Name: use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00
Duration: 19 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

这项工作得到了 2.3.2-15-2001-00044 "pharmprot" 合作项目的部分支持, 并得到了匈牙利人的能力部高等教育机构卓越方案的资助。德布森大学生物技术专题项目。提交人感谢逆转录病毒生物化学实验室的成员在检测过程中提供的科学帮助, 并感谢他们在拍摄过程中的耐心 (特别是对 norbert k开发区, krisztina joónématúz 和 vanda toldi,出现在视频的背景中)。作者还要特别感谢 gedeon richter plc., 特别是 zoltán urbányi 博士允许 beáta bozóki 作为客座研究员在生物化学和分子生物学系的工作。提交人还要感谢德布森大学多媒体和电子学习技术中心的 györgy zsadányi、balázs tögyi、balázs pöstényi 和 zoltán király 在音频和视频方面提供的专业协助。生产。

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作者没有什么可透露的。

由于对蛋白水解酶进行了密集的工业和学术研究, 并不断需要相应快速且负担得起的与 hts 兼容的蛋白酶检测平台, 我们开发了一种基于磁珠的荧光蛋白酶测定。该检测方法是基于重组融合蛋白的使用, 可以是广泛使用的合成肽底物的新替代品。
在已发展的检测格式中, 融合蛋白底物被固定在镍螯合磁性琼脂糖珠的表面上。基板附件由 n 端提供他的核聚变蛋白的6个亲和标记, 直接融合到 mbp 标记中, 以方便折叠并提高基板13的水溶性.mbp 之后是 tev pr 的裂解位点和感兴趣的蛋白酶。前者可作为检测中的控制裂解位点, 而后者则可通过蛋白酶进行处理进行研究。裂解部位是可互换的;可将感兴趣的裂解位点的短 dsdna 序列编码插入表达质粒的柔性 "克隆盒" 中。重组融合蛋白在 c 端含有高度稳定的单体荧光蛋白标记, 从而能够检测到在蛋白溶解裂解释放的酶释放、荧光 c 端裂解产物的端点。图 1a)。在不同缓冲液中求解的纯化荧光完整基板也用于校准, 以评估基板和裂解产物的摩尔浓度。此外, 在荧光测定后, 也可以通过 sds-page 对检测成分进行分析。原生 (非变性) 和变性荧光蛋白都可以在凝胶中显示, 在电泳后或随后的凝胶再生后, 分别。这种额外的过程与传统的库马西明亮的蓝色污渍相结合, 可以有效地用于验证检测结果 (图 1b)。
检测过程包括简单、易于执行的低容量格式步骤, 这些步骤可以完全适应高通量自动环境。然而, 独立于手动或使用自动化系统进行检测, 检测的以下部分被认为是至关重要的, 在执行过程时需要特别注意。i)磁珠溶液的均匀性.在整个检测过程中, 无论是在净化还是清洗步骤中, 都必须使用均匀的磁珠溶液。特别是蛋白酶检测的可靠性在很大程度上取决于对附底磁珠 (samb) 库存溶液的正确引用。为了提高悬浮液和分散的有效性, 建议将珠子浓度设置在2% 至 10% (v/v) 之间。在样品制备过程中, 使用补充非离子洗涤剂 (如 triton x-100 或 tween 20) 的缓冲液, 最高可达 2%, 也可能会降低磁珠与塑料表面的粘附。如果将珠子悬浮液小心地涂在小瓶的底部, 而不是涂在样品管的壁上, 则可以避免珠子粘附在样品瓶的壁上。磁珠在酶反应过程中的均匀性也是至关重要的, 在孵育过程中, 磁珠以600转/分的速度连续晃动样品, 可以确保磁珠的均匀性。珠子被适当地分散在圆形或平底塑料制品中, 而不建议使用 v 底小瓶。图 4b中表示了由不正确的珠子均质引起的次优结果。ii) 反应样品的终止。 该方法的另一个优点是, 酶反应可以终止, 而不使用热变性处理或任何潜在的干扰化学剂15。通过使用传统的磁粉集中器, 只需将磁珠与反应混合物分离即可实现端接。当去除的反应缓冲液中含有活性酶和产生的 c 末端荧光裂解产物时, 未裂解的底物仍然附着在珠子上。由于反应缓冲液中存在活性酶, 因此需要仔细执行分离过程, 以进行可靠的端点检测。在将样品瓶放入集中器之前, 建议采用短旋转离心。将管材放入集中器后, 提供至少15秒的珠子收集。分离器的来回轻微移动可能有助于珠子的收集。请考虑, 在手动执行的分离过程中, 终止通常比开始反应需要更多的时间。因此, 如果需要将相同的孵育时间应用于所有样品, 则建议在启动之间延迟约2分钟。
所述蛋白溶解法的原理相对简单;然而, 该系统的多功能性是由灵活和稳定的基板结构保证。只有通过亲和性珠子与应用条件、试剂和添加剂的相容性, 才能限制检测的个别优化。根据制造商的协议, 我们还发现, 基板与 ni-nta 珠子表面的亲和力结合在 ph ≤6.515 时显著减弱。因此, 建议将基板空白样品与反应样品平行应用, 在评价结果时需要考虑基板的自发离解率。
在这种情况下, 由于使用了与珠子不兼容的成分或 ph 值较低, 无法进行磁珠基检测, 因此也可以应用纯化后的重组基板的溶液中消化。在这些情况下, 反应混合物可以通过电泳进行分析, 蛋白质可以根据所述协议在凝胶中可视化。为了研究蛋白质的蛋白质溶解活性, 溶液中的消化和凝胶检测的蛋白质也可能是荧光法的替代工具。设计的基板系统的一个新颖之处在于, 变性 sds-page 后应用凝胶内再生步骤。虽然原生 (非变性) 荧光蛋白在电泳过程中保留荧光, 但在变性时, 荧光性质被废除 (图 7b)。然而, 变性蛋白的荧光可以部分恢复从凝胶中去除 sds。因此, 使用变性条件分离反应成分, 不仅可以进行荧光鉴定, 而且可以识别基于分子量的分子量。与库莫西染色凝胶的分析相比, 荧光凝胶检测的另一个优点是, 根据荧光在凝胶中可以很容易地识别荧光蛋白 (见图 7)。如果在含有非荧光污染物或彼此分子量非常相似的蛋白质的样品中进行裂解反应, 这一点可能很重要。
