Name: use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00
Duration: 19 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Værket var delvist understøttet af GINOP-2.3.2-15-2016-00044 "PHARMPROT teaming" projekt og også finansieres af videregående institutionelle Excellence-programmet af ministeriet af menneskelige kapaciteter i Ungarn, inden for rammerne af den Bioteknologi tematiske program af University Debrecen. Forfatterne er taknemmelig for medlemmerne af det laboratorium for Retroviral biokemi for deres videnskabelige hjælp under assay udvikling og også for deres tålmodighed under optagelserne assay (især til Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz og Vanda Toldi, der vises i baggrunden i videoen). Forfatterne vil også gerne sige særlig tak til Gedeon Richter Plc., især til Dr. Zoltán Urbányi for at tillade Beáta Bozóki arbejde i Institut for biokemi og molekylærbiologi som en Gæsteforsker. Forfatterne ønsker også at udvide deres taknemmelighed over for György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi og Zoltán Király fra multimedie- og E-learning Center for teknisk af Universitet Debrecen for den faglige bistand i lyd og video produktion.

<ol>
	<li>Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+Combinatorial+Assays+for+the+Determination+of+Protease+Activity+and+Inhibition.">Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition.</a> Molecular Informatics. 24 (10), 1141-1148 (2005).</li><li>Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biotechnological+aspects+of+microbial+proteases.">Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3), 597-635 (1998).</li><li>Zhang, G., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+assays.">Protease assays.</a> The Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Woelcke, J., Hassiepen, U., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+biochemical+assay+formats.">Fluorescence-based biochemical assay formats.</a> A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. , (2010).</li><li>Richardson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determination+and+use+of+optimized+protease+substrates+in+drug+discovery+and+development.">The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development.</a> Current Pharmaceutical Design. 8 (28), 2559-2581 (2002).</li><li>Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mapping+protease+specificity.">Methods for mapping protease specificity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 46-51 (2007).</li><li>Schilling, O., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-derived,+database-searchable+peptide+libraries+for+identifying+protease+cleavage+sites.">Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites.</a> Nature Biotechnology. 26 (6), 685-694 (2008).</li><li>Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+protease+activity+assay+using+heat-sensitive+Tus-GFP+fusion+protein+substrates.">Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates.</a> Analytical Biochemistry. 415 (2), 126-133 (2011).</li><li>Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP+based+assay+for+the+determination+of+hydrolytic+activity+and+substrate+specificity+of+subtilisins+under+washing+conditions.">A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions.</a> Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).</li><li>Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+for+site-specific+proteases+using+bead-attached+GFP+substrate.">In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate.</a> Biotechniques. 31 (5), 1194-1198 (2001).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+bioluminescence+resonance+energy+transfer-fluorescence+resonance+energy+transfer-based+ratiometric+protease+assays+with+fusion+proteins+of+firefly+luciferase+and+red+fluorescent+protein.">Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 239-245 (2011).</li><li>Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fusion+protein+platform+for+quantitatively+measuring+activity+of+multiple+proteases.">A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases.</a> Microbial Cell Factories. 13 (1), 44 (2014).</li><li>Fox, J. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maltose-binding+protein+as+a+solubility+enhancer.">Maltose-binding protein as a solubility enhancer.</a> Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).</li><li>Boz&#243;ki, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+fusion+protein-based,+fluorescent+protease+assay+for+high+throughput-compatible+substrate+screening.">A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening.</a> Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).</li><li>M&#243;ty&#225;n, J. A., Miczi, M., Boz&#243;ki, B., T&#246;zs&#233;r, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+supporting+Ni-NTA+magnetic+bead-based+fluorescent+protease+assay+using+recombinant+fusion+protein+substrates.">Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates.</a> Data in Brief. 18, 203-208 (2018).</li><li>Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+characterization+of+maturation+time+of+fluorescent+proteins+in+living+cells.">Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells.</a> Nature Methods. 15, 47-51 (2018).</li><li>Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+variation+of+fluorescence+protein+maturation+times+in+closely+related+Escherichia+coli+strains.">High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains.</a> PLoS One. 8, e75991 (2013).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

På grund af de intensive industrielle og akademiske undersøgelser af Proteolytiske enzymer og de konstante krav om hurtig og billig HTS-kompatible protease assay platforme i overensstemmelse hermed, har vi udviklet en magnetisk-perle-baserede fluorescerende protease assay. Analysen er baseret på brugen af rekombinant fusion proteiner, som kan være nye alternativer til almindeligt udnyttede syntetiske peptid substrater.
I formatet udviklede assay er fusion protein substrater immobiliseret på overflader af Ni-Chelat-belagt magnetiske Agarosen perler. Substrat udlæg er fastsat af N-terminalen hans6 affinitet tag fusion protein, som er direkte smeltet til en MBP tag for at lette den foldning og øge vandopløseligheden af substrat13. MBP er efterfulgt af kavalergang lokaliteter af TEV PR og en protease af interesse. Den tidligere kan tjene som en kontrol kavalergang site i analysen, mens sidstnævnte kan behandles af protease skal undersøges. Webstedet kavalergang er udskiftelige; en kort dsDNA sekvens kodning for webstedet spaltning af interesse kan indsættes i den fleksible kloning kassette af udtryk plasmid af ligatur. Rekombinant fusion proteiner indeholder en yderst stabil, monomere fluorescerende proteiner tag på C-terminal, som gør det muligt for slutpunkt påvisning af de enzym-befriet, fluorescerende C-terminale spaltningsprodukter frigives ved proteolytiske spaltning ( Figur 1A). De renset fluorescerende intakt substrater løst i forskellige buffere bruges også til kalibrering til at vurdere de molære substrater og spaltningsprodukter. Derudover efter fluorimetry, kan assay komponenter analyseres af SDS-PAGE, så godt. Begge (nondenatured) native og denaturerede fluorescerende proteiner kan visualiseres i gelen, umiddelbart efter elektroforese eller efterfølgende i-gel genopretning, henholdsvis. Denne ekstra procedure-i kombination med en konventionel Coomassie strålende blå farvning-kan anvendes effektivt til kontrol af analyse resultater (figur 1B).
