Name: use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00
Duration: 19 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Dit werk was gedeeltelijk ondersteund door de GINOP-2.3.2-15-2016-00044 "PHARMPROT teamwork" project en, ook, gefinancierd door het hogeronderwijs institutionele Excellence programma van het ministerie van menselijke capaciteiten in Hongarije, in het kader van de Biotechnologie thematische programma van de Universiteit van Debrecen. De auteurs zijn dankbaar voor de leden van het laboratorium van retrovirale biochemie voor hun wetenschappelijke hulp tijdens de assay ontwikkeling en ook voor hun geduld tijdens het filmen van de bepaling (vooral voor Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz en Vanda Toldi, die worden weergegeven op de achtergrond van de video). De auteurs ook wil speciale dankzij Gédéon Richter Plc., vooral aan de Dr. Zoltán Urbányi voor het toestaan van Beáta Bozóki van werk in het departement van biochemie en moleculaire biologie als een gastonderzoeker. De auteurs ook wil hun dankbaarheid aan György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi en Zoltán Király van de Multimedia- en E-learning Technical Center van de Universiteit van Debrecen voor de professionele hulp in audio en video productie.

<ol>
	<li>Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+Combinatorial+Assays+for+the+Determination+of+Protease+Activity+and+Inhibition.">Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition.</a> Molecular Informatics. 24 (10), 1141-1148 (2005).</li><li>Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biotechnological+aspects+of+microbial+proteases.">Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3), 597-635 (1998).</li><li>Zhang, G., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+assays.">Protease assays.</a> The Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Woelcke, J., Hassiepen, U., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+biochemical+assay+formats.">Fluorescence-based biochemical assay formats.</a> A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. , (2010).</li><li>Richardson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determination+and+use+of+optimized+protease+substrates+in+drug+discovery+and+development.">The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development.</a> Current Pharmaceutical Design. 8 (28), 2559-2581 (2002).</li><li>Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mapping+protease+specificity.">Methods for mapping protease specificity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 46-51 (2007).</li><li>Schilling, O., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-derived,+database-searchable+peptide+libraries+for+identifying+protease+cleavage+sites.">Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites.</a> Nature Biotechnology. 26 (6), 685-694 (2008).</li><li>Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+protease+activity+assay+using+heat-sensitive+Tus-GFP+fusion+protein+substrates.">Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates.</a> Analytical Biochemistry. 415 (2), 126-133 (2011).</li><li>Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP+based+assay+for+the+determination+of+hydrolytic+activity+and+substrate+specificity+of+subtilisins+under+washing+conditions.">A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions.</a> Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).</li><li>Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+for+site-specific+proteases+using+bead-attached+GFP+substrate.">In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate.</a> Biotechniques. 31 (5), 1194-1198 (2001).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+bioluminescence+resonance+energy+transfer-fluorescence+resonance+energy+transfer-based+ratiometric+protease+assays+with+fusion+proteins+of+firefly+luciferase+and+red+fluorescent+protein.">Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 239-245 (2011).</li><li>Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fusion+protein+platform+for+quantitatively+measuring+activity+of+multiple+proteases.">A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases.</a> Microbial Cell Factories. 13 (1), 44 (2014).</li><li>Fox, J. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maltose-binding+protein+as+a+solubility+enhancer.">Maltose-binding protein as a solubility enhancer.</a> Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).</li><li>Boz&#243;ki, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+fusion+protein-based,+fluorescent+protease+assay+for+high+throughput-compatible+substrate+screening.">A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening.</a> Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).</li><li>M&#243;ty&#225;n, J. A., Miczi, M., Boz&#243;ki, B., T&#246;zs&#233;r, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+supporting+Ni-NTA+magnetic+bead-based+fluorescent+protease+assay+using+recombinant+fusion+protein+substrates.">Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates.</a> Data in Brief. 18, 203-208 (2018).</li><li>Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+characterization+of+maturation+time+of+fluorescent+proteins+in+living+cells.">Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells.</a> Nature Methods. 15, 47-51 (2018).</li><li>Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+variation+of+fluorescence+protein+maturation+times+in+closely+related+Escherichia+coli+strains.">High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains.</a> PLoS One. 8, e75991 (2013).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Als gevolg van de intensieve industriële en academische onderzoeken van Proteolytische enzymen en de constante vraag naar snelle en betaalbare HTS-compatibele protease assay platformen dienovereenkomstig, hebben we ontwikkeld, een magnetische-gebaseerde kraal fluorescerende protease assay. De bepaling is gebaseerd op het gebruik van recombinante fusie-eiwitten die nieuwe alternatieven voor de wijd gebruikte synthetische peptide substraten kunnen.
In de ontwikkelde assay-indeling, worden de fusie-eiwit substraten geïmmobiliseerd op de oppervlakken van magnetische agarose Ni-chelaat-coated kralen. De bijlage van het substraat wordt verzorgd door de N-terminal zijn6 affiniteit tag van het fusie-eiwit, dat rechtstreeks aan een MBP tag om te vergemakkelijken de vouwen en verhogen de oplosbaarheid in water van het substraat13is gesmolten. De MBP wordt gevolgd door splijten sites van TEV PR en een protease van belang. De voormalige kan dienen als de breukzijde van een besturingselement in de assay, terwijl de laatstgenoemde kan worden verwerkt door de protease worden onderzocht. De breukzijde is verwisselbaar; een korte dsDNA reeks codering voor de breukzijde van belang kan worden ingevoegd in de flexibele 'klonen cassette' van de expressie plasmide afbinding. De fusie van recombinante eiwitten bevatten een zeer stabiele, monomere fluorescent proteïne-tag op de C-terminal, waarmee de opsporing van het eindpunt van de enzym-bevrijd, fluorescerend C-terminal splitsingsproducten vrijgegeven bij de Proteolytische splitsingsproducten ( Figuur 1A). De gezuiverde fluorescerende intact substraten opgelost in verschillende buffers worden ook gebruikt voor de kalibratie te beoordelen van de molaire concentratie van substraten en DISSOCIATIEPRODUCTEN daarvan. Bovendien, na fluorimetrie, kunnen de assay componenten worden geanalyseerd door SDS-PAGE, evenals. Beide native (nondenatured) en gedenatureerde fluorescerende eiwitten kunnen worden gevisualiseerd in de gel, onmiddellijk na de elektroforese of volgende in-gel renaturatie, respectievelijk. Deze extra procedure-in combinatie met een conventionele Coomassie briljant blauw kleuring-mei worden efficiënt gebruikt voor de verificatie van de resultaten van de test (figuur 1B).