使用类似设计的底物的蛋白酶检测已经在之前公布了 8,9, 10, 虽然这些情况下感兴趣的裂解位点也位于亲和力标签和荧光蛋白, 这里介绍的检测系统不仅重复了所描述的想法, 而且结合了以前平台的不同优势, 并完成了这些优点与进一步的改进: (i) 使用 mbp 融合合作伙伴, ii)存在一个 tev pr 控制裂解站点, iii) 使用新设计的单体 fp, 和 iv) 应用一个独特的基板校准程序。该检测本身特别设计用于以安全、时间和经济高效的方式进行酶特异性和动力学研究, 而无需昂贵的仪器。该方法旨在成为工业和学术研究目的的适当和负担得起的工具。由于表达质粒的 "克隆盒式" 的灵活性, 该系统可适用于快速、廉价的重组基板库生成。本文所描述的方法是一种可行的工具, 实现底物特异性, 酶诱变, 抑制研究, 也提供了一个替代工具, 执行酶动力学。该检测平台 (从细菌细胞破坏到动力学参数的确定) 可适应基于 hts 和自动化的环境, 并有可能应用于工业蛋白酶抑制剂筛选和/或抗病毒药物发展。此外, 竞争蛋白溶解检测的适应性也在我们实验室的未来范围内。在这种竞争分析中, 两个不同的子层--每个子层都包含与不同的 c 端荧光标记融合在一起的不同裂解部位--打算在同一裂解反应中同时使用, 以研究所研究的偏好给定目标序列的酶。此外, 在半胱氨酸蛋白酶的情况下, 使用一系列具有改良裂解位点序列的底物, 还在优化使用96孔板适应的检测表 (图 8) 进行突变筛选。

蛋白质水解酶属于最密集的研究酶组, 因为它们在代谢途径和工业应用中也很重要。它们在病毒性疾病、凝血调节、癌症、心血管和神经退行性疾病中的关键作用, 使蛋白酶成为药物发现领域的突出目标。因此, 对所关注的蛋白酶 (pr) 的底物特异性的详细表征和抑制剂分析至关重要, 最好是通过快速、经济高效和坚固的生化检测1,2来完成, (三)有什么问题吗？
目前, 绝大多数应用于药物发现领域的复合分析的体外蛋白酶检测都是均匀的、基于荧光肽的、高通量筛选 (hts) 兼容的平台4。此外, 标记肽不仅适用于图书馆筛选, 而且为确定选定基板上的酶动力学参数提供了很好的工具。在其他情况下, 在无法标记基板的情况下, 基于分离的检测可以提供一种可能的解决方案来评估蛋白溶解反应3的动力学特性。
一般来说, 体外蛋白酶检测是基于两种类型的底物的使用: 短肽或整个蛋白质。在这些情况下, 如果短肽序列的裂解充分反映了裂解特性, 则适用以下标准方法: (i) 检查标准蛋白质底物, 如氧化胰岛素 b 链, (ii) 测试市售的其他蛋白酶的底物, (iii) 筛选由组合化学产生的合成和荧光标记的肽文库, 或 (iv) 使用遗传方法, 例如生物显示技术 5, 6。除了传统的分类外, 还可以使用其他新的平台来生成底物 (例如, 蛋白质衍生肽文库的形成7或特殊的遗传方法亚型, 如重组融合)基于蛋白质的底物8,9,10,11,12)。
上述各种基板和检测方法都有其各自的优势和局限性, 目前仍需要开发结合和改进已知平台优势的检测格式。在这里, 我们描述了一种基于分离的荧光蛋白酶检测协议, 该协议利用重组底物。这些融合蛋白由他的6和 mbp 标记融合到一个控制裂解位点的 tev pr, 其次是与 c 末端荧光蛋白 (fp) 直接连接的基板感兴趣的序列 (图 1a)。在 "克隆盒" 中, 可以通过对表达质粒的单一结扎反应来克隆感兴趣的裂解位点的 dna 序列编码, 而此前, 质粒已经通过限制性内切酶进行了线性化。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> 图 1:荧光蛋白酶测定的原理.(a) 显示了人体免疫缺陷病毒1型 (hiv-1) 蛋白酶对荧光底物及其裂解的示意图。箭头表示 hiv-1 蛋白酶 (vsqny * pivq) 的基质/衣壳裂解位点序列内的裂解位置。(b) 如工作流程图所示, 荧光基板可用于分析基于 ni-nta 磁珠的分析和聚丙烯酰胺凝胶电泳的酶反应。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
尽管使用类似的重组蛋白亚层进行的蛋白质溶解检测--含有亲和性标签、蛋白溶解裂解位点和荧光蛋白--已经被描述为8,9,10, 该系统这里提出的打算整合和改进这些方法的优势。一个重要的区别是, 该检测平台中的融合蛋白底物配备 mbp, 以提高蛋白质溶解度13 , 并包含一个控制裂解位点的 tev prr。此外, 基板含有新一代荧光蛋白, 这些蛋白质具有高度稳定和单体形式, 以防止基板聚集。除了先前公布的 mTurquoise2 和 mTurquoise2 融合表14的应用外, 我们还展示了使用含有单分子增强黄色荧光蛋白 (m界定) 荧光标记的重组底物所给出的结果。在此, 我们证明了该系统与其他荧光蛋白的兼容性, 并代表了一些一般类型的结果, 可以通过蛋白酶检测获得。
重组融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3) 细胞中表达, 并以镍-硝基三乙酸 (ni-nta) 包覆磁琼脂-珠附着形式作为检测的底物。c 端裂解产物通过感兴趣的蛋白酶从珠子表面释放到上清液中。从磁珠中分离上清液 (含酶和裂解产物) 后, 可以测量荧光, 以确定酶的裂解特性。与前面描述的方法不同, 在这里介绍的系统中, 基板和 c 端裂解产品的数量是根据详细的基板校准过程进行唯一量化的。通过对检测样品的 sds-page 分析, 可以支持该检测系统;随后的荧光凝胶可视化可在电泳后或非变性荧光组分的凝胶再生后立即应用, 分别为 14。
"克隆盒式磁带" 的灵活性和结构允许在结构中插入各种序列的时间和经济高效的方式, 从而促进基板库的生成。由于所有的检测步骤都是自动和 hts 兼容的, 该系统可以特别吸引, 例如, 蛋白酶特异性测量和诱变研究, 也可以有效地用于工业蛋白酶抑制剂筛选和抗病毒药物的发展, 以及。