Analyseprocedure består af enkle, let at udføre trinnene i en lav-volumen format, der kan være fuldt ud tilpasset til en høj overførselshastighed automatisk miljø. Dog anses uafhængigt fra at udføre analysen, enten manuelt eller med en automatiseringssystem, følgende dele af analysen for at være af afgørende betydning og har brug for særlig opmærksomhed under udførelsen af proceduren. i) ensartethed af magnetisk bead løsning. En homogen magnetisk bead løsning skal anvendes i hele analysen, både i oprensning og vaske trin. Især, afhænger pålideligheden af protease assays stærkt af korrekt aliquoting stamopløsninger substrat-attached magnetisk bead (SAMB). For at øge effektiviteten af suspension og spredning, anbefales det at indstille perle fusion mellem 2% og 10% (v/v). Under prøveforberedelse, brug af buffere suppleret med nonionisk detergent (såsom Triton X-100 eller Tween 20) op til 2% kan også mindske overholdelsen af de magnetiske perler af plast overflader. Overholdelse af perlerne til væggene i stikprøven hætteglas kan undgås, hvis perle suspensioner anvendes forsigtigt på bunden af hætteglas i stedet for på vægge af prøveglassene. Homogenitet af de magnetiske perler under enzymatisk reaktion er også kritisk og kan sikres ved løbende at ryste prøverne på 600 rpm under inkubation. Perler er korrekt spredt i afrundede eller fladbundede plast bagværk, mens brugen af V-bund hætteglas ikke anbefales. En suboptimal resultat forårsaget af forkert perle homogenisering er repræsenteret i figur 4B. II) ophør af reaktion prøver.  En anden fordel ved metoden er at den enzymatiske reaktion kan opsiges uden brug af denaturering varmebehandling eller ethvert potentielt interfererende kemiske agenser15. Opsigelse kan foretages blot ved at adskille de magnetiske perler fra reaktionsmiljøet, ved hjælp af en konventionel magnetiske partikel koncentrator. Mens fjernet reaktion bufferen indeholder det aktive enzym og de genererede C-terminale fluorescerende spaltningsprodukter, forbliver de uncleaved substrater knyttet til perlerne. På grund af tilstedeværelsen af det aktive enzym i reaktion buffer skal adskillelse procedure udføres omhyggeligt for pålidelig slutpunkt påvisning. Før du placerer prøve hætteglas til koncentratoren, anbefales det at anvende et kort spin centrifugering. Efter markedsføring af rør i koncentratoren, give mindst 15 s for perler skal indsamles. Lille bevægelse i den separator og tilbage kan lette indsamlingen af perlerne. Overvej venligst at under en manuelt udførte separation, opsigelse normalt tager mere tid end indledningen af reaktionerne. Derfor anbefales en ca. 2 min. registreret forsinkelse mellem Indvielserne hvis den samme inkubationstiden skal anvendes på alle prøver.
Princippet om den beskrevne proteolytiske assay er forholdsvis simpelt; men alsidighed i systemet er garanteret af den fleksible og stabile substrat struktur. Den enkelte optimering af analysen kan begrænses kun af affinitet perler forenelighed med de anvendte betingelser, reagenser og tilsætningsstoffer. I overensstemmelse med producentens protokol fandt vi også, at affinitet bindingen af substrater til Ni-NTA perle overflader væsentligt svækker på pH ≤ 6,515. Derfor anbefales det at anvende substrat blindprøver parallelt med reaktion prøver, og satsen for spontan substrat dissociation skal tages i betragtning under evalueringen af resultaterne.
I de tilfælde, hvor magnetisk-perle-baserede assays ikke kan udføres på grund af brugen af perle-uforenelige komponenter eller en lav pH, kan i løsning fordøjelse af de oprensede rekombinant substrater anvendes også. I disse tilfælde reaktion blandinger kan analyseres ved elektroforese, og proteinerne kan visualiseres i gelen baseret på den beskrevne protokol. For at undersøge proteolytiske aktivitet, kan i løsning fordøjelse og i-gel påvisning af proteiner også være alternative redskaber i fluorimetry. En nyhed af designet substrat-systemet er anvendelsen af en i-gel genopretning trin efter denatureringen SDS-PAGE. Mens indfødte (nondenatured) fluorescerende proteiner, bevarer deres fluorescens under elektroforese er egenskaben fluorescerende afskaffet ved denaturering (figur 7B). Dog kan fluorescens af denaturerede proteiner inddrives delvist ved fjernelse af SDS fra gel. Således, en adskillelse af reaktion komponenter ved hjælp af denaturering betingelser gør ikke kun fluorescens-baseret men identifikationen Molekylær-vægt-baserede muligt. En anden fordel ved fluorescerende i-gel påvisning i forhold til analysen af en Coomassie farvede gel er, at de (native eller renatured) fluorescerende proteiner let kan identificeres i gelen baseret på deres fluorescens (Se figur 7). Dette kan være vigtigt, hvis kavalergang reaktioner er udført i prøver indeholdende nonfluorescent forurenende stoffer eller protein, der meget ligner Molekylær vægten af hinanden.
Protease assays bruger ligeledes designet substrater er allerede blevet offentliggjort tidligere8,9,10, og selv om webstedet spaltning af interesse i disse sager var også placeret mellem en affinitet tag og en fluorescerende proteiner, assay systemet præsenteret her ikke kun gentager de beskrevne ideer men kombinerer de forskellige fordele ved de tidligere platforme og også afslutter dem med yderligere forbedringer: i) udnyttelsen af en MBP fusion partner, ii) den tilstedeværelsen af en TEV PR kontrol kavalergang site, iii) brugen af nyligt manipuleret monomere FPs, og iv) anvendelse af en unik substrat kalibreringsmetode. Analysen, selv var specielt designet til at være nyttig for enzymet specificitet og kinetiske studier i en sikker, tid - og omkostningseffektiv måde, uden behov for dyre instrumentation. Metoden har til formål at være et egnet og billig værktøj for både industrielle og akademiske forskningsformål. På grund af fleksibilitet i kloning kassetten af udtryk plasmid, kan systemet være velegnet til hurtig og billig generation af rekombinant substrat biblioteker. Den heri beskrevne assay er et muligt redskab til gennemførelsen af substrat specificitet, enzym mutagenese, og hæmning undersøgelser og også give et alternativ til at udføre enzymkinetik. Assay platform (fra bakteriel celle forstyrrelser til bestemmelse af kinetiske parametre) kan tilpasses til en HTS - og automatisering-baseret miljø og potentielt, kan der anvendes i industrielle protease inhibitor screening og/eller antiviral medicin udvikling. Tilpasning af assay for konkurrencedygtige proteolyse er derudover også fremover omfanget af vores laboratorium. I sådan en konkurrencedygtig assay, to forskellige substrater-hver indeholder en forskellig kavalergang site smeltet til en forskellige C-terminale fluorescerende tag-er beregnet til at bruges samtidig i de samme kavalergang reaktion for at undersøge præference i den undersøgte enzym til de givne mål sekvenser. Desuden er brug af en 96-brønd plade-tilpasset assay form (figur 8) også at være optimeret til mutation screening ved hjælp af en række substrater med modificerede kavalergang site sekvenser i tilfælde af cystein proteaser.