De assay-procedure bestaat uit eenvoudige, gemakkelijk-aan-uit te voeren stappen in een laag-volume-indeling die volledig aangepast aan een automatische hoog-productie-omgeving worden kunnen. Zelfstandig uit te voeren de test handmatig of met een automatiseringssysteem, de volgende onderdelen van de test worden echter beschouwd als doorslaggevend en speciale aandacht nodig hebben tijdens het uitvoeren van de procedure. i) homogeniteit van de magnetische kraal oplossing. Een homogeen magnetisch kraal oplossing moet gebruikt worden tijdens de test, zowel in de reiniging en wassen stappen. Met name afhankelijk de betrouwbaarheid van protease tests sterk van goed aliquoting de voorraadoplossingen van substraat-ingeschrevenen magnetische kraal (SAMB). Teneinde de doeltreffendheid van de schorsing en de dispersie, is het aanbevolen om in te stellen van de kraal concentratie tussen 2% en 10% (v/v). Tijdens de bereiding van de monsters, het gebruik van buffers aangevuld met nonionic wasmiddel (zoals Triton X-100 of tween-20) maximaal 2% ook de naleving van de magnetische kralen van kunststof oppervlakken kan afnemen. De hechting van de parels aan de muren van monster flesjes kan worden vermeden als de kraal schorsingen zorgvuldig worden toegepast op de bodems van de flesjes in plaats van op de wanden van de buizen van de steekproef. De homogeniteit van de magnetische kralen tijdens de enzymatische reactie is ook essentieel en kan worden gewaarborgd door voortdurend schudden van de monsters bij 600 omwentelingen per minuut tijdens de incubatie. Kralen zijn goed verspreid in afgeronde of platbodem plastic waren, terwijl het gebruik van V-bodem flesjes wordt niet aanbevolen. Een suboptimaal resultaat veroorzaakt door onjuiste kraal homogenisering wordt weergegeven in figuur 4B. II) beëindiging van monsters van de reactie.  Een ander voordeel van de methode is dat de enzymatische reactie kan worden beëindigd zonder het gebruik van denaturatie warmtebehandeling of een potentieel storende chemische agentia15. De beëindiging kan eenvoudig door het scheiden van de magnetische kralen van het reactiemengsel, met behulp van een conventionele magnetische deeltjes concentrator worden uitgevoerd. Terwijl de verwijderde reactie buffer het actieve enzym en de gegenereerde fluorescerende splitsingsproducten van C-terminal bevat, blijven de uncleaved substraten verbonden met de kralen. Als gevolg van de aanwezigheid van het actieve enzym in de buffer van de reactie moet de procedure van de scheiding zorgvuldig worden uitgevoerd voor betrouwbare eindpunt detectie. Vóór het plaatsen van de steekproef flesjes in de concentrator, is het raadzaam toe te passen van een korte draai centrifugeren. Na het plaatsen van de buizen in de concentrator, verstrekken ten minste 15 s voor de kralen te verzamelen. Lichte beweging van het scheidingsteken heen-en-weer kan het vergemakkelijken van de collectie van de parels. Bedenk dat, tijdens een handmatig uitgevoerd scheiding, de beëindiging meestal langer dan de opening van de reacties duurt. Daarom verdient een circa 2 min geregistreerd vertraging tussen de inwijdingen als het dezelfde incubatietijd moet worden toegepast op alle monsters.
Het principe van de beschreven Proteolytische test is relatief eenvoudig; echter, de veelzijdigheid van het systeem wordt gegarandeerd door de structuur van de flexibele en stabiele ondergrond. De individuele optimalisatie van de test kan worden alleen beperkt door de verenigbaarheid van de parels van affiniteit met de toegepaste voorwaarden, reagentia en additieven. Wij vonden ook in overleg met de fabrikant protocol, dat de binding van de affiniteit van substraten op de Ni-NTA kraal oppervlakken aanzienlijk bij pH ≤ 6,515 verzwakt. Daarom wordt aanbevolen om het substraat blancomonsters parallel aan de monsters van de reactie van de toepassing, en het tempo van de spontane substraat dissociatie moet worden overwogen bij de beoordeling van de resultaten.
In die gevallen, waar magnetische-kraal-gebaseerde testen kunnen niet worden uitgevoerd als gevolg van het gebruik van componenten van de kraal-onverenigbaar of een lage pH, zijn vertering van de in-oplossing van de gezuiverde recombinante substraten ook toepasbaar. In deze gevallen de reactie mengsels kunnen door elektroforese worden geanalyseerd en de eiwitten kunnen worden gevisualiseerd in de gel op basis van het protocol beschreven. Om te onderzoeken proteolytic activiteit, in-oplossing spijsvertering en in-gel detectie van de eiwitten kunnen ook alternatieve instrumenten van fluorimetrie. Een nieuwigheid van het systeem ontworpen substraat is de toepassing van een in-gel renaturatie stap na de denaturering van SDS-pagina. Terwijl native (nondenatured) TL eiwitten hun fluorescentie tijdens elektroforese behouden, wordt de fluorescerende eigenschap afgeschaft na denaturatie (figuur 7B). Echter kan de fluorescentie van gedenatureerde eiwitten gedeeltelijk worden hersteld door de verwijdering van SDO van de gel. Dus, een scheiding van componenten van de reactie denatureren voorwaarden gebruiken niet alleen de fluorescentie-gebaseerd maar de moleculaire gewicht gebaseerde identificatie mogelijk maakt. Een ander voordeel van de tl in-gel-detectie in vergelijking met de analyse van een gel Coomassie gebeitste is dat de (native of renatured) fluorescente proteïnen in de gel op basis van hun fluorescentie gemakkelijk geïdentificeerd kunnen worden (Zie Figuur 7). Dit kan belangrijk zijn als decollete reacties worden uitgevoerd op monsters met nonfluorescent verontreinigingen of eiwitten zeer gelijkend op het molecuulgewicht van elkaar.
Protease testen gebruiken op dezelfde manier ontworpen substraten zijn al eerder gepubliceerd8,9,10, en hoewel de breukzijde van belang in die gevallen ook gelegen tussen een affiniteit tag was en een fluorescent proteïne, het systeem van de assay gepresenteerd hier niet alleen herhaalt de beschreven ideeën maar combineert de verschillende voordelen van de vorige platforms en voltooit u hen ook met verdere verbeteringen: i) het gebruik van een MBP fusie partner, ii) de aanwezigheid van een TEV PR controle breukzijde, iii) het gebruik van de nieuw aangelegde monomeer FPs, en iv) de toepassing van een uniek substraat kalibratieprocedure. De bepaling zelf is met name nuttig voor het enzym specificiteit en kinetische studies in een veilige, tijd - en kosten-efficiënte wijze, zonder de noodzaak voor dure instrumentation ontworpen. De methode is bedoeld om een geschikte en betaalbare tool voor zowel industriële en academische onderzoeksdoeleinden. Vanwege de flexibiliteit van het 'klonen 'cassette van de expressie plasmide mogelijk het systeem geschikt voor het snelle en goedkope generatie van recombinante substraat bibliotheken. De hierin beschreven test is een mogelijk instrument voor de uitvoering van substraat specificiteit, enzym mutagenese, en remming bestudeert en geven ook een alternatief instrument voor het uitvoeren van de enzymkinetiek. Het platform assay (van de verstoring van de bacteriële cel voor de bepaling van de kinetische parameters) kan worden aangepast aan een HTS en automatisering-gebaseerde omgeving en, potentieel, kan worden toegepast in industriële protease inhibitor screening en/of antivirale geneesmiddelen ontwikkeling. Bovendien, is de aanpassing van de assay voor concurrerende proteolyse ook in de toekomst onder ons laboratorium. In een dergelijke concurrerende assay, twee verschillende substraten-geheugen voor elke bevattende een verschillende breukzijde gesmolten tot een verschillende C-terminal fluorescerende tag-zijn bedoeling te onderzoeken van de voorkeur van de bestudeerde gelijktijdig in dezelfde decollete reactie worden gebruikt enzym voor de gegeven doel sequenties. Bovendien, het gebruik van een 96-wells-plaat aangepast assay formulier (Figuur 8) ook wordt geoptimaliseerd voor mutatie screening met behulp van een reeks van substraten met gemodificeerde decollete site sequenties in geval van cysteïne proteasen.

