetic manipulation. One way to induce myopia in ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la inducción y evaluación de la miopía inducida por lentes en ratones. Como cómo estabilizar las lentes. La etapa principal número uno de esta técnica es que todos los pasos han sido optimizados y estandarizados permitiendo la adquisición de resultados precisos, reproducibles y comparables en todos los laboratorios.Generalmente, las personas nuevas en este método es la lucha ya que es muy difícil pegar las gafas en las cabezas del ratón de forma estable sin ninguna práctica. Para cada ratón, prepare lo siguiente. Un palo de nylon montado en la cabeza.Un marco de titanio más alto y otro más bajo. Dos lentes con los poderes adecuados según el propósito del experimento. Un tornillo de 10 mm de longitud M1.4 tamaño.Una tuerca para el tornillo de tamaño M1.4. 1 arandela lisa para el tornillo de tamaño M1.4 de 0,3 milímetros de espesor. Y dos puntas de uñas artificiales.Para montar el marco de gafas derecha, coloque una punta de uñas para orientar hacia fuera para lograr el mejor efecto protector. Y, ajuste el ángulo entre la punta de la uña y el marco a unos 130 grados para evitar enmascarar el campo de visión del ratón. Usando adhesivo de cianoacrilato, adherir la punta de la uña artificial al marco y dejar que el adhesivo 12 horas se seque por completo.Utilice cortauñas para recortar la punta de la uña completamente adherida a una forma de uno por uno centímetro y coloque la lente en el marco. Inyecte el adhesivo de cianoacrilato desde el borde de la lente y deje que el adhesivo se propague por tensión superficial. Cuando el adhesivo esté seco, apriete el tornillo en el palillo de nylon junto con la arandela del lado plano de la varilla.A continuación, prepare el marco izquierdo de la misma manera con la yema del dedo en ángulo en la dirección opuesta de la punta del marco derecho. Para la medición de la línea de base de la refracción en la longitud axial, aplicar una gota de agente midrático, que contiene cinco miligramos por mililitro de trópicomida y cinco miligramos por mililitror de clorhidrato de fenilefrina en cada lado del globo ocular de la pupila dilatada. Espere al menos cinco minutos antes de la anestesia general y ajuste la dirección de uno de los ojos dentro del visor de un refractor de foto infrarrojo para colocar la primera imagen de Purkinje en el centro de la pupila y medir la refracción a lo largo del eje óptico.Después de medir el otro ojo de la misma manera, coloque el ratón en el sistema de tomografía de coherencia óptica del dominio espectral y defina la longitud axial como la distancia desde el vórtice corneal hasta el límite más brillante cerca del nervio óptico. Para fijar el marco de gafas previamente preparado en el ratón, primero aplique una gota de 0.1%purificado de gota de hialuronato de sodio a cada ojo y coloque la barbilla del ratón anestesiado en una superficie inclinada para que el plano inicial del cráneo sea horizontal. Usa un hisopo de algodón empapado con 70%etanol para esterilizar el cabello y el cuero cabelludo, entre las orejas y los ojos, y haz una incisión de 0,8 cm cuadrados en la piel, entre las orejas y los ojos, para exponer el cráneo.Utilice líquido de grabado dental en un hisopo de algodón para quitar el periosteo y utilice un par de marcos sin lentes para ayudar a fijar el palo en la posición correcta, ajustando cuidadosamente la posición de los marcos para asegurarse de que ambos ojos están en el medio de los marcos vacíos. Utilice un sistema adhesivo dental de cuidado personal para fijar el palo en la cabeza del ratón y espere unos cinco minutos antes de retirar cuidadosamente el marco y la tuerca sin cambiar la posición del palo. A continuación, inyectar 0,75 miligramos por kilogramo de clorhidrato de atipamazole intraperitonealmente para ayudar al ratón a recuperarse de la anestesia más rápidamente y colocar el ratón en una jaula individual hasta que se recupere por completo.24 horas después de la cirugía, agarre el palo y coloque los marcos con lentes sobre el animal para iniciar la inducción de la miopía. A continuación, coloque una red entre el ratón y el fondo de la jaula para filtrar los restos de alimentos y monitorear el peso corporal y el comportamiento bruto diariamente, comparando los ratones miopes con los mismos ratones envejecidos e intactos durante todo el proceso experimental. Retire el marco y limpie las lentes y la punta de las uñas con hisopos de algodón al menos dos veces a la semana para mantener la transparencia de las lentes.Aquí, se muestra un conjunto de anteojos completos. El ángulo entre los dos fotogramas se puede ajustar para adaptarse a ratones de diferentes edades. Después de colocar las gafas en el marco como se ha demostrado, las dos piezas de anteojos deben ser bastante simétricas.Para esta medición de refracción en un ojo de ratón inducido por una lente negativa de 30 dioptrías durante tres semanas, a partir del día postnatal 21, la mirada se controló cerca de cero grados tanto en el eje x como en y, lo que indica que el ratón estaba viendo justo delante de la cámara. Toda esta imagen ocular, tomada por un sistema de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral, sintonizada para ratones, permite definir cada parte del ojo. En este experimento representativo, 30 lentes negativas de dioptría indujeron un fuerte cambio miope tanto en las medidas de refracción como de longitud axial, en comparación con las lentes de dioptría cero.El cambio en la refracción alcanzó su punto máximo en la primera semana y se mantuvo plano durante las siguientes dos semanas, mientras que la diferencia entre el cambio de las longitudes axiales del ojo miope y el ojo de control fue significativa desde la primera semana y se hizo más grande y más grande en las siguientes dos semanas. Al intentar el procedimiento, es importante recordar seguir de cerca las instrucciones para medir la refracción y la lente axial, para permitir que el resultado sea comparable en todos los laboratorios experimentales. Después de su desarrollo, la técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la miopía exploren el mecanismo patógeno en ratones ordinarios, sino también ratones genéticamente modificados.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Experimental La desmielinización y remielinización de la Médula Espinal murino por inyección Focal de lisolecitina

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Investigación

Neurociencias

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