Proteolytiske enzymer, der hører til de mest intensivt undersøgte enzym grupper på grund af deres betydning i stofskifteveje og industrielle applikationer. Deres centrale rolle i virussygdomme, regulering af blodpropper, cancer, og hjerte-kar- og neurodegenerative sygdomme gør proteaser fremtrædende mål inden for drug discovery. Derfor, en detaljeret karakterisering af substrat specificitet og hæmmer profilering af protease (PR) af interesse er afgørende og er fortrinsvis udført af hurtig, omkostningseffektiv og robust biokemiske assays1,2, 3.
I dag er størstedelen af in vitro-protease assays anvendes inden for drug discovery for sammensatte profilering er homogen, fluorescerende peptid-baseret, og høj overførselshastighed screening (HTS)-kompatibel platforme4. Derudover mærket peptider er ikke kun egnet til biblioteket screening, men de tilbyder også fantastiske værktøjer til bestemmelse af enzymet kinetiske parametre på de valgte substrater. I andre tilfælde, hvor mærkning af substratet ikke er muligt, kan adskillelse-baserede assays give en mulig løsning for at vurdere de kinetiske egenskaber af proteolytiske reaktioner3.
Generelt, in vitro-protease assays er baseret på brug af to typer af underlag: kort peptider eller hele proteiner. I de tilfælde, hvor kløvningen af korte peptid sekvenser afspejler egenskaberne kavalergang tilstrækkeligt, følgende standard metoder er gældende: (i) undersøge standard protein substrater såsom oxideret insulin B-kæden, (ii) test kommercielt tilgængelige substrater af andre proteaser, (iii) screening syntetiske og fluorescently mærket peptid biblioteker lavet af kombinatorisk kemi, eller (iv) bruge genetiske metoder, for eksempel, biologiske vise teknologier5, 6. Udover de konventionelle klassificering, andre roman platforme er også tilgængelige for substrat generation (f.eks. dannelse af proteomet-afledte peptid biblioteker7 eller særlige undertyper af genetiske metoder, som den rekombinante fusion protein-baserede substrater8,9,10,11,12).
Alle de ovennævnte substrat typer og assays har deres egne fordele og begrænsninger, og udviklingen af assay formater ved at kombinere og/eller forbedre fordelene af de kendte platforme er stadig i efterspørgslen. Her beskriver vi en protokol for en adskillelse-baserede fluorescerende protease assay, der udnytter rekombinant substrater. Disse fusion proteiner består af hans6 og MBP tags smeltet til en kontrol kavalergang site af TEV PR, som efterfølges af substrat sekvens af interesse, som er direkte forbundet til en C-terminale fluorescerende proteiner (FP) (figur 1A). Kloning af en DNA-sekvens kodning for en spaltning site af interesse i den kloning kassette kan udføres af en enkelt ligatur reaktion i udtryk plasmidet, som tidligere har været linearisering af restriktionsendonukleaser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> Figur 1: Princippet om fluorescerende protease assay. (A) den skematisk fremstilling af en fluorescerende substrat og sin spaltning af human immundefekt virustype 1 (HIV-1) protease er vist. Pilen angiver kavalergang position inden for matrix/kapsid kavalergang site sekvens af HIV-1 protease (VSQNY * PIVQ). (B) fluorescerende substrater kan bruges til at analysere enzym reaktioner ved Ni-NTA magnetisk-perle-baserede analyse og polyacrylamid gelelektroforese, så godt, som det fremgår af arbejdsprocesdiagram. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Selvom proteolytiske assays ved hjælp af lignende rekombinante protein substrater indeholdende en affinitet tag, et proteolytisk kavalergang websted og en fluorescerende proteiner-have allerede blevet beskrevet8,9,10, systemet præsenteret her agter at integrere og forbedre på fordelene ved disse metoder. En vigtig forskel er, at fusion protein substrater i denne analyse-perron er udstyret med MBP at øge protein opløselighed13 og indeholde en kontrol kavalergang site for TEV PRs. Desuden indeholder substraterne nye generation fluorescerende proteiner, som er meget stabil og har en monomere form at forhindre substrat sammenlægning. Udover den tidligere udgivne anvendelsen af mTurquoise2 - og mApple-smeltet former14viser her vi også resultater givet ved hjælp af en rekombinant substrat, der indeholder en monomere forbedret gul fluorescerende proteiner (mEYFP) fluorescerende tag. Herved vi demonstrere kompatibiliteten af systemet med andre fluorescerende proteiner og repræsentere nogle generelle typer af resultater, der kan erhverves af protease assay.
Rekombinant fusion proteiner er udtrykt i E. coli BL21(DE3) celler og anvendes som bærestof for analysen i en nikkel-nitrilotrieddikesyre syre (Ni-NTA)-belagt magnetisk-Agarosen-perle-attached form. C-terminale spaltningsprodukter er befriet fra perle overfladen i supernatanten ved spaltning af protease af interesse. Efter adskillelse af supernatanten (som indeholder enzymet og spaltningsprodukterne) fra de magnetiske perler, kan fluorescens måles for at bestemme kavalergang egenskaber af enzymet. I modsætning til de tidligere beskrevne metoder, er i systemet præsenteres her, mængder af substrat og C-terminale spaltningsprodukter entydigt kvantificeret baseret på en detaljeret substrat kalibreringsmetode. Analyse system kan støttes af SDS-PAGE analyse af assay prøver; en efterfølgende fluorescerende i-gel visualisering kan anvendes umiddelbart efter elektroforese eller i-gel genopretning af nondenatured og denatureret fluorescerende komponenter, henholdsvis14.
Fleksibilitet og struktur i kloning kassetten giver mulighed for en tid - og cost-effektive indsættelse af en bred vifte af sekvenser i konstruktionen og dermed fremmer generation af substrat biblioteker. Da alle assay trin er automation - og HTS-kompatibel, kan systemet være særligt attraktivt for, for eksempel, kan også blive udnyttet effektivt for industrielle protease inhibitor screening protease specificitet målinger og mutagenese undersøgelser, eller det og/eller antiviralt lægemiddel udvikling, så godt.