Proteolytische enzymen behoren tot de meest intensief onderzochte enzym groepen vanwege hun belang in de metabolische banen en industriële toepassingen, evenals. Hun sleutelrol in virale ziekten, de regulering van bloed stremmen, kanker, en cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekten maakt proteasen prominente doelstellingen op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling. De gedetailleerde karakterisering van substraat specificiteit en profileren van de Inhibitor van de omwenteling van het protease (PR) van belang is dus cruciaal en wordt bij voorkeur uitgevoerd door snelle kosten-efficiënte en robuuste biochemische tests1,2, 3.
Tegenwoordig, de overgrote meerderheid van in vitro protease tests toegepast op het gebied van drugontdekking voor samengestelde profielen zijn homogene, fluorescerend peptide gebaseerde, en high-throughput screening (HTS)-compatibele platforms4. Bovendien, gelabelde peptiden zijn niet alleen geschikt voor bibliotheek screening, maar ze bieden ook geweldige hulpmiddelen voor de bepaling van enzym kinetische parameters op de geselecteerde substraten. In andere gevallen, wanneer etikettering van het substraat niet mogelijk is, kunnen de scheiding gebaseerde tests een mogelijke oplossing om te beoordelen van de kinetische eigenschappen van Proteolytische reacties3bepalen.
In het algemeen, in vitro protease testen zijn gebaseerd op het gebruik van twee soorten substraat: korte peptides of hele eiwitten. In die gevallen, waar de splitsing van korte peptide reeksen reflecteren de splitsingsproducten eigenschappen voldoende, gelden de volgende standaard benaderingen: (i) onderzoek van substraten van de standaard eiwitten zoals geoxideerde insuline B-keten, (ii) testen verkrijgbare substraten voor andere proteasen, (iii) synthetische en fluorescently geëtiketteerde peptide bibliotheken gemaakt door combinatoriële chemie of (iv) screenen met behulp van genetische methoden, bijvoorbeeld de biologische weergeven technologieën5, 6. Naast de conventionele indeling, andere nieuwe platforms zijn ook beschikbaar voor substraat generatie (bijvoorbeeld de vorming van Proteoom afkomstige peptide bibliotheken7 of speciale subtypen van genetische methoden, zoals de recombinante fusie op basis van eiwitten substraten8,9,10,11,12).
Alle bovengenoemde substraat typen en testen hebben hun eigen voordelen en beperkingen, en de ontwikkeling van assay formaten combineren en/of verbetering van de voordelen van de bekende platformen is nog steeds in de vraag. Hier beschrijven we een protocol voor een scheiding gebaseerde fluorescerende protease-assay, die gebruik maakt van recombinante substraten. Deze fusie-eiwitten bestaan uit zijn6 en MBP tags gesmolten tot een controle breukzijde van TEV PR, die wordt gevolgd door de opeenvolging van de ondergrond van belang die rechtstreeks is verbonden met een C-terminal fluorescente proteïne (FP) (figuur 1A). Het klonen van een DNA-sequentie codeert voor een breukzijde van belang in het 'klonen 'cassette kan worden uitgevoerd door een enkele afbinding reactie in de plasmide van expressie, die heeft zijn gelineariseerde eerder door beperkingsendonucleases.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> Figuur 1: Beginsel van de fluorescerende protease-assay. (A) de schematische weergave van een fluorescerende substraat en haar decolleté door humaan immunodeficiëntie virustype 1 (HIV-1) protease wordt weergegeven. De pijl geeft de positie van de splitsing binnen de matrix/Eiwitmantel decollete site volgorde van HIV-1 protease (VSQNY * PIVQ). (B) de fluorescerende ondergronden kunnen worden gebruikt voor het analyseren van enzym reacties door de Ni-NTA magnetische-kraal-gebaseerde bepaling en polyacrylamide gelelektroforese, evenals, in het workflow diagram wordt weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Hoewel Proteolytische testen met behulp van soortgelijke recombinant eiwit substraten-met een tag affiniteit, een Proteolytische breukzijde en een fluorescente proteïne-have al beschreven8,9,10, het systeem gepresenteerd Hier voornemens is te integreren en te verbeteren op de voordelen van deze methoden. Een belangrijk verschil is dat de fusie-eiwit substraten in dit assay-platform zijn uitgerust met MBP te verbeteren eiwit oplosbaarheid13 en bevatten de breukzijde van een besturingselement voor TEV PRs. Voorts bevatten de substraten nieuwe generatie TL eiwitten, die zijn zeer stabiel en hebben een monomere vorm om te voorkomen dat substraat aggregatie. Naast de eerder gepubliceerde toepassing van mTurquoise2 - en mApple-gesmolten formulieren14laten hier ook we resultaten gegeven door het gebruik van recombinante substraat met een monomeer verbeterd fluorescerende label geel fluorescerende eiwit (mEYFP). Hierbij we aantonen dat de verenigbaarheid van het systeem met andere fluorescente proteïnen en sommige algemene soorten resultaten die kunnen worden verkregen door de protease-assay vertegenwoordigen.
De recombinante fusie-eiwitten zijn uitgedrukt in E. coli BL21(DE3) cellen en worden gebruikt als drager voor de assay in een nikkel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA)-magnetische-agarose-kraal-ingeschrevenen vorm bekleed. De C-terminal splitsingsproducten zijn bevrijd van het oppervlak van de parel in het supernatant op splitsing door de protease van belang. Na de scheiding van de bovendrijvende substantie (met het enzym en de splitsingsproducten) van de magnetische kralen, kan de fluorescentie worden gemeten om de eigenschappen van de splitsing van het enzym te bepalen. In tegenstelling tot de eerder beschreven methoden, zijn in het systeem hier, voorgesteld de bedragen van substraat en C-terminal DISSOCIATIEPRODUCTEN daarvan uniek gekwantificeerd op basis van een gedetailleerde substraat kalibratieprocedure. De assay-systeem kan worden ondersteund door een analyse van de SDS-pagina van de assay monsters; een latere tl in-gel visualisatie kan onmiddellijk na de elektroforese of na de in-gel-renaturatie van de nondenatured en gedenatureerde fluorescerende onderdelen, respectievelijk14worden toegepast.
De flexibiliteit en de structuur van de 'klonen cassette' toestaan een tijd - en kosten-efficiënte invoeging van een breed scala van sequenties in de constructie en, dus, bevordert de generatie van substraat bibliotheken. Aangezien alle assay stappen automatisering en HTS-compatibel met zijn kunnen het systeem vooral aantrekkelijk voor, bijvoorbeeld, protease specificiteit metingen en mutagenese studies, of het kan ook worden effectief gebruikt voor industriële protease inhibitor screening en/of antivirale Geneesmiddelenontwikkeling, als goed.
