Name: use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00
Duration: 19 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Ce travail a été soutenu en partie par le projet de « Équipe PHARMPROT » GINOP-2.3.2-15-2016-00044 et, également, financé par le Programme de l’Excellence institutionnelle l’enseignement supérieur de la ministère des capacités humaines en Hongrie, dans le cadre de la Programme thématique de la biotechnologie de l’Université de Debrecen. Les auteurs sont reconnaissants pour les membres du laboratoire de biochimie rétroviral pour leur aide scientifique lors de l’élaboration de test ainsi que pour leur patience pendant le tournage de l’essai (en particulier à Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz et Vanda Toldi, qui font leur apparition dans l’arrière-plan de la vidéo). Les auteurs tiens également à dire extraordinaire grâce à Gedeon Richter Plc., en particulier au Dr Zoltán Urbányi pour permettre des travaux de Beáta Bozóki dans le département de biochimie et de biologie moléculaire en tant que chercheur invité. Les auteurs aimeraient également exprimer leur gratitude à György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi et Zoltán Király, du multimédia et E-learning Technical Center de l’Université de Debrecen, pour l’assistance professionnelle en audio et vidéo production.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En raison des enquêtes intensives industriels et universitaires des enzymes protéolytiques et la demande constante pour plates-formes HTS-compatible rapides et abordables de dosage de protéase en conséquence, nous avons développé une protéase fluorescente magnétique base-perle dosage. L’analyse est basée sur l’utilisation de protéines recombinantes fusion qui peut être de nouvelles solutions de rechange aux substrats peptide synthétique largement utilisées.
Dans le format de test avancés, les substrats protéiques de fusion sont immobilisés sur les surfaces de Ni-chélate-enduit magnétique d’agarose perles. La fixation du substrat est assurée par le N-terminal sa balise6 d’affinité de la protéine de fusion, qui est directement fusionnée à une balise MBP afin de faciliter le pliage et la solubilité dans l’eau du substrat13. Le MBP est suivi par des sites de clivage du TEV PR et une protéase d’intérêt. Le premier peut servir un site de clivage de contrôle dans le dosage, tandis que ces derniers puissent être traitées par la protéase à investiguer. Le site de clivage est interchangeable ; un dsDNA courte séquence codant pour le site de clivage d’intérêt peut être inséré dans la cassette souple « clonage » du plasmide expression par la ligature. Les protéines recombinantes fusion contiennent une balise très stable, monomère de protéine fluorescente au C-terminal, qui permet la détection de point de terminaison des produits de clivage C-terminal fluorescents, enzyme-libéré, libéré par clivage protéolytique ( Figure 1 a). Les substrats fluorescents intacts purifiées, résolus dans différents tampons sont également utilisés pour l’étalonnage d’évaluer les concentrations molaires des substrats et des produits de clivage. En outre, après la fluorimétrie, les éléments d’analyse peuvent être analysés par SDS-PAGE, aussi bien. Les deux indigènes (nondenatured) et des protéines fluorescentes dénaturés peuvent être visualisées dans le gel, immédiatement après l’électrophorèse ou ultérieures en gel renaturation, respectivement. Cette supplémentaire procédure-en combinaison avec un classique bleu de Coomassie brillant bleu coloration-mai être utilisé efficacement pour vérifier les résultats de titrage (Figure 1 b).
Le mode opératoire se compose des étapes simples et faciles à exécuter dans un format de faible volume qui peut être entièrement adapté à un environnement automatique de haut débit. Toutefois, indépendamment de la réalisation de l’essai soit manuellement, soit avec un système d’automatisation, les pièces suivantes du test sont considérés comme être crucial et requièrent une attention particulière lors de l’exécution de la procédure. i) homogénéité de la solution de billes magnétiques. Une solution homogène de billes magnétiques doit être utilisée tout au long de l’essai, en purification et étapes de lavage. En particulier, la fiabilité des tests de protéase dépend fortement correctement toutes les solutions mères de billes magnétiques rattaché au substrat (SAMB). Afin d’accroître l’efficacité de la suspension et la dispersion, il est recommandé de définir la concentration en billes entre 2 % et 10 % (v/v). Au cours de la préparation de l’échantillon, l’utilisation de tampons additionnés de détergent non ionique (tels que Triton X-100 ou Tween 20) jusqu'à 2 % peut également diminuer l’adhérence des billes magnétiques pour les surfaces en plastique. L’adhésion des perles aux murs des flacons à échantillon peut être évitée si les suspensions de perle sont appliquées soigneusement le fond des flacons au lieu de sur les parois des tubes d’échantillons. L’homogénéité des billes magnétiques au cours de la réaction enzymatique est également essentielle et peut être assurée en agitant continuellement les échantillons à 600 tr/min pendant l’incubation. Perles sont correctement dispersées dans les produits de plastique rondes ou à fond plat, tandis que l’utilisation de flacons de fond V n’est pas recommandée. Un résultat sous-optimal causé par homogénéisation perle incorrecte est représenté dans la Figure 4 b. II) résiliation des échantillons de la réaction.  Un autre avantage de la méthode est que la réaction enzymatique peut être résiliée sans l’utilisation du traitement de dénaturation thermique ou n’importe quel d’agents chimiques possiblement interférentes15. La résiliation peut être effectuée simplement en séparant les billes magnétiques du mélange réactionnel, à l’aide d’un concentrateur de particules magnétiques classiques. Tandis que le tampon de réaction supprimé contient l’enzyme active et les produits de clivage fluorescent C-terminal générés, les substrats clivés restent attachées aux