Enzym kinetiske parametre (kkat, Kjærm) kan bestemmes af den udviklede adskillelse-baseret analyse; Det kan derfor egnet til at udføre individuelle enzym kinetic målinger, som tid-kursus, substrat-afhængige og hæmning undersøgelser. Dette beviser, at rekombinant fusion protein substrater give gode alternativer til de ofte udnyttet syntetiske oligopeptide substrater, og på grund af deres høje lighed med polyprotein substrater, de repræsenterer de naturligt forekommende enzym-substrat interaktioner mere præcist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10K Amicon tubes</td>
			<td style="width:269px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC501096</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">M6250</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;">1610148</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">100063</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Agarose</td>
			<td style="width:269px;">SERVA</td>
			<td style="width:137px;">11404.04</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Alpha Imager HP gel documentation system</td>
			<td style="width:269px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A3678</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A9518</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">392185</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Black half-area plates</td>
			<td style="width:269px;">Greiner bio-One</td>
			<td style="width:137px;">675086</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">B0126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">CutSmart buffer (10x)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7204S</td>
			<td style="width:191px;">For plasmid linearization (step 1.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:269px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:137px;">DR-45M</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">M0303L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dynamag-2&#160;magnetic particle&#160;concentrator</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12321D</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Escherichia coli BL21(DE3) competent cells&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">C600003</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethanol</td>
			<td style="width:269px;">Merc-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">100983</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">798681</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7024S</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycerol</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">356350</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">G7126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">High-Speed Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:269px;">GeneAid</td>
			<td style="width:137px;">PD300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Imidazole</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">56750</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">AM9464</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Jouan CR 412 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Jouan</td>
			<td style="width:137px;">CR412</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Labinco LD-76 Rotator&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Labinco</td>
			<td style="width:137px;">7600</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L3022</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Lysozyme&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L6876</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:269px;">Scharlau</td>
			<td style="width:137px;">MA0036</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MERCK eurolab ultrasonic bath</td>
			<td style="width:269px;">MERCK</td>
			<td style="width:137px;">USR54H</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Millifuge Eppendorf spin centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">CT10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T9281</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NheI-HF restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R3131L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nickel(II) sulfate (NiSO4)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">656895</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ni-NTA magnetic agarose beads&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">36113</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">OS-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PacI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R0547L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PageBlue Protein Staining Solution&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">24620</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P7626</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Protein Lobind Micro-centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">22431102</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:269px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Snijders Press-to-Mix shaker&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Gemini</td>
			<td style="width:137px;">34524</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-acetate trihydrate</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S7670</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-chloride</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S9888</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S5881</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">S7563</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:269px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M180A</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Thermo shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">TS-100</td>
			<td style="width:191px;">with SC-24 accessory block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tris</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T1503</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tween 20</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P2287</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter</td>
			<td style="width:269px;">Wallac Oy, Turku, Finland</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation

Proteaser er intensivt undersøgt enzymer på grund af deres væsentlige roller i flere biologiske veje af levende organismer og i patogenesen; Derfor er de vigtige stof mål. Vi har udviklet en magnetisk-Agarosen-perle-baserede assay platform for undersøgelse af proteolytiske aktivitet, som er baseret på brugen af rekombinant fusion protein substrater. For at demonstrere brugen af denne analyse system, præsenteres en protokol på eksemplet med human immundefekt virustype 1 (HIV-1) protease. Den indførte assay platform kan udnyttes effektivt i den biokemiske karakterisering af proteaser, herunder enzym aktivitet målinger i mutagenese, kinetic, hæmning eller specificitet undersøgelser, og det kan være egnet til høj overførselshastighed substrat screening eller kan tilpasses til andre Proteolytiske enzymer.
I denne analyse system, anvendt substraterne indeholder N-terminale hexahistidine (hans6) og maltose-bindende protein (MBPS) tags, kavalergang websteder for tobak etch virus (TEV) og HIV-1 proteaser og en C-terminale fluorescerende proteiner. Substraterne kan fremstilles effektivt i Escherichia coli celler og uden sammenligning renset ved hjælp af nikkel (Ni) - Chelat - belagte perler. Under analysen fører proteolytiske kløvningen af perle-attached substrater til frigivelse af fluorescerende kavalergang fragmenter, der kan måles af fluorimetry. Derudover kan kavalergang reaktioner analyseres af sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). En protokol til i-gel genopretning af assay komponenter er også beskrevet, som delvis genopretning af fluorescerende proteiner giver deres påvisning baseret på Molekylær vægt og fluorescens.

Figur 1A viser skematisk af en repræsentativ fluorescerende rekombinante protein substrat, som kan behandles af HIV-1 PR på dens specifikke kavalergang site sekvens. Figur 1B repræsenterer substrat produktion og deres mulige applikationer i protease assays, herunder Ni-NTA magnetisk-perle-baserede analyse og/eller side.
For at få pålidelige data af fluorimetry, er en kalibrering procedure påkrævet, for at bestemme mængderne af fluorescerende substrater og spaltningsprodukter. For dette, fluorescens intensitetsværdier af de forskellige substrater i forskellige buffer betingelser skal måles og skal være korreleret med deres koncentration i de analyserede koncentrationsområde (figur 3). Slope værdier kalibreringskurverne kan anvendes til at bestemme mængderne af substrater og spaltningsprodukter i assay prøver. Skråningerne af kalibreringskurverne er uafhængige af kavalergang site sekvenser indsat i substrater (tabel 11) og kan potentielt bruges til en række substrater smeltet til den samme type af fluorescerende proteiner. Zoom-in grafer er vist for alle lineære regressioner til at forstørre de lavere koncentrationsintervaller (figur 3). Det er vigtigt at bemærke, at kalibreringen skal udføres omhyggeligt, fordi en korrekt fordeling af datapunkter er nødvendige for en pålidelig kalibrering. Af denne grund, er dobbelt seriel fortynding anvendt til at forberede prøverne for kalibrering, fordi R2 -værdien angiver en god korrelation mellem koncentrationen af fluorescerende proteiner og fluorescens kun hvis et tilstrækkeligt antal datapunkter har været brugt til at dække det hele koncentrationsområde. Desuden kan eksperimentelle fejl stærkt påvirker nøjagtigheden af kalibreringen; således er en grafisk regression linjer kan man evaluere også nødvendigt.
En bred vifte af enzymatisk målinger kan udføres af protease assay, herunder en undersøgelse af effekten af substratkoncentrationen på reaktion hastighed (figur 4A). Af ikke-lineær regression, kan dataene bruges til at bestemme enzym kinetiske parametre (f.eks. vmax og Km). En utilstrækkelig perle suspension og spredning og en forkert reaktion opsigelse kan forårsage suboptimale resultater (figur 4B), som ikke er egnet til beregning af pålidelige enzym kinetic værdier.
En afhængighed af produkt formation på tid kan bestemmes ved analyse (figur 5A) (f.eks. under optimering af kavalergang reaktion parametre). Enzymaktivitet i nærværelse af en inhibitor kan også blive undersøgt (figur 5B) til bestemmelse af det aktive enzym koncentration og hæmmende konstant. Ved hjælp af samme metode, kan virkningerne af andre hæmmere også blive screenet af analysen.