Enzym kinetische parameters (kkat, Km) kunnen worden bepaald door de ontwikkelde scheiding gebaseerde bepaling; het kan dus geschikt individuele enzym kinetische metingen, zoals het tijdsverloop, afhankelijk van de ondergrond en remming studies uit te voeren. Dit bewijst dat de fusie van recombinante eiwitten substraten goede alternatieven voor de vaak gebruikte synthetische oligopeptide substraten bieden, en vanwege hun hoge gelijkenis met de polyprotein substraten, zij vertegenwoordigen de natuurlijk voorkomende enzym-substraat-interacties nauwkeuriger.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10K Amicon tubes</td>
			<td style="width:269px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC501096</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">M6250</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;">1610148</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">100063</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Agarose</td>
			<td style="width:269px;">SERVA</td>
			<td style="width:137px;">11404.04</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Alpha Imager HP gel documentation system</td>
			<td style="width:269px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A3678</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A9518</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">392185</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Black half-area plates</td>
			<td style="width:269px;">Greiner bio-One</td>
			<td style="width:137px;">675086</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">B0126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">CutSmart buffer (10x)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7204S</td>
			<td style="width:191px;">For plasmid linearization (step 1.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:269px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:137px;">DR-45M</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">M0303L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dynamag-2&#160;magnetic particle&#160;concentrator</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12321D</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Escherichia coli BL21(DE3) competent cells&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">C600003</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethanol</td>
			<td style="width:269px;">Merc-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">100983</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">798681</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7024S</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycerol</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">356350</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">G7126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">High-Speed Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:269px;">GeneAid</td>
			<td style="width:137px;">PD300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Imidazole</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">56750</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">AM9464</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Jouan CR 412 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Jouan</td>
			<td style="width:137px;">CR412</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Labinco LD-76 Rotator&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Labinco</td>
			<td style="width:137px;">7600</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L3022</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Lysozyme&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L6876</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:269px;">Scharlau</td>
			<td style="width:137px;">MA0036</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MERCK eurolab ultrasonic bath</td>
			<td style="width:269px;">MERCK</td>
			<td style="width:137px;">USR54H</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Millifuge Eppendorf spin centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">CT10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T9281</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NheI-HF restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R3131L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nickel(II) sulfate (NiSO4)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">656895</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ni-NTA magnetic agarose beads&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">36113</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">OS-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PacI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R0547L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PageBlue Protein Staining Solution&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">24620</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P7626</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Protein Lobind Micro-centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">22431102</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:269px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Snijders Press-to-Mix shaker&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Gemini</td>
			<td style="width:137px;">34524</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-acetate trihydrate</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S7670</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-chloride</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S9888</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S5881</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">S7563</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:269px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M180A</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Thermo shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">TS-100</td>
			<td style="width:191px;">with SC-24 accessory block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tris</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T1503</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tween 20</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P2287</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter</td>
			<td style="width:269px;">Wallac Oy, Turku, Finland</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation

Proteasen zijn intensief bestudeerde enzymen als gevolg van hun essentiële rol in verschillende biologische trajecten van levende organismen en pathogenese; zij zijn dus belangrijk drug targets. We hebben een magnetische agarose-kraal-gebaseerde assay platform ontwikkeld voor het onderzoek van proteolytic activiteit, die is gebaseerd op het gebruik van recombinante fusion eiwit substraten. Om aan te tonen het gebruik van dit systeem assay, wordt een protocol gepresenteerd op het voorbeeld van humaan immunodeficiëntie virustype 1 (HIV-1) protease. Het geïntroduceerde assay-platform kan efficiënt worden gebruikt in de Biochemische karakterisering van proteasen, met inbegrip van enzym activiteit metingen in mutagenese, kinetic, remming of specificiteit studies, en het mogelijk geschikt voor high-throughput substraat screening of kan worden aangepast aan andere Proteolytische enzymen.
In deze bepaling-systeem, de toegepaste substraten bevatten N-terminal hexahistidine (zijn6) en maltose-bindende eiwit (MBP) tags, decollete sites over tabak etch virus (TEV) en HIV-1 proteasen en een fluorescente proteïne C-terminal. De substraten kunnen worden efficiënt geproduceerd in Escherichia coli cellen en gemakkelijk gezuiverd met behulp van nikkel (Ni) - chelate - gecoate kralen. Tijdens de test leidt het Proteolytische splijten van substraten kraal-ingeschrevenen tot de vrijlating van fluorescerende decollete fragmenten, die kan worden gemeten door fluorimetrie. Bovendien kunnen decollete reacties worden geanalyseerd door natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina). Een protocol voor de renaturatie in-gel van assay componenten wordt ook beschreven, zoals gedeeltelijke renaturatie van fluorescente proteïnen in staat hun detectie op basis van het molecuulgewicht en fluorescentie stelt.

Figuur 1A blijkt de schematische structuur van een representatieve fluorescerende recombinant eiwit substraat die kan worden verwerkt door HIV-1 PR op de volgorde van de site specifieke decollete. Figuur 1B vertegenwoordigt de substraat-productie en hun mogelijke toepassingen in protease testen, inclusief Ni-NTA magnetische-kraal-gebaseerde bepaling en/of pagina.
Voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens door fluorimetrie, is een kalibratieprocedure vereist om te bepalen welke hoeveelheden TL substraten en DISSOCIATIEPRODUCTEN daarvan. Hiervoor de intensiteitswaarden van de fluorescentie van de verschillende ondergronden in de verschillende buffer voorwaarden moeten worden gemeten en moeten worden gecorreleerd met hun concentraties in het getest concentratiebereik (Figuur 3). De waarden van de helling van de kalibratiekrommen kunnen worden toegepast om te bepalen van de bedragen van substraten en DISSOCIATIEPRODUCTEN daarvan in de assay monsters. De hellingen van de kalibratiekrommen zijn onafhankelijk van het decolleté site sequenties ingevoegd in de substraten (tabel 11) en potentieel kunnen worden gebruikt voor een serie van substraten gesmolten tot dezelfde soort fluorescente proteïne. Zoom-in grafieken worden weergegeven voor alle lineaire regressies, voor een vergroting van de lagere concentratie bereiken evenals (Figuur 3). Het is belangrijk op te merken dat de kalibratie zorgvuldig worden uitgevoerd moet, omdat een goede verdeling van de gegevenspunten vereist voor een betrouwbare kalibratie wordt. Om deze reden, wordt tweeledig seriële verdunning toegepast ter voorbereiding van de monsters voor kalibratie, omdat de R-waarde van2 geeft een goede correlatie tussen de concentratie van fluorescente proteïne en fluorescentie alleen als een voldoende aantal gegevenspunten zijn gebruikt ter dekking van het hele concentratiebereik. Bovendien experimentele fouten kunnen sterk van invloed zijn op de nauwkeurigheid van de kalibratie; Dus, een grafische evaluatie van de regressielijnen kan ook nodig zijn.
Een verscheidenheid van enzymatische metingen kan worden uitgevoerd door de protease-assay, met inbegrip van een onderzoek naar het effect van de concentratie van het substraat op reactie snelheid (figuur 4A). Door middel van niet-lineaire regressie, kunnen de gegevens worden gebruikt om te bepalen van enzym kinetische parameters (bijvoorbeeld vmax en Km). Een schorsing onvoldoende kraal en dispersie en de beëindiging van een ongepaste reactie kunnen veroorzaken suboptimaal resultaten (figuur 4B), die niet geschikt zijn voor de berekening van betrouwbare enzym kinetische waarden.