酶动力学参数 (k猫, km)可以通过所开发的基于分离的分析来确定;因此, 它可能适合进行单独的酶动力学测量, 如时间过程, 底物依赖, 和抑制研究。这证明重组融合蛋白底物为常用的合成寡肽底物提供了很好的替代品, 由于它们与多蛋白底物的高度相似性, 它们代表了自然发生的物质。更准确地进行酶-底物相互作用。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10K Amicon tubes</td>
			<td style="width:269px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC501096</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">M6250</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;">1610148</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">100063</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Agarose</td>
			<td style="width:269px;">SERVA</td>
			<td style="width:137px;">11404.04</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Alpha Imager HP gel documentation system</td>
			<td style="width:269px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A3678</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A9518</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">392185</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Black half-area plates</td>
			<td style="width:269px;">Greiner bio-One</td>
			<td style="width:137px;">675086</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">B0126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">CutSmart buffer (10x)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7204S</td>
			<td style="width:191px;">For plasmid linearization (step 1.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:269px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:137px;">DR-45M</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">M0303L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dynamag-2&#160;magnetic particle&#160;concentrator</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12321D</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Escherichia coli BL21(DE3) competent cells&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">C600003</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethanol</td>
			<td style="width:269px;">Merc-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">100983</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">798681</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7024S</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycerol</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">356350</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">G7126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">High-Speed Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:269px;">GeneAid</td>
			<td style="width:137px;">PD300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Imidazole</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">56750</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">AM9464</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Jouan CR 412 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Jouan</td>