Protease assay er nyttigt at undersøge virkningerne af pH på enzymaktiviteten, samt. Figur 6A repræsenterer afhængighed af enzymaktivitet pH ved eksemplet med TEV PR, som har en bred optimale pH interval (pH 6-9). Hvis pH afhængighed af enzymaktivitet er studeret (eller enzymer har en sur pH optimal skal måles), er det nødvendigt at overveje at affinitet bindingen af rekombinant substrater til perlerne kan begrænses på lidt sure pH-værdi. En forhøjet dissociation af substrater fra perler (fig. 6B) kan forårsage en forvrængning af analyse resultater. For at overveje de spontane substrat dissociation fra glasperler, skal de målte reaktion prøver rettes af de af B prøver.
Figur 7 viser, at de nondenatured fluorescerende proteiner kan differentieres i gelen baseret på deres farver, ved hjælp af blå lys ved gennemlysning (figur 7A). Hvis Molekylær vaegten af substrater/kavalergang fragmenter er nødvendige, kan denaturering betingelser også bruges til prøveforberedelse, fordi fluorescerende proteiner kan være delvist renatured i gelen, og kan blive opdaget af UV belysning (Figur 7B) eller af Coomassie farvning (figur 7C). Hvis R prøver analyseres, er kun de C-terminale spaltningsprodukter synlige (fig. 7C), mens de N-terminale kavalergang fragmenter og de uncleaved substrater forbliver knyttet til perlerne. Lejlighedsvis, proteiner kan denatureres delvist trods ved hjælp af nondenaturing betingelser (figur 7C), og mens de nondenatured proteiner er mere rigelige, denatureret former er også påvises i prøven. Dette fænomen påvirke ikke påvisning af proteolytiske kavalergang men skal overvejes i forbindelse med kvantitative densitometri af nondenatured prøver.
Selv om den detaljerede beskrivelse er vist kun til en 2 mL-rør-baserede assay, kan analysen være tilpasset til 96-brønd plade-baserede systemer (figur 8), som er allerede blevet testet med succes i vores laboratorium (ikke vist). 96-brønd plade-tilpasset format er fuldt kompatibel med fluorimetri og elektroforese analyser, så godt, og de opnåede data kan også blive evalueret baseret på de metoder, der er beskrevet i denne hvidbog.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> Figur 3 : Kalibreringskurver. Repræsentative substrat kalibreringskurverne er påvist med eksempel på to rekombinant substrater smeltet til forskellige C-terminale fluorescerende tags: (A og B) hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 og (Christensen og D ) Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zoom-i tal er også vist at repræsentere den lineære regression af datamærker i 0-0.005 mM substrat koncentrationsområde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> Figur 4 : Bestemmelse af enzymet kinetiske parametre. Substrat-afhængige kinetic målinger blev udført af HIV-1 PR (på en aktiv slutkoncentration af 41.2 nM). Indledende hastighed værdier blev afbildet mod substratkoncentrationen og en Michaelis-Menten ikke-lineær regressionsanalyse blev udført. Fejllinjer udgør SD (n = 2). (A) A repræsentative optimale resultat er vist med eksempel på hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple fusion protein substrat. (B) en repræsentativ suboptimal resultatet vises også for hans6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 substrat, hvor fastsættelse af passende substrat koncentrationer var problematisk på grund af en utilstrækkelig homogenisering af stamopløsningen SAMB , mens relativt høje fejlene skyldes forkert reaktion opsigelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> Figur 5 : Gang-kursus og hæmmende undersøgelse. (A) Hans 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP rekombinant fusion protein substrat (i en endelig koncentration på 0.00326 mM) blev kløvet af HIV-1 PR (på en aktiv slutkoncentration af 41.2 nM), og frigivelsen af fluorescerende PIVQ-mEYFP proteolytiske fragmenter blev målt til udføre et tidsforløb analyse. Målingerne blev foretaget på fem forskellige tidspunkter. Fejllinjer udgør SD (n = 2). (B) hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP blev brugt som substrat (på 0.0015 mM) til at bestemme den hæmmende effekt af amprenavir på aktiviteten af HIV-1 PR (i en samlet koncentration på 163.8 nM). Ved at plotte dataene, de halv maksimal hæmmende koncentration (IC50) kunne vurderes og aktive enzym koncentration (en aktiv slutkoncentration af 41.2 nM) af det anvendte HIV-1 PR kunne også blive beregnet på grundlag af hæmning kurve. Fejllinjer udgør SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> Figur 6 : Studere afhængighed af enzymaktivitet og spontane substrat dissociation på pH. (A) at hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (i 0,033 mM) blev brugt til at måle enzymaktiviteten i TEV PR (i en endelig total koncentration af 91.42 nM) i kavalergang bufferen indstillet til en forskellige pH mellem vifte af 6,5 til 8,5. Fejllinjer udgør SD (n = 2). De plottede data har været offentliggjort tidligere14. (B) baseret på de relative fluorescerende intensitetsværdierne af substrat blindprøver, spontane dissociation af hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (0,033 mM) fra de magnetiske perler blev undersøgt ved hjælp af kavalergang buffer med en forskellige pH, mellem 6.0-8,5. De plottede data har været offentliggjort tidligere14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> Figur 7 : Afsløre proteiner i gelen af forskellige metoder. (A) Uncleaved og HIV-1 PR-fordøjet fusion protein substrater efter nondenaturing prøveforberedelse blev visualiseret af blå lys ved gennemlysning efter SDS-PAGE. Kavalergang reaktion blev udført af-løsning fordøjelsen. (B) umiddelbart efter siden, kun nondenatured proteiner kunne være opdaget i gel UV belysning, mens efter fjernelse af SDS, de tidligere denatureret fluorescerende proteiner blev delvist renatured og kan spores. Prøverne blev udarbejdet fra supernatanter af Ni-NTA magnetisk-perle-baserede analyse. (C) Coomassie farvning kan også bruges til påvisning af protein, efter i-gel genopretning. SDS-stede i gel-kan forårsage den delvise denaturering af indfødte protein, men i native prøver, de nondenatured former er mere rigelige. Prøverne blev udarbejdet fra supernatanter af Ni-NTA magnetisk-perle-baserede analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> Figur 8 : 96 brønde plade-baserede tilpasning af assay platform. (A) analysen kan udføres, ikke kun i 2 mL rør men i wells af en 96-brønd plade, så godt. Her viser vi den skematisk repræsentation for anvendelse af analysen at studere en fiktiv protease specificitet ved hjælp af en serie af fluorescerende substrater, som kan indeholde wild-type (wt) eller muterede (mut-1-mut-4) kavalergang site sekvenser. Til håndtering af de magnetiske perler, er en 96-brønd kompatibel magnetiske partikel koncentrator (MPC) skal anvendes i eksperimenter. Alle de anførte mængder er relateret til en enkelt brønd. For at sammenligne kavalergang effektiviteten af de forskellige substrater, kan substrat omdannelse vurderes ud fra procentdelen af substrat-blank-korrigeret RFU værdier af reaktion prøver, overvejer substrat-blank-korrigeret RFU værdier af de relaterede substrat kontrolprøver som 100. (B) efter fluorimetry, de adskilte analysere af analysen prøver kan også analyseres af side og fluorescerende proteinkomponenter kan analyseres direkte eller efter-gel genopretning i tilfælde af nondenaturing og denaturering prøve forberedelse, henholdsvis. De tre forskellige assay prøve typer er også illustreret i hver figur: C = substrat kontrol, B = substrat tom, og R = reaktion. Substrat kontrolprøver er i eluering buffer, mens Tom substrat og reaktion prøver i kavalergang buffer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Buffer</td>