Een afhankelijkheid van de formatie van het product op tijd kan worden bepaald door de bepaling (figuur 5A) (bijvoorbeeld tijdens het optimaliseren van de parameters van de reactie decolleté). Enzymactiviteit in aanwezigheid van een inhibitor van de omwenteling kan ook worden onderzocht (figuur 5B) voor de bepaling van de concentratie van de actieve enzym en remmende-constante. Met behulp van dezelfde methode, kunnen effecten van andere remmers ook worden gescreend door de bepaling.
De protease-bepaling is handig bij het onderzoeken van de effecten van de pH op enzymactiviteit, evenals. Figuur 6A vertegenwoordigt de afhankelijkheid van de enzymactiviteit van de pH door het voorbeeld van TEV PR, die een brede optimale pH bereik (pH 6-9 heeft). Als de afhankelijkheid van de pH van de enzymactiviteit wordt bestudeerd (of enzymen hebben een zure pH optimaal moeten worden gemeten), is het noodzakelijk te overwegen dat de binding van de affiniteit van recombinante substraten voor de kralen beperkt met een licht zure pH worden kan. Een verhoogde dissociatie van de substraten uit de kralen (figuur 6B) kan leiden tot een vervorming van de resultaten van de test. Om te overwegen de spontane substraat dissociatie van de parels, moeten de waarde die is gemeten voor reactie monsters worden gecorrigeerd door degenen onder B monsters.
Figuur 7 laat zien dat de nondenatured fluorescerende eiwitten kunnen worden onderscheiden in de gel op basis van hun kleuren, met behulp van blauw licht transillumination (figuur 7A). Als de bepaling van het molecuulgewicht van substraten/decollete fragmenten nodig is, kan denaturerende omstandigheden ook worden gebruikt voor de bereiding van de monsters, omdat fluorescente proteïnen kunnen gedeeltelijk renatured in de gel, en kunnen worden gedetecteerd door UV belichting (Figuur 7B) of door Coomassie kleuring (Figuur 7 c). Als de R-monsters worden geanalyseerd, zijn alleen de C-terminal splitsingsproducten zichtbaar (Figuur 7 c), terwijl de N-terminale decollete fragmenten en de uncleaved substraten verbonden met de kralen blijven. Af en toe, eiwitten kunnen gedeeltelijk worden gedenatureerd ondanks het gebruik van nondenaturing voorwaarden (Figuur 7 c), en terwijl de nondenatured eiwitten meer overvloedig zijn, gedenatureerde formulieren zijn ook in het monster aantoonbaar. Dit verschijnsel heeft geen invloed op de opsporing van Proteolytische splijten, maar moet worden beschouwd in het geval van kwantitatieve densitometrie van nondenatured monsters.
Hoewel de gedetailleerde beschrijving wordt weergegeven alleen voor een 2 mL-buis-gebaseerde assay, kan de bepaling worden aangepast voor een 96-wells-plaat-gebaseerd systeem (Figuur 8), dat al met succes in ons laboratorium getest is (niet afgebeeld). De 96-wells-plaat aangepast formaat is volledig compatibel met de fluorimetrische en elektroforetische analyses, alsook, en de verkregen gegevens kunnen ook worden geëvalueerd op basis van de in dit artikel beschreven methoden.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> Figuur 3 : Kalibratiekrommen. Representatieve substraat kalibratiekrommen worden gedemonstreerd met het voorbeeld van twee recombinante substraten gesmolten op verschillende C-terminal fluorescerende Labels: (A en B) zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 en (C en D ) Zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zoom-in cijfers staan ook voor de lineaire regressie van gegevenspunten in de 0-0.005 mM substraat concentratiebereik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> Figuur 4 : Bepaling van de kinetische parameters enzym. Substraat-afhankelijke kinetische metingen werden uitgevoerd door HIV-1 PR (op een actieve eindconcentratie van 41,2 nM). De beginsnelheid waarden werden uitgezet tegen de concentratie van het substraat en een Michaelis-Menten niet-lineaire regressie-analyse werd uitgevoerd. De foutbalken vertegenwoordigen SD (n = 2). (A) A representatieve optimaal resultaat wordt weergegeven met het voorbeeld van zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple fusion eiwit substraat. (B) een representatieve suboptimaal resultaat blijkt ook voor de zijn6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 substraat, waar het vaststellen van de juiste substraat concentraties problematisch vanwege een onvoldoende homogenisering van de stockoplossing SAMB was , terwijl relatief hoge fouten werden veroorzaakt door onjuiste reactie opzegging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> Figuur 5 :-Tijdsverloop en remmende studie. (A) Zijn 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP gekloofd recombinante fusion eiwit substraat (bij een eindconcentratie van 0.00326 mM) werd door HIV-1 PR (op een actieve eindconcentratie van 41,2 nM), en de vrijlating van fluorescerende PIVQ-mEYFP Proteolytische fragmenten werd gemeten aan een tijdsverloop analyses uit te voeren. De metingen werden uitgevoerd bij vijf verschillende tijdstippen. De foutbalken vertegenwoordigen SD (n = 2). (B) zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP werd gebruikt als substraat (bij 0.0015 mM) om te bepalen van het remmende effect van amprenavir op de activiteit van HIV-1 PR (met een totale concentratie van 163,8 nM). Door het uitzetten van de gegevens, de helft maximale remmende concentratie (IC50) kan worden geëvalueerd en de concentratie van de actieve enzym (een actieve eindconcentratie van 41,2 nM) van het toegepaste HIV-1 PR kan ook worden berekend op basis van de remming curve. De foutbalken vertegenwoordigen SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> Figuur 6 : Bestuderen van afhankelijkheid van de enzymactiviteit en spontane substraat dissociatie op pH. (A) het zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substraat (in 0.033 mM) werd gebruikt voor het meten van de enzymactiviteit van TEV PR (op een totale eindconcentratie van 91.42 nM) in decollete buffer ingesteld op een verschillende pH, tussen het bereik van 6,5-8,5. De foutbalken vertegenwoordigen SD (n = 2). De uitgezette gegevens al eerder gepubliceerd14. (B) op basis van de waarden van de relatieve intensiteit van de fluorescentie van het substraat blancomonsters, de spontane dissociatie van het zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substraat (0.033 mM) van de magnetische kralen werd bestudeerd door middel van splijting buffer met een verschillende pH tussen 6.0-8.5. De uitgezette gegevens al eerder gepubliceerd14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> Figuur 7 : Opsporen van eiwitten in de gel door verschillende methoden. (A) Uncleaved en fusion HIV-1 PR-verteerd eiwit substraten na nondenaturing monstervoorbereiding waren gevisualiseerd door blauw licht transillumination na SDS-pagina. De splijting reactie werd uitgevoerd door vertering-oplossing. (B) onmiddellijk na de pagina alleen nondenatured eiwitten kon worden opgespoord in de gel door UV belichting, terwijl na de verwijdering van SDS, de eerder gedenatureerde fluorescente proteïnen werd gedeeltelijk renatured en aantoonbaar. De monsters werden bereid uit het supernatant van de Ni-NTA magnetische-kraal-gebaseerde bepaling. (C) Coomassie kleuring kan ook worden gebruikt voor de detectie van eiwit, na de renaturatie in-gel. De SDS-heden in de gel-mei veroorzaken de gedeeltelijke denaturatie van de inheemse