			<td style="width:137px;">CR412</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Labinco LD-76 Rotator&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Labinco</td>
			<td style="width:137px;">7600</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L3022</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Lysozyme&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L6876</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:269px;">Scharlau</td>
			<td style="width:137px;">MA0036</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MERCK eurolab ultrasonic bath</td>
			<td style="width:269px;">MERCK</td>
			<td style="width:137px;">USR54H</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Millifuge Eppendorf spin centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">CT10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T9281</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NheI-HF restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R3131L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nickel(II) sulfate (NiSO4)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">656895</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ni-NTA magnetic agarose beads&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">36113</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">OS-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PacI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R0547L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PageBlue Protein Staining Solution&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">24620</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P7626</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Protein Lobind Micro-centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">22431102</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:269px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Snijders Press-to-Mix shaker&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Gemini</td>
			<td style="width:137px;">34524</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-acetate trihydrate</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S7670</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-chloride</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S9888</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S5881</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">S7563</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:269px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M180A</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Thermo shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">TS-100</td>
			<td style="width:191px;">with SC-24 accessory block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tris</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T1503</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tween 20</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P2287</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter</td>
			<td style="width:269px;">Wallac Oy, Turku, Finland</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation

蛋白酶由于其在生物的几种生物学途径和发病机制中的重要作用而被密集地研究酶;因此, 它们是重要的药物靶点。我们开发了一个基于磁性琼脂-珠的检测平台, 用于研究蛋白溶解活性, 该平台是基于重组融合蛋白底物的使用。为了证明该检测系统的使用, 本文以人体免疫缺陷病毒1型 (hiv-1) 蛋白酶为例, 提出了一个协议。所介绍的检测平台可有效地用于蛋白酶的生化表征, 包括诱变、动力学、抑制或特异性研究中的酶活性测量, 可适用于高通量底物筛选或可适应其他蛋白水解酶。
在此检测系统中, 应用底物中含有 n-末端六角蛋白 (他的 6) 和麦芽结合蛋白 (mbp) 标记、烟草蚀刻病毒 (tev) 和 hiv-1 蛋白酶的裂解位点以及 c-末端荧光蛋白。在大肠杆菌细胞中有效地生产基板, 并可使用镍 (ni)-螯合物涂层珠进行纯化。在测定过程中, 含珠基板的蛋白水解裂解会导致荧光裂解片段的释放, 这些碎片可以通过荧光法测量。此外, 可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page) 对裂解反应进行分析。还描述了一种检测成分的凝胶内再生方案, 因为荧光蛋白的部分再生使其能够基于分子量和荧光进行检测。

图 1a显示了具有代表性的荧光重组蛋白基板的示意图结构, 该基板可由 hiv-1 pr 在其特定的裂解位点序列中进行处理。图 1 b显示了基板的生产及其在蛋白酶检测中的可能应用, 包括 ni-nta 磁珠基检测和/或 page。
为了通过荧光法获得可靠的数据, 需要一个校准程序, 以确定荧光基板和裂解产品的数量。为此, 需要测量不同缓冲条件下不同基材的荧光强度值, 并与其在检测浓度范围内的浓度相关联 (图 3)。校准曲线的斜率值可用于确定检测样品中基板和裂解产物的数量。校准曲线的斜率独立于插入基板的裂解位点序列 (表 11), 有可能用于融合到同一类型荧光蛋白的一系列基板。显示了所有线性回归的放大图, 以扩大较低的浓度范围 (图 3)。需要注意的是, 需要仔细进行校准, 因为可靠的校准需要适当的数据点分布。因此, 应用了双重串行稀释来制备样品进行校准, 因为 r2 值表明只有在有足够数量的数据点的情况下, 荧光蛋白浓度和荧光浓度才有良好的相关性已被用来覆盖整个浓度范围。此外, 实验误差会极大地影响校准的准确性;因此, 对回归线进行图形评估也可能是必要的。
蛋白酶测定可以进行各种酶测量, 包括检查底物浓度对反应速度的影响 (图 4 a)。通过非线性回归, 数据可用于确定酶动力学参数 (例如, v最大值和km)。珠子悬浮液和分散体不足以及反应终止不当可能会导致次优结果 (图 4b), 这不适合计算可靠的酶动力学值。
产品形成与时间的依赖可以通过测定来确定 (图5a) (例如, 在裂解反应参数的优化过程中)。还可以研究抑制剂存在的酶活性 (图 5b), 以测定活性酶浓度和抑制常数。使用相同的方法, 其他抑制剂的效果也可以通过检测筛选。
蛋白酶分析在研究 ph 值对酶活性的影响时也很有用。图 6a以 tev pr 为例, 表示酶活性与 ph 值的依赖性, tev pr 具有较宽的最佳 ph 值范围 (ph 值 6-9)。如果研究酶活性的 ph 依赖性 (或需要测量具有酸性 ph 最佳值的酶), 则有必要考虑重组底物与珠子的亲和力结合可能会在略带酸性的 ph 值下受到限制。基板与珠子的分离升高 (图 6b) 可能会导致检测结果失真。为了考虑微珠的自发基板离解, 需要用 b 样品的测量值进行校正。
图 7显示, 非变性荧光蛋白可以根据其颜色在凝胶中进行区分, 使用蓝光透射 (图 7a)。如果有必要测定亚层裂解碎片的分子量, 也可以使用变性条件进行样品制备, 因为荧光蛋白可以在凝胶中部分再生, 并且可以通过紫外线照射检测(图 7b) 或由库马西染色 (图 7B)。如果对 r 样品进行分析, 则只有 c 端裂解产物可见 (图 7c), 而 n 端裂解碎片和未裂解的基板仍连接在珠子上。有时, 尽管使用非变性条件 (图 7c), 但蛋白质可能会部分变性 (图 7c), 而非变性蛋白更丰富, 也可在样本中检测到变性形式。这种现象并不影响蛋白溶解裂解的检测, 但需要考虑在定量密度测量的非变性样品的情况下。