			<td>Fluorescerende proteiner</td>
			<td>CV % af pisterne (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluering</td>
			<td rowspan="2">mTurquoise2</td>
			<td>6,04</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kavalergang</td>
			<td>9,11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluering</td>
			<td rowspan="2">mApple</td>
			<td>10.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kavalergang</td>
			<td>12,68</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 11: koefficient for afvigelsesværdier (CV %) på skråninger af substrat kalibreringskurver. For at teste, om fluorescens af rekombinante protein substrater er afhængig af webstedet indsatte kavalergang, blev kalibreringer udført af række mApple - og mTurquoise2-smeltet substrater (seks varianter for hver, der indeholder forskellige kavalergang site sekvenser af HIV-1 protease), begge i eluering og kavalergang buffere. Vi fandt, at CV % værdier af skråninger er under 15% i alle tilfælde, som indebærer, at et enkelt substrat kalibrering kan udnyttes til evaluering af de forskellige målinger foretaget af substrat varianter indeholder samme fluorescerende tag.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Brug af rekombinant Fusion proteiner i et fluorescerende Protease Assay Platform og deres i-gel genopretning

Vi præsenterer her, en detaljeret procedure for en nyligt udviklede protease assay platform udnytter N-terminale hexahistidine/maltose-bindende protein og fluorescerende proteiner-smeltet rekombinant substrater knyttet til overfladen af nikkel-nitrilotrieddikesyre syre magnetiske Agarosen perler. En efterfølgende i-gel analyse af assay prøverne adskilt af sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese er også præsenteret.

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Proteaser er en af de mest undersøgte grupper af biomolekylære støtter i akademisk og industriel forskning. Deres kraftfulde rolle i flere fysiologiske og patologiske processer gør dem til et fremtrædende mål inden for lægemiddelopdagelse også. Med hensyn til deres intensive forskning, der er en stor og kontinuerlig efterspørgsel efter udvikling af tid-og omkostningsbesparende high-throughput screening-kompatible fluorescens protease assay platforme.Her vil vi gerne indføre en protokol for anvendelse af en separation-baseret high-throughput screening-kompatibel fluorescens assay platform ved hjælp af både mTurquoise2-og mApple-fusioneret rekombinant fusion protease substrater. Derudover vil vi gerne demonstrere en metode til in-gel renaturering af substrater og spaltning fragmenter af analysen prøver efter denaturering SDS-PAGE så godt. Alle forsøg udføres på eksemplet med HIV-1 virus protease.Udtrykket plasmid bærer kodning sekvens af en hexa histadine affinitet tag og en maltose bindende fusion protein efterfulgt af en kontrol spaltning site af tobak etch virus protease, en kloning kassette, og en C-terminal fluorescerende protein. Linearisere udtrykket plasmid af PacI og NheI begrænsning endonucleases. Udfør udglødning af Escherichia coli codon optimeret fremad og omvendt oligonucleotid primere, at koden for substrat sekvens af interesse og flanke af PacI og NheI sammenhængende ender.Udfør indsættelsen af de udglødede primere i det lineæriserede udtryk plasmid ved ligation. For proteinudtryk omdannes BL21(DE3)kompetente celler ved ligationsblandingen. De fluorescerende proteiner vil være i samme åbne læseramme med N-terminal fusion tags først efter en vellykket ligation.Et par dage efter omdannelsen vil kolonierne, der indeholder udtrykket plasmid, der koder det indsatte spaltningssted af interesse, vise synlig fluorescens med eller endda uden brug af en mørkelæserblå transilluminator. Der tilsættes 10 glycerolbestand af BL21(DE3)celler, der bærer udtrykket plasmidkodning for spaltningsstedets sekvens af interesse, til fem milliliter LB-medium, der indeholder 100 mikrogram pr. milliliter ampicillin i et 50 milliliter centrifugerør. Suspensionen inkuberes ved 37 grader i 15 timer, mens der konstant rystes.Overfør fem milliliter bakteriekultur til 50 milliliter frisk LB medium indeholdende 100 mikrogram pr. milliliter ampicillin. Dyrk cellerne ved 37 grader til en absorbans på 0,6 til 0,8 ved 600 nanometerbølgelængder. På dette tidspunkt fremkalde protein udtryk ved tilsætning af IPTG.Herefter inkuberes kulturen i tre timer ved 37 grader, mens den hele tiden ryster. Efter inkubationen overføres 25 milliliter af kulturen til rene 50 millilitercentrifugerør, og cellerne høstes ved centrifugering. Kassér supernatanten og opbevar bakteriecellepillerne på minus 70 grader i mindst en time.Cellepiller, der indeholder de med succes udtrykte fluorescerende proteiner, viser tydeligt en fluorescens med eller endda uden brug af en mørkelæserblå transilluminator. Placer den frosne celle pellet på is og lad det tø i 15 minutter. Tilføj to milliliter lysis buffer til pellet og suspendere cellerne.Herefter tilsættes proteasehæmmer, frigør suspensionen med lyzozym og DNase, suspenderer cellerne og inkuberes suspensionen på is i 15 minutter. Overfør to gange en milliliter suspensioner i 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og sonikere suspensioner i tre minutter i runder af 10 sekunder sonication og fem sekunder pause. Centrifuge rørene ved 10,000 g i 20 minutter ved stuetemperatur.Ryddede bakteriecellelyater, der indeholder fluorescerende undertrate af interesse, viser synlig fluorescens med eller endda uden brug af en mørkelæserblå transilluminator. Proceduren for den udviklede proteaseanalyse starter med fremstillingen af analyseprøverne. For det første inkuberes de rekombinant substrater med de affinitetsmagnetiske perler, og de substrat vedhæftede