proteïne, maar in native monsters, de nondenatured vormen meer overvloedig zijn. De monsters werden bereid uit het supernatant van de Ni-NTA magnetische-kraal-gebaseerde bepaling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> Figuur 8 : 96-wells plaat gebaseerde aanpassing van het platform assay. (A) de bepaling kan worden uitgevoerd, niet alleen in 2 mL tubes, maar in de wells van een 96-wells-plaat, evenals. Hier laten we zien de schematische weergave voor de toepassing van de bepaling te bestuderen van de specificiteit van een fictieve protease met behulp van een reeks van fluorescerende ondergronden, dat eventueel wild-type (wt) of gemuteerde (mut-1 aan mut-4) decolleté site sequenties. Voor de behandeling van de magnetische kralen, is een 96-Wells compatibel magnetische deeltjes concentrator (MPC) in de experimenten moeten worden gebruikt. Alle aangegeven volumes zijn gerelateerd aan een enkel putje. Om te vergelijken de efficiëntie van de splitsing van de verschillende substraten, kan substraat conversie worden beoordeeld vanuit het percentage substraat-blanco-gecorrigeerd RFU waarden van de reactie monsters, gezien de RFU substraat-blanco-gecorrigeerde waarden van de verwante substraat controlemonsters als 100. (B) na de fluorimetrie, de gescheiden supernatant van de bepaling die monsters kunnen ook worden geanalyseerd door de pagina en de fluorescente proteïne componenten kan worden geanalyseerd rechtstreeks of na gel-renaturatie in geval van nondenaturing en denatureren monster voorbereiding, respectievelijk. De drie verschillende assay monster typen zijn ook geïllustreerd in elke figuur: C = substraat control, B = substraat leeg, en R = reactie. Substraat controlemonsters in elutie buffer, terwijl het substraat leeg en de reactie monsters zijn in decollete buffer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Buffer</td>
			<td>Fluorescent proteïne</td>
			<td>AVK % van skipistes (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elutie</td>
			<td rowspan="2">mTurquoise2</td>
			<td>6.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>Decolleté</td>
			<td>9.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elutie</td>
			<td rowspan="2">mApple</td>
			<td>10.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Decolleté</td>
			<td>12.68</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 11: coëfficiënt van afwijkingswaarden (AVK %) van de hellingen van de kalibratiekrommen substraat. Om te testen of de fluorescentie van de recombinante eiwitten substraten afhankelijk van de ingevoegde breukzijde is, werden kalibraties uitgevoerd door reeks mApple - en mTurquoise2-gesmolten substraten (zes varianten voor elk, met verschillende breukzijde sequenties van HIV-1 protease), beide in elutie en decolleté buffers. Vonden wij dat CV % waarden van de hellingen tot 15% in alle gevallen, wat inhoudt dat een enkele substraat kalibratie kan worden gebruikt voor de evaluatie van de verschillende metingen uitgevoerd door substraat varianten met dezelfde fluorescerende tag.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

Hier presenteren we de gedetailleerde procedure van een onlangs ontwikkelde protease assay platform met behulp van N-terminal hexahistidine/maltose-bindend-proteïne en fluorescente proteïne-gesmolten recombinante substraten gekoppeld aan het oppervlak van nikkel-nitrilotriacetic zure magnetische agarose kralen. Een latere in-gel-analyse van de monsters van de assay gescheiden door elektroforese van het gel van natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide is ook gepresenteerd.

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Proteases zijn een van de meest onderzochte groepen biomoleculaire ondersteuning in academisch en industrieel onderzoek. Hun krachtige rol in verschillende fysiologische en pathologische processen maakt hen een prominent doelwit op het gebied van drugsontdekking ook. Wat hun intensieve onderzoek betreft, is er een grote en continue vraag naar de ontwikkeling van tijd- en kostenbesparende screenings-compatibele fluorescentieprotease-testplatforms.Hier willen we een protocol introduceren voor de toepassing van een op scheiding gebaseerd high-throughput screening-compatible fluorescentietestplatform met behulp van zowel mTurquoise2- als mApple-gesmolten recombinant fusion protease substraten. Daarnaast willen we een methode demonstreren voor de in-gel renaturatie van de substraten en de decolletéfragmenten van de testmonsters na het denatureren van SDS-PAGE. Alle experimenten worden uitgevoerd op het voorbeeld van HIV-1 virus protease.De uitdrukking plasmid draagt de codering sequentie van een hexa histadine affiniteit tag en een maltose bindende fusie-eiwit, gevolgd door een controle decolleté site van tabak etsvirus protease, een klonen cassette, en een C-terminal tl-fluorescerend eiwit. Lineariseren van de expressie plasmid door PacI en NheI beperking endonucleases. Voer de annealing van de Escherichia coli codon geoptimaliseerd vooruit en omgekeerde oligonucleotide primers die code voor het substraat sequentie van belang en flank door PacI en NheI samenhangende uiteinden.Voer de invoeging van de geannealed primers in de lineaire expressie plasmid door ligatie. Voor eiwitexpressie, transformeren BL21(DE3)bevoegde cellen door de ligatie mengsel. De fluorescerende eiwitten zullen zich pas na een succesvolle ligatie in hetzelfde open leesframe bevinden met de N-terminal fusion tags.Een paar dagen na de transformatie, de kolonies met de uitdrukking plasmid codering van de ingevoegde decollete site van belang zal zichtbare fluorescentie met of zelfs zonder gebruik van een Dark Reader blauwe transilluminator. Voeg 10 microliter glycerol voorraad van de BL21 (DE3)cellen die de expressie plasmid codering voor de decolleté site sequentie van belang aan vijf milliliter LB medium met 100 microgram per milliliter ampicilline in een 50 milliliter centrifuge buis. Broed de suspensie op 37 graden gedurende 15 uur, terwijl voortdurend schudden.Breng vijf milliliter bacteriële cultuur naar 50 milliliter vers LB medium met 100 microgram per milliliter ampicilline. Laat de cellen groeien op 37 graden tot een absorptie van 0,6 tot 0,8 op 600 nanometer golflengten. Op dit punt, induceren eiwitexpressie door de toevoeging van IPTG.Hierna, broeden de cultuur voor drie uur op 37 graden, terwijl continu schudden. Breng na de incubatie 25 milliliter van de cultuur over in schone 50 milliliter centrifugebuizen en oogst de cellen door middel van centrifugatie. Gooi de supernatant en bewaar de bacteriële cel pellets op min 70 graden gedurende ten minste een uur.Celpellets die de met succes uitgedrukte fluorescerende eiwitten bevatten, vertonen duidelijk een fluorescentie met of zelfs zonder gebruik te maken van een Dark Reader blauwe transilluminator. Leg de bevroren celkorrel op ijs en laat het 15 minuten ontdooien. Voeg twee milliliter lyse buffer aan de pellet en schort de cellen.Voeg hierna proteaseremmer toe, bevrijd de suspensie door lyzozyme en DNase, schort de cellen op en broed de suspensie op ijs gedurende 15 minuten uit. Breng twee keer een milliliter schorsingen in 1,5 milliliter microcentrifuge buizen en sonicate de schorsingen gedurende drie minuten in rondes van 10 seconden van sonicatie en vijf seconden pauze. Centrifugeren de buizen op 