虽然详细的描述只显示了基于 2 ml 管的检测, 但该检测方法可适用于96孔板基系统 (图 8), 该系统已在我们的实验室中成功测试 (未显示)。96孔板适应格式与荧光和电泳分析完全兼容, 所获得的数据也可以在本文所述方法的基础上进行评价。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> 图 3:校准曲线.以两个重组底物熔融到不同的 c 端荧光标记的重组底物为例, 证明了代表性的基板校准曲线: (a和b) 他的 6-mbp-vsqny * pivq-mturquoisois2 和 (c和 d) 他的6-mbp-vsqny * pivq-meyfp。放大图还显示了在 0-0.005 mm 基板浓度范围内数据点的线性回归。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> 图 4: 酶动力学参数的测定.亚基相关动力学测量是通过 hiv-1 pr 进行的 (最终活性浓度为 41.2 nm)。根据基板浓度绘制了初始速度值, 并进行了米基利斯-门滕非线性回归分析。误差线表示 sd (n = 2)。(a) 以他的6-mbp-vsqny * pivq-mapple 融合蛋白底物为例, 给出了一个具有代表性的最佳结果。(b) 他的 6-mbp-karvl * aeam-mturquoiseis2 基板也显示了一个典型的次优结果, 由于 samb 库存溶液的均质化不足, 在基板浓度的设置上存在问题, 而相对较高的误差是由不正确的反应终止引起的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> 图 5: 时间过程和抑制研究.(一)他的6-mbp-vsqny * pivq-meyfp 重组融合蛋白底物 (最终浓度为 0.326 mm) 由 hiv-1 pr (最终活性浓度为 41.2 nm) 切割, 并测定了荧光 pivq-meyfp 蛋白溶解片段的释放情况。执行时间过程分析。测量是在五个不同的时间点进行的。误差线表示 sd (n = 2)。(b) 他的 6-mbp-vsqny * pyvq-meyfp 被用作底物 (在 0.0015 mm), 以确定氨酸对 hiv-1 pr 活性的抑制作用 (总浓度为 163.8 nm)。通过绘制数据, 可以评估半最大抑制浓度 (ic50), 也可以根据抑制曲线计算应用 hiv-1 pr 的活性酶浓度 (最终活性浓度为 41.2 nm)。误差线表示 sd (n = 3)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> 图 6: 研究酶活性和自发底物离解对 ph 值的依赖性.(a) 他的6-mbp-vsqny * pyvq-mturquoise2 底物 (0.033 mm) 用于测量裂解缓冲液中的 tev pr 酶活性 (最终总浓度为 91.42 nm) 设置为不同的 ph 值, 范围为 6.5. 8.5。误差线表示 sd (n = 2)。绘制的数据已在14日公布。(b) 根据基板空白样品的相对荧光强度值, 利用裂解缓冲液研究了他的6-mbp-vsqny * pivq-mturquois-2 基板 (0.033 mm) 与磁珠的自发离解ph 值不同, 介于6.0-8.5 之间。绘制的数据已在14日公布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> 图 7: 用不同的方法检测凝胶中的蛋白质.(a) 采用 sds-page 后蓝光透射法, 对非变性样品制备后的未分离和 hiv-1 pr-1 消化融合蛋白底物进行了可视化。裂解反应是通过溶液中的消化进行的。(b) 在 page 之后, 只有非变性蛋白质可以通过紫外线照射在凝胶中检测到, 而在被删除 sds 后, 以前变性的荧光蛋白就会部分重新命名并检测到。本样品采用镍-nta 磁珠法的上清液制备。(c) 在凝胶再生后, 可用于蛋白质检测。凝胶中存在的 sds 可能会导致原生蛋白的部分变性, 但在原生样品中, 非变性形式更为丰富。本样品采用镍-nta 磁珠法的上清液制备。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> 图 8: 96 孔板的检测平台的适应.(a) 该检测不仅可以在2毫升管中进行, 也可以在96孔板的井中进行。在这里, 我们展示了应用的原理图表示的分析, 以研究一个虚构的蛋白酶的特异性, 使用一系列的荧光基板, 其中可能包含野生类型 (wt) 或突变 (突变-1 到突变-4) 裂解的站点序列。为了处理磁珠, 实验中将使用96英寸兼容的磁粉集中器 (mpc)。所有指定的卷都与一口井有关。为了比较不同基材的裂解效率, 可以根据反应样品的底带-空白修正 rfu 值的百分比来评估基板的转化率, 同时考虑到相关的底带空白修正 rfu 值。基板控制样品为100。 (b) 荧光测定后, 也可以通过 page 对测定样品的分离上清液进行分析, 在非变性和变性样品的情况下, 可直接或凝胶内重构后对荧光蛋白成分进行分析。准备工作。每个图还说明了三种不同的检测样品类型: c = 底物控制、b = 底物空白和 r = 反应。基板控制样品在洗脱缓冲液中, 基板空白和反应样品在裂解缓冲液中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>缓冲区</td>
			<td>荧光蛋白</td>
			<td>坡度的 cv% (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>洗 脱</td>
			<td rowspan="2">mturquoise2</td>
			<td>6.04</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>9.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>洗 脱</td>
			<td rowspan="2">mapple</td>
			<td>10.92</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>12.68</td>