magnetiske perler, forkortet SAMBs, dannes.SAMBs vaskes flere gange, og endelig samb lager løsning er udarbejdet ved undersøgning, som analyse prøver er skabt. Reaktionerne initialiseres ved tilsætning af proteaseopløsningen. Efter kavalergang ved protease frigives de proteolytiske fragmenter til supernatanten.Reaktionen afsluttes ved adskillelsen af de magnetiske perler fra reaktionsbufferen, der indeholder fluorescerende spaltningsprodukter og enzymet. Supernatanterne påføres brøndene på en mikrotiterplade, og fluorescensen bestemmes af fluormetri. Kalibreringskurver genereres ved hjælp af rensede fluorescerende substrater, der er løst i hver analysebuffere.Koncentrationen af C-terminalens fluorescerende spaltningsprodukter og også koncentrationen af det anvendte substrat i analyseprøverne bestemmes på grundlag af kalibreringskurvernes hældning. Rør, der indeholder nye eller genbrugte nikkel-NPA magnetiske agaroseper, anbringes i en magnetisk partikelkoncentrator. Perler kan holde sig til væggen og/eller i låget af mikrocentrifugerøret.Vend derfor koncentratoren på hovedet i alle retninger for at sikre, at alle perlerne indsamles. Fjern supernatanten, og kassér den. Der tilsættes 1,8 milliliter lysisbuffer til perlerne, og de lukkede rør fjernes fra koncentratoren.Ophæng perlerne i røret ved at ryste og/eller dreje røret på hovedet, indtil perlerne er helt homogene. Placer rørene tilbage i koncentratoren og vend det på hovedet i alle retninger for at sikre, at alle perlerne er indsamlet. Åbn røret og kassér supernatanten.Tilføj ryddet bakterier-sterile lysate indeholder substratet af interesse og fjerne det lukkede rør fra koncentrator. Vend rørene på hovedet, indtil perlerne er helt homogene og drej rørene ved rotator, langsomt, ved stuetemperatur i 30 minutter. SAMBs viser synlig fluorescens med eller endda uden brug af en mørkelæser blå transilluminator.Vask SAMBs tre gange med 1,8 milliliter 1%Tween 20, vask buffer, og spaltning buffer. Tilføj spaltningsbuffer til de vaskede SAMBs for at oprette en SAMB-lagerløsning. Hvis der anvendes to milliliter protein-lav-bindende mikrocentrifugerør, volumen af den anvendte spaltning buffer er op til 1,9 milliliter.Efter tilsætning af bufferen må røret ikke rystes eller vendes på hovedet. Luk røret og fjern det fra koncentratoren. Forbered to milliliter protein-lav-bindende mikrocentrifuge rør til analysen prøver.SAMB-lageropløsningen suspenderes, indtil den er fuldstændig homogen, og mængden af underlag, der skal analyseres i reaktionerne, måles ved straks at overføre SAMB-lageropløsningen til prøvehætteglassene. Mængden af SAMB-lageropløsningen, der skal overføres, anbefales at være 25 til 300 mikroliter, men det skal indstilles i henhold til det individuelle forsøgsdesign. Prøverørene, der indeholder de aliquoterede SAMB-suspensioner, anbringes i koncentratoren.Fjern forsigtigt supernatanten fra SAMB'erne og kassér den. Fjern rørene fra koncentratoren, og tilsæt forsigtigt reaktionsbufferen til SAMB'erne. Volumenet af den ekstra reaktionsbuffer beregnes i henhold til det individuelle forsøgsdesign, men det anbefales at indstille reaktionsblandingens endelige volumen til mellem 50 og 150 mikroliter, hvis der anvendes to milliliterrør.Luk lågene på rørene. Prøverne er klar til initialisering. Der tilsættes enzymopløsningen til reaktionsprøverne.Rør forsigtigt op ved forsigtigt at flytte rørene og placere rørene straks ind i den allerede rystende termoshaker. For underlagsprøver og underlagskontrolprøver tilsættes henholdsvis spaltningsbuffer og elutionbuffer. Tredive sekunder før slutningen af inkubationen, tage prøven ud fra termoformørker og dreje det straks.Sæt røret på koncentratoren, og lad røret stå i 15 sekunder. Samlingen af SAMB'erne kan lettes ved at flytte koncentratoren lidt frem og tilbage. Åbn låget og overfør supernatanten forsigtigt ind i en plade eller et nyt rør.Rør ikke ved de koncentrerede perler ved spidsen af pipetten. Det indsamlede supernatant af underlagskontrolprøverne og reaktionsprøverne med en høj grad af kavalergang kan udvise synlig fluorescens med eller endog uden brug af en blå mørkelæser-transilluminator. Overfør to gange 30 mikroliter af de adskilte prøvesupernatanter i en sort mikroplade med halvt område.Fluorescensen måles ved hjælp af fluormeteret ved hjælp af de relevante filtre i henhold til det anvendte fluorescerende protein. Til rensning af fluorescerende underlag skal den samme opløsning som beskrevet tidligere tilberedes og supernatanten kasseres. Tilsæt 400 til 600 mikroliters elueringsbuffer til SAMB'erne, og drej rørene med rotator langsomt ved stuetemperatur i fem minutter.Eluatet overføres til nye proteinlavbindende mikrocentrifugerør. Det viser tydeligt synlig fluorescens med eller uden brug af en mørk læser blå transilluminator. Efter rensning, bufferudveksling og måling af proteinindholdet forberedes en dobbelt seriel fortynding i mindst otte trin, både fra elution-buffer-og spaltnings-buffer-løst substratopløsninger ved hjælp af henholdsvis eluerings- eller spaltningsbuffer til fortynding.Overfør 30 mikroliter af hvert fortyndingspunkt til en sort mikroplade med halvt område. Fluorescensen måles ved hjælp af fluorimeter ved hjælp af de samme indstillinger, som blev anvendt ved målingen af asayprøven supernatanter. Som et eksempel på databehandling blev de substratafhængige kinetiske målinger af HIV-1-protease udført på en mTurquoise2-smeltet form af rekombinantunderlaget, der koder spaltningsstedet mellem matrixen og capsidproteinerne i den naturlige gapic proteinprækurs.De korrigerede relative fluorescensintensitetsværdier afbildes i forhold til molærekoncentrationen af de rensede substrater, der skal løses enten spaltnings- eller elueringsbufferen, og der udføres lineær regression. Kindtandkoncentrationen af C-terminalspaltningsprodukterne beregnes i reaktionsprøverne ved hjælp af hældningen af den spaltningsbufferbaserede kalibreringskurve. Den anvendte substratkoncentration i reaktionsprøverne beregnes også på grundlag af molærekoncentrationen af det eluterede substrat i substratekontrolprøverne ved hjælp af hældningen af den elution-bufferbaserede kalibreringskurve.Starthastighedsværdierne blev beregnet ud fra mængden af C-terminalspaltningsfragmenter og derefter afbildet mod den anvendte substratkoncentration. Også kinetiske parametre blev bestemt af Michaelis-Menten ikke-lineær regressionsanalyse. Efter at have udført nikkel-NTA magnetisk perle-baseret analyse, kan analysen supernatanter analyseres ved polyacrylamid gel elektroforese samt.Men ved siden af analysen prøver, er det også muligt at analysere de rensede fluorescerende substrater og / eller spaltning fragmenter efter in-opløsning fordøjelse. Ved