10,000 g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Gerooide bacteriële cellysates die het fluorescerende substraat van belang bevatten, vertonen zichtbare fluorescentie met of zelfs zonder gebruik te maken van een Donkerlezersblauwe transilluminator. De procedure van de ontwikkelde proteasetest begint met de bereiding van de testmonsters. Ten eerste worden de recombinant substraten geïncubeerd met de affiniteit magnetische kralen, en de substraat-attached magnetische kralen, afgekort als SAMBs, worden gevormd.SAMB's worden meerdere malen gewassen, en ten slotte wordt de SAMB-voorraadoplossing voorbereid door de aliquoting waarvan testmonsters worden gemaakt. De reacties worden geparatialiseerd door de toevoeging van de protease oplossing. Bij decolleté door de protease worden de proteolytische fragmenten losgelaten in het supernatant.De reactie wordt beëindigd door de scheiding van de magnetische kralen van de reactiebuffer die de fluorescerende decolletéproducten en het enzym bevat. De supernatants worden toegepast op de putten van een microtiterplaat en de fluorescentie wordt bepaald door fluorimetrie. Kalibratiecurven worden gegenereerd met behulp van gezuiverde fluorescerende substraten opgelost in elke testbuffers.De concentratie van de C-terminal fluorescerende decolletéproducten en die van het toegepaste substraat in de testmonsters worden bepaald op basis van de helling van de kalibratiecurven. Plaats de buis met nieuwe of gerecycleerde nikkel-NPA magnetische agarose kralen in een magnetische deeltjesconcentraator. Kralen kunnen aan de muur en/of in het deksel van de microcentrifugebuis blijven plakken.Draai daarom de concentrator ondersteboven in elke richting om ervoor te zorgen dat alle kralen worden verzameld. Verwijder de supernatant en gooi het weg. Voeg 1,8 milliliter lyse buffer aan de kralen en verwijder de gesloten buizen van de concentrator.Hang de kralen in de buis door de buis ondersteboven te schudden en/of te draaien totdat kralen volledig homogeen zijn. Plaats de buizen terug in de concentrator en zet hem ondersteboven in elke richting om ervoor te zorgen dat alle kralen worden verzameld. Open de buis en gooi de supernatant weg.Voeg gewist bacteriesteriel lysaat toe dat het substraat van belang bevat en verwijder de gesloten buis van de concentrator. Draai de buizen ondersteboven totdat de kralen volledig homogeen zijn en draai de buizen door rotator, langzaam, bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. SAMB's vertonen zichtbare fluorescentie met of zelfs zonder gebruik te maken van een Donkerlezersblauwe transilluminator.Was de SAMB's drie keer met 1,8 milliliter 1%Tween 20, wasbuffer en decolletébuffer. Voeg decolletébuffer toe aan de gewassen SAMB's om een SAMB-voorraadoplossing te creëren. Bij gebruik van twee milliliter eiwitarme microcentrifugebuizen bedraagt het volume van de toegepaste decolletébuffer maximaal 1,9 milliliter.Na toevoeging van de buffer, niet schudden of draai de buis ondersteboven. Sluit de buis en verwijder deze uit de concentrator. Bereid twee milliliter eiwitarme microcentrifugebuizen voor de testmonsters.Hang de SAMB-voorraadoplossing op totdat deze volledig homogeen is en meet de hoeveelheid substraat die in de reacties moet worden geanalyseerd door de SAMB-voorraadoplossing onmiddellijk over te brengen naar de monsterfliners. Het volume van de over te brengen SAMB-voorraadoplossing wordt aanbevolen om 25 tot 300 microliter te zijn, maar het moet worden ingesteld op basis van het individuele experimentele ontwerp. Plaats de monsterbuizen met de samb-suspensies in de concentrator.Verwijder voorzichtig de supernatant uit de SAMB's en gooi het weg. Haal de buizen uit de concentrator en voeg voorzichtig de reactiebuffer toe aan de SAMB's. Het volume van de toegevoegde reactiebuffer moet worden berekend volgens het individuele experimentele ontwerp, maar het wordt aanbevolen om het uiteindelijke volume van het reactiemengsel in te stellen tussen 50 en 150 microliter als twee milliliterbuizen worden gebruikt.Sluit de deksels van de buizen. Nu zijn de monsters klaar om geparatialiseerd te worden. Voeg de enzymoplossing toe aan de reactiemonsters.Roer de kralen voorzichtig door voorzichtig bewegen de buizen en plaats de buizen onmiddellijk in de reeds schuddende thermoshaker. Voeg in het geval van ondergrondse blancomonsters en substraatcontrolemonsters respectievelijk de decolletébuffer en elutiebuffer toe. Dertig seconden voor het einde van de incubatie, neem het monster uit de thermoshaker en draai het snel.Plaats de buis op de concentrator en laat de buis 15 seconden staan. De verzameling van de SAMB's kan worden vergemakkelijkt door de concentrator licht heen en weer te bewegen. Open het deksel en breng de supernatant voorzichtig in een plaat of een nieuwe buis.Raak de geconcentreerde kralen niet aan bij de punt van de pipet. De verzamelde supernatant van de substraat controle monsters en de reactie monsters met een hoge mate van decollete kan zichtbare fluorescentie vertonen met of zelfs zonder gebruik te maken van een Dark Reader blauwe transilluminator. Breng twee keer 30 microliter van de gescheiden monstersupernatants over in een zwarte half-gebied microplaat.Meet de fluorescentie met behulp van fluorimeter met behulp van de juiste filters volgens het toegepaste fluorescerende eiwit. Voor de zuivering van de fluorescerende substraten, bereid dezelfde oplossing als eerder beschreven, en gooi de supernatant. Voeg 400 tot 600 microliters elutie buffer aan de SAMBs en draai de buizen door rotator langzaam bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Breng het eluaat over in nieuwe eiwitarme microcentrifugebuizen. Het toont duidelijk zichtbare fluorescentie met of zonder het gebruik van een Dark Reader blauwe transilluminator. Na zuivering, bufferuitwisseling en het meten van het eiwitgehalte bereidt u een tweevoudige seriële verdunning in ten minste acht stappen, zowel van de elutie-buffer-en de decolleté-buffer-opgeloste substraatoplossingen, met behulp van elutie of decolletébuffer voor verdunning respectievelijk.Breng 30 microliter van elk verdunningspunt over in een zwarte half-gebied microplaat. Meet de fluorescentie met behulp van fluorimeter met behulp van dezelfde instellingen die werden toegepast in de meting van de test monster supernatants. Als voorbeeld voor gegevensverwerking werden de substraatafhankelijke kinetische metingen van HIV-1 protease uitgevoerd op een mTurquoise2-gesmolten vorm van het recombinant substraat dat de decolletésite codeert tussen de matrix en de capsid-eiwitten in de natuurlijke gapic protein precursor.Plot de gecorrigeerde relatieve fluorescentie intensiteit waarden tegen de molaire concentratie van de gezuiverde substraten, los ofwel het decolleté of elutie buffer, en lineaire regressie uit te voeren. Bereken de molaire concentratie van de C-terminal decolletéproducten in de reactiemonsters met behulp van de helling van de op decolleté-buffer gebaseerde kalibratiecurve. Bereken ook de toegepaste substraatconcentratie in de reactiemonsters op basis van de molaire concentratie van het eluted substraat in de substraatcontrolemonsters met behulp van de helling van de op elutiebuffer gebaseerde kalibratiecurve.De initiële snelheidswaarden werden berekend op basis van de hoeveelheid C-terminal