		</tr>
</tbody></table>表 11: 基板校准曲线斜率的方差系数 (cv%) 值.为了测试重组蛋白基板的荧光是否依赖于插入的裂解部位, 校准由一系列的 mapploise2 和 mturquois-2 熔融基板进行 (每个基板有六个变种, 包含不同的裂解部位序列的 hiv-1 蛋白酶), 无论是在洗脱和裂解缓冲液。我们发现, 在所有情况下, 坡度的 cv% 值都低于 15, 这意味着可以使用单个基板校准来评估包含相同荧光标记的基板变种所执行的不同测量。

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Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

重组融合蛋白在荧光蛋白酶检测平台中的应用及其凝胶内再生

在这里, 我们提出了一个最近开发的蛋白酶分析平台的详细程序, 利用 n-端六利三烷基-马氏体结合蛋白和荧光蛋白融合重组基板附着在镍硝基三乙酸表面酸性磁性琼脂糖珠。并对十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的测定样品进行了凝胶分析。

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

蛋白酶是学术和工业研究中研究最多的生物分子支持组之一。它们在多个生理和病理过程中的强大作用也使他们成为药物发现领域的突出目标。在深入的研究方面，对开发省时、节省成本的高通量筛选相容荧光蛋白酶检测平台的需求巨大且持续。在这里，我们想介绍一个协议，使用mTurquoise2和mApple-熔融融合蛋白酶基板应用基于分离的高通量筛选兼容荧光测定平台。此外，我们还需要演示一种在变性SDS-PAGE后，对基材进行凝胶内再饱和的方法和测定样品的裂解片段。所有实验都是以HIV-1病毒蛋白酶为例进行的。该表达质粒携带六角沙和麦芽糖结合融合蛋白的编码序列，然后是烟草蚀刻病毒蛋白酶的控制性裂解位点、克隆盒和C-终端荧光蛋白。通过PacI和NheI限制内分导线性化表达式质粒。执行 Escherichia 大肠杆菌的退火优化正向和反向寡核苷酸质剂，编码为基底序列的兴趣和侧翼由 PacI 和 NheI 内聚端。通过结扎将退火线插入线性化表达质粒。对于蛋白质表达，通过结扎混合物转换BL21（DE3）能力细胞。荧光蛋白只有在成功结扎后，才能与N端子融合标签位于同一开放阅读框架中。转换几天后，包含表达质粒编码的分离站点感兴趣的菌落将显示可见的荧光，甚至不使用暗读器蓝色透光器。在50毫升离心管中加入10微升甘油的BL21（DE3）细胞，携带表达质粒编码的裂解位点序列，以5毫升LB介质，每毫升安培西林含有100微克。在37度下孵育悬浮液15小时，同时不断摇晃。将五毫升细菌培养转移到 50 毫升新鲜 LB 培养基，每毫升安西林含有 100 微克。在 600 纳米波长下，以 37 度将细胞长到 0.6 至 0.8 的吸收度。此时，通过添加IPTG来诱导蛋白质表达。此后，在37度下孵育培养三小时，同时持续摇晃。孵育后，将培养的25毫升转移到清洁的50毫升离心管中，通过离心收获细胞。丢弃上一液，将细菌细胞颗粒储存在零下70度至少一小时。含有成功表达的荧光蛋白的细胞颗粒清楚地显示荧光，甚至不使用暗读器蓝色透光剂。将冷冻细胞颗粒放在冰上，让它解冻15分钟。向颗粒中加入两毫升解液缓冲液并悬浮细胞。此后，加入蛋白酶抑制剂，释放利佐齐姆和DNase的悬浮液，悬浮细胞，并在冰上孵育悬浮液15分钟。将两次一毫升悬浮液转移到1.5毫升微离心管中，并在10秒的声波和5秒的断气中对悬浮液进行3分钟的声波化。在室温下以10，000克离心管20分钟。含有感兴趣的荧光基底的清除细菌细胞的结酸显示可见的荧光，甚至不使用深读器蓝色透光剂。开发蛋白酶测定的程序从制备测定样品开始。首先，用亲和磁珠孵育重组基板，形成基板附着的磁珠，简称为SAMB。SAMB 被洗涤了几次，最后 SAMB 库存溶液由创建测定样本的等分来准备。通过添加蛋白酶溶液初始化反应。在蛋白酶的裂解下，蛋白酶片段被释放到上经剂中。该反应通过将磁珠与含有荧光裂解产品和酶的反应缓冲液分离而终止。超钠剂应用于微刺激板的孔中，荧光由荧光测定。校准曲线使用每个测定缓冲液中解解的纯化荧光基板生成。C-端子荧光裂解产品以及测定样品中应用基板的浓度基于校准曲线的斜率确定。将含有新镍或回收镍-NPA磁性红糖珠的管放在磁性粒子浓缩器中。珠子可以粘在墙壁和/或微离心管的盖子上。因此，将集中器倒置到每个方向，以确保收集所有珠子。取出上一液并丢弃。向珠子中加入1.8毫升的解液缓冲液，然后从集中器上取出闭合管。通过摇晃和/或倒置管将磁珠悬浮在管中，直到磁珠完全均匀。将管子放回集中器中，并在每个方向上倒置，以确保收集所有珠子。打开管子并丢弃上一液。加入含有感兴趣的基质的清除细菌无菌赖于一，并从集中器上取出封闭的管。倒置管，直到珠子完全均匀，在室温下缓慢旋转管子30分钟。SAMB 显示可见的荧光，有甚至不使用暗读器蓝色透光器。将 SAMB 三次洗涤 1.8 毫升 1%Tween 20、洗涤缓冲液和裂解缓冲液。向洗涤的 SAMB 添加裂解缓冲区以创建 SAMB 库存解决方案。如果使用两毫升蛋白质低结合的微离心管，应用的裂解缓冲液的体积高达1.9毫升。添加缓冲液后，请勿将管子倒置摇晃或转动。关闭管子并将其从集中器上拆下。为测定样品准备两毫升低结合的微离心管。暂停 SAMB 库存溶液，直到它完全均匀，并立即将 SAMB 库存溶液转移到样品瓶中，测量反应中要分析的基板量。建议转移 SAMB 库存溶液的体积为 25 到 300 微升，但根据单独的实验设计进行设置。将含有等分 SAMB 悬架的样品管放入集中器中。小心地从 SAMB 上取下上一液并丢弃它。从集中器上拆下管子，并小心地将反应缓冲液添加到 SAMB 中。添加的反应缓冲液的体积将根据单独的实验设计进行计算，但如果使用两毫升管，建议将反应混合物的最终体积设置为 50 到 150 微升之间。合上管子的盖子。