fordøjelse i opløsning aliquote de rensede fluorescerende substrater, der skal fordøjes, opløses i spaltningsbufferen i 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, og enzymopløsningen tilsættes til prøverne. Prøverne inkuberes i overensstemmelse med forsøgsdesignet, og reaktionerne afsluttes ved hjælp af proceduren for prøvepræparatet til PAGE.For ikke-natureret prøvepræparat blandes de prøver, der skal analyseres, med en prøvebuffer uden at blivenaturligt bestemt. Ved denatureret prøvepræparat blandes de prøver, der skal analyseres, med denatureringsprøvebufferen, og prøverne udsættes for varmebehandling ved 95 grader i 10 minutter. Påfør de ikke-denaturerede og de denaturerede prøver i brøndene i SDS-polyakrylamidgelen, og udfør elektroforese.Fjern gelkassetten fra det løbende modul. Ikke-denaturerede prøver er allerede synlige i gelen, selv med det blotte øje eller med den mørke læser blå transilluminator. For at detektere fluorescerende komponenter i denaturerede prøver på transilluminatoren udføres i-gel-renatureringen ved at vaske SDS ud af gelen.Tilsæt 100 milliliter destilleret vand til gelen og skyl det i mindst 30 minutter. Visualiser fluorescerende proteiner ved at placere den uindgroede gel på den mørke læser blå transilluminator. De rekombinant fluorescerende fusionsproteiner blev udviklet til at blive anvendt som substrater i proteolytiske analyser.Efter spaltning ved protease på det specifikke spaltningssted frigives C-terminalens fluorescerende spaltningsfragment, og dets fluorescens kan detekteres. Deres anvendelse i nikkel-NTA magnetisk perle-baseret analyse og fluorescerende detektion ved SIDE analyse er blevet optimeret ved hjælp af HIV-1 protease. Men den udviklede analyseplatform kan også være egnet til andre proteaser.Kalibreringskurver for de rensede substrater, der er løst i spaltnings- eller elutionbuffer, er illustreret på eksemplerne på både mTurquoise2- og mEYFP-smeltet form af rekombinant substrat, der koder spaltningssiden mellem matrixen og capsidproteinerne i det naturlige HIV-anechoic protein. Den nikkel-NTA magnetiske perle-baserede analyse er et nyttigt redskab til at undersøge effekten af substrat koncentration på reaktionshastighed og dermed også gør bestemmelsen af enzym kinetiske parametre såsom Vmax og Km muligt. Diagram A viser et optimalt resultat opnået efter en vellykket udført analyse af underlagsafhængig aktivitet på et mApple-sammensmeltet underlag.I modsætning hertil giver diagram B et suboptimalt resultat, hvor den utilstrækkelige homogenisering af SAMB-lagerløsningen giver problemer med at opsætte de korrekte substratkoncentrationer, mens forkert afslutning af reaktionsprøverne resulterer i relativt høje fejl. Analysen giver også et velegnet værktøj til at udføre tidsforløb og hæmmende undersøgelser samt. Diagram A viser tidsafhængigheden af den proteolytiske spaltning af HIV-1 protease på et mEYFP-sammensmeltet substrat, mens diagram B repræsenterer amprenavirens hæmmende virkning på spaltningsreaktionen.Ud fra de data, der er indhentet i den hæmmende undersøgelse, kan både den aktive enzymkoncentration og den hæmmende konstant bestemmes. Analysen kan også optimeres til at undersøge afhængigheden af enzymaktivitet på pH, da den er repræsenteret ved diagram A på eksemplet med tobaksætning virus protease. Diagram B angiver en begrænsning af analysen ved hjælp af pH og viser, at neutral eller let alkalisk pH er fuldt kompatibel med målingerne, mens sur pH letter spontan dissociation af substraterne fra overfladen af de magnetiske perler.Den nuværende figur viser de rensede intakte fluorescerende substrater, de fluorescerende C-terminal spaltning fragmenter, genereret af in-opløsning fordøjelse af HIV-1 protease. Fluorescerende komponenter kan påvises i den SDS-holdige polyacryamidgel ved blåt lys transillumination lige efter elektroforese, hvis der blev anvendt ikke-denatureringsbetingelser under prøvepræparatet. De forskellige fluorescerende proteiner kan differentieres baseret på deres farve.Efter den magnetiske perlebaserede analyse kan de ikke-denaturerede fluorescerende proteiner i prøvesupernatanterne også detekteres i gelen ved UV-belysning. Hvis der derimod anvendes denatureringsbetingelser under prøvepræparatet, kan de denaturerede proteiner ikke påvises i gelen umiddelbart efter SDS-siden. Men, de denaturerede fluorescerende proteiner kan delvist renatureres ved fjernelse af SDS fra gelen og blive påviselig.Derfor efterfølges SDS PAGE af in-gel renaturation procedure. Fluorescerende proteiners renatureringsevne gør det ikke kun muligt at identificere dem på grund af deres fluorescens, men også baseret på deres molekylvægt. Her demonstrerede vi protokollen for brugen af vores nyligt udviklede magnetiske perle-baserede fluorescerende protease assay platform.Vi har demonstreret brugen af dette system på eksemplet med enzymkinetiske undersøgelser af HIV-1 protease. Vi brugte mTurquoise-og mApple-fusionerede former af rekombinant assay substrat, som indeholdt spaltning site sekvens af protease. Ud over den fluormetriske analyse blev analyseprøverne efterfølgende analyseret af SDS PAGE.Vi har vist, at de denaturerede fluorescerende proteiner delvist kan renatureres i gelen efter SDS PAGE, som giver både fluorescerende og molekylær-vægtbaseret identifikation af substratet og proteolytiske fragmenter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Meget følsom og kvantitativ påvisning af proteiner og deres isoformer af kapillar isoelektrisk fokusering metode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

En høj overførselshastighed Luciferase Assay at evaluere proteolyse af Single-omsætning Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering af fysiologisk aktive tylakoiderne og deres anvendelse i energiafhængige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan man kan kvantificere brøkdel af Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og i levende celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farvning af proteinerne i polyacrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering af SUMO-modificerede proteiner ved hjælp af fluorescerende Sumo-diffuse Rings proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Måling af interaktioner mellem fluorescerende sonder og lignin i plante sektioner af sFLIM baseret på naturlig Auto Luorescens

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakteriserecellulære proteiner med in-cell hurtig fotokemisk oxidation af proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Platforminkubator med bevægelig XY-fase: En ny platform til implementering af in-cell hurtig fotokemisk oxidation af proteiner

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...