decolletéfragmenten en vervolgens uitgezet tegen de toegepaste substraatconcentratie. Ook werden de kinetische parameters bepaald door Michaelis-Menten niet-lineaire regressieanalyse. Na het uitvoeren van de nikkel-NTA magnetische kraal-gebaseerde test, de assay supernatants kunnen worden geanalyseerd door polyacrylamide gel elektroforese ook.Naast de analyse van de testmonsters is het echter ook mogelijk om de gezuiverde fluorescerende substraten en/of de decolletéfragmenten na in-solution spijsvertering te analyseren. Voor in-solution spijsvertering, aliquote de gezuiverde fluorescerende substraten worden verteerd opgelost opgelost in decolleté buffer in 1,5 milliliter microcentrifuge buizen, en voeg het enzym oplossing aan de monsters. De monsters uitbroeden volgens het experimentele ontwerp en beëindig de reacties volgens de procedure van de monstervoorbereiding voor PAGE.Voor niet-gedenatureerd monsterbereiding, meng de monsters te analyseren met niet-denatuurde monster laden buffer met geen reducerende middelen. Meng in het geval van gedenatureerd monsterpreparaat de te analyseren monsters met deturingsbuffer voor het laden van het monster en stel de monsters gedurende 10 minuten bloot aan een warmtebehandeling bij 95 graden. Breng de niet-gedenatureerde en gedenatureerde monsters aan in de putten van de SDS-polyacrylamidegel en voer elektroforese uit.Haal de gelcassette uit de loopmodule. Niet-gedenatureerde monsters zijn al zichtbaar in de gel, zelfs met het blote oog of met de Dark Reader blauwe transilluminator. Om de fluorescerende componenten van de gedenatureerde monsters op de transilluminator te detecteren, voert u de in-gelrenaturatie uit door de SDS uit de gel te wassen.Voeg 100 milliliter gedestilleerd water toe aan de gel en spoel het minstens 30 minuten af. Visualiseer de fluorescerende eiwitten door de onbevlekte gel op de Donkerlezer blauwe transilluminator te plaatsen. De recombinant fluorescerende fusie-eiwitten werden ontworpen om te worden gebruikt als substraten in proteolytische testen.Bij decolleté door de protease op de specifieke decolletésite komt het C-terminale fluorescerende decolletéfragment vrij en kan de fluorescentie worden gedetecteerd. Hun gebruik in nikkel-NTA magnetische kraal-gebaseerde test en de fluorescerende detectie door PAGINA analyse zijn geoptimaliseerd met behulp van HIV-1 protease. Het ontwikkelde testplatform kan echter ook geschikt zijn voor andere proteases.Kalibratiecurven van de gezuiverde substraten opgelost in decolleté of elutiebuffer worden geïllustreerd op de voorbeelden van zowel mTurquoise2-als mEYFP-gesmolten vorm van de recombinant substraat die de decolletézijde tussen de matrix en de capsid-eiwitten van het natuurlijke HIV-anechoïsche eiwit codeert. De op nikkel-NTA magnetische kraal gebaseerde test is een nuttig hulpmiddel om het effect van substraatconcentratie op de reactiesnelheid te onderzoeken en maakt daardoor ook de bepaling van de kinetische parameters van het enzym zoals Vmax en Km mogelijk. Diagram A toont een optimaal resultaat verkregen na een met succes uitgevoerde analyse van substraatafhankelijke activiteit op een mApple-gesmolten substraat.Diagram B daarentegen geeft een suboptimaal resultaat wanneer de ontoereikende homogenisatie van de SAMB-voorraadoplossing problemen veroorzaakt bij het instellen van de juiste substraatconcentraties, terwijl onjuiste beëindiging van de reactiemonsters resulteert in relatief hoge fouten. De test biedt ook een geschikt hulpmiddel voor het uitvoeren van tijd-cursus en remmende studies ook. Diagram A toont de tijdafhankelijkheid aan van het proteolytische decolleté van HIV-1 protease op een door mEYFP gesmolten substraat, terwijl diagram B het remmende effect van amprenavir op de decolletéreactie vertegenwoordigt.Aan de hand van de remmende studie kunnen zowel de actieve enzymconcentratie als de remmende constante worden bepaald. De test kan ook worden geoptimaliseerd om de afhankelijkheid van enzymactiviteit op pH te bestuderen, omdat het wordt weergegeven door diagram A op het voorbeeld van tabakseftvirusprotease. Diagram B geeft een beperking van de test door pH aan en toont aan dat neutrale of licht alkalische pH volledig compatibel is met de metingen, terwijl zure pH spontane dissociatie van de substraten van het oppervlak van de magnetische kralen vergemakkelijkt.De huidige figuur toont de gezuiverde intacte fluorescerende substraten, de fluorescerende C-terminal decolletéfragmenten, gegenereerd door in-oplossing vertering door HIV-1 protease. De fluorescerende componenten kunnen worden gedetecteerd in de SDS-bevattende polyacrylamidegel door blauw lichttransilluminatie direct na de elektroforese als niet-denatureringsvoorwaarden werden toegepast tijdens de monsterbereiding. De verschillende fluorescerende eiwitten kunnen worden onderscheiden op basis van hun kleur.Na de magnetische kraal-gebaseerde test, de niet-gedenatureerde fluorescerende eiwitten in het monster supernatants kunnen worden gedetecteerd in de gel door UV-verlichting ook. Als daarentegen denatureringsvoorwaarden worden toegepast tijdens de monsterbereiding, kunnen de gedenatureerde eiwitten niet onmiddellijk na de SDS-PAGINA in de gel worden gedetecteerd. Echter, de gedenatureerde fluorescerende eiwitten kunnen gedeeltelijk worden herrenatured door de verwijdering van de SDS uit de gel en detecteerbaar worden.Daarom wordt de SDS-pagina gevolgd door de in-gel renaturatieprocedure. Het renaturatievermogen van de fluorescerende eiwitten maakt hun identificatie niet alleen mogelijk op basis van hun fluorescentie, maar ook op basis van hun moleculaire gewicht. Hier demonstreerden we het protocol voor het gebruik van ons recent ontwikkelde magnetische kraalgebaseerde fluorescerende protease-testplatform.We hebben aangetoond dat dit systeem wordt gebruikt op het voorbeeld van enzymkinetische studies over HIV-1 protease. We gebruikten mTurquoise-en mApple-gesmolten vormen van de recombinant assay substraat, die de decolleté site sequentie van de protease bevatte. Naast de fluorimetrische analyse werden de testmonsters vervolgens ook door SDS PAGE geanalyseerd.We hebben aangetoond dat de gedenatureerde fluorescerende eiwitten gedeeltelijk kunnen worden vernachter in de gel na SDS PAGE, die zowel fluorescerend als moleculair gewichtsgebaseerde identificatie van het substraat en de proteolytische fragmenten biedt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Een High-Throughput Luciferase Assay te evalueren proteolyse van de Single-omzet Protease-PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolatie van fysiologisch actief thylakoiden en hun gebruik in energie-afhankelijke proteÃ¯ne vervoer Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hoe te kwantificeren van de Fractie van Photoactivated fluorescerende eiwitten in Bulk en in levende cellen

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Meten van interacties tussen fluorescentie sondes en lignine in plantendelen door sFLIM op basis van inheemse Autofluorescentie

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Kenmerkend voor cellulaire eiwitten met in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Platform Incubator met beweegbare XY Stage: een nieuw platform voor het implementeren van in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...