现在，这些示例已准备好进行初始化。将酶溶液添加到反应样品中。轻轻移动管子，将管子立即放入已经摇晃的热摇器中，小心地搅拌珠子。在基板空白样品和基板控制样品的情况下，分别添加裂解缓冲液和洗脱缓冲液。在孵化结束前30秒，从热化器中拿出样品，并迅速旋转。将管子放在集中器上，让管子站立 15 秒。通过稍微来回移动集中器，可以促进 SAMB 的收集。打开盖子，小心地将上一液转移到盘子或新管子中。请勿在移液器尖端触摸浓缩珠子。基板控制样品和具有高度裂解的反应样品的上流剂可能显示明显的荧光，甚至不使用深读器蓝色透光器。将分离的样品超钠的两次 30 微升转移到黑色半区微孔板中。根据应用的荧光蛋白，使用适当的过滤器用荧光计测量荧光。对于荧光基板的纯化，请准备与前面所述相同的溶液，并丢弃上流液。向 SAMB 中加入 400 到 600 微升洗脱缓冲液，并在室温下通过旋转器缓慢旋转管，5 分钟。将埃卢酸盐转移到新的蛋白质低结合微离心管中。它显示清晰可见的荧光与或不使用暗读器蓝色透光器。纯化、缓冲交换和蛋白质含量测量后，在至少八个步骤中准备双重序列稀释，分别从洗脱缓冲液和裂解缓冲液解基质溶液中，使用洗脱或裂解缓冲缓冲液进行稀释。将每个稀释点的 30 微升转移到黑色半区域微孔板中。使用在测定样品超钠的测量中应用的相同设置，用荧光计测量荧光。作为数据处理的一个例子，HIV-1蛋白酶的基质依赖动力学测量是在重组基质的mTurquoise2-熔融形式上进行的，该基质编码了基质和天然间隙蛋白前体的帽蛋白之间的裂解位点。根据纯化基材的摩尔浓度绘制校正的相对荧光强度值，求解裂解或洗脱缓冲液，并执行线性回归。使用基于裂解缓冲液的校准曲线的斜率计算反应样品中C-端子裂解产品的摩尔浓度。还要根据基板控制样品中洗脱基板的摩尔浓度，使用基于洗脱缓冲液的校准曲线的斜率，计算反应样品中应用的基板浓度。初始速度值是根据 C-终端裂解片段的数量计算的，然后根据应用的基板浓度绘制。此外，动力学参数由Michaelis-Menten非线性回归分析确定。在进行镍-NTA磁珠基测定后，也可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析测定超级钠。然而，除了分析检测样品，也可以分析纯化荧光基板和/或裂解片段后，在溶液消化。对于溶液内消化，将纯化荧光基板消化，溶解在裂解缓冲液中，放入1.5毫升微离心管中，并将酶溶液加入样品中。根据实验设计孵育样品，通过佩奇样品制备程序终止反应。对于非变性样品制备，将要分析的样品与不含还原剂的非变性样品加载缓冲液混合。在变性样品制备的情况下，将要分析的样品与变性样品加载缓冲液混合，将样品暴露在95度热处理10分钟。将非变性和变性样品放入 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的孔中，并进行电泳。从正在运行的模块上取下凝胶盒。非变性样品在凝胶中已经可见，即使肉眼或与暗读器蓝色透光剂。为了检测变性样品在转光器上的荧光成分，通过从凝胶中洗出SDS来执行凝胶内重新饱和。将100毫升蒸馏水加入凝胶中，至少冲洗30分钟。通过将未沾污的凝胶放在暗读器蓝色透光器上，可视化荧光蛋白。重组荧光融合蛋白被设计为在蛋白酶测定中用作基板。在特定裂解位点由蛋白酶分裂时，释放C-终端荧光裂解片段，并检测其荧光。它们用于镍-NTA磁珠基测定和通过 PAGE分析的荧光检测，已使用HIV-1蛋白酶进行了优化。然而，开发的测定平台也可以适用于其他蛋白酶。在裂解或洗脱缓冲液中解解的纯化基质的校准曲线，在重组基质编码基质和天然HIV反酶蛋白的帽状蛋白之间的裂解侧mTurquoise2和mEYFP融合形式的例子上进行了说明。镍-NTA磁珠基测定是研究基板浓度对反应速度的影响的有用工具，从而还可以确定Vmax和Km等酶动力学参数。图 A 显示了在 mApple-熔融基材上成功执行基板相关活性分析后获得的最佳结果。相比之下，图 B 提出了一个次优结果，即 SAMB 库存溶液的均质不足会导致设置适当的基板浓度出现问题，而反应样品的不当端接会导致相对较高的误差。该测定也为进行时间过程和抑制性研究提供了合适的工具。图 A 演示了 HIV-1 蛋白酶在 mEYFP 熔融基材上的时间依赖性，而图 B 则表示安培纳维对裂解反应的抑制作用。从抑制研究获得的数据中，可以确定活性酶浓度和抑制常数。测定方法也可以进行优化，以研究酶活性对pH的依赖性，因为它以图 A为例，以烟草蚀刻病毒蛋白酶为例。图 B 表示 pH 测定的局限性，表明中性或微碱 pH 与测量完全兼容，而酸性 pH 有助于基板与磁珠表面的自发分离。本图显示了经过纯化的完好荧光基板，即由HIV-1蛋白酶在溶液内消化产生的荧光C-端裂片段。如果在样品制备过程中应用了非变性条件，可以在电泳后通过蓝光半透明在含有 SDS 的多丙烯酰胺凝胶中检测荧光成分。不同的荧光蛋白可以根据颜色进行区分。在基于磁珠的测定之后，样品中超酸剂中的非变性荧光蛋白也可以通过紫外线照射在凝胶中检测。相比之下，如果在样品制备过程中应用变性条件，则在 SDS PAGE 之后，无法立即在凝胶中检测到变性蛋白质。然而，变性荧光蛋白可以通过从凝胶中去除SDS来部分重新饱和，并成为可检测的。因此，SDS PAGE 后面是凝胶内重新饱和过程。荧光蛋白的再饱和能力使得它们不仅能够根据荧光，而且基于其分子量进行鉴定。在这里，我们演示了使用我们最近开发的基于磁珠的荧光蛋白酶测定平台的协议。在HIV-1蛋白酶酶动力学研究的例子上，我们证明了该系统的使用。我们使用mTurquoise和mApple-熔融形式的重组测定基板，其中包含蛋白酶的裂解位点序列。除了氟学分析外，SDS PAGE还对测定样品进行了分析。我们已经证明，变性荧光蛋白可以在SDS PAGE后部分在凝胶中重新饱和，从而提供基于荧光和分子量的基板和蛋白解片段的识别。

Research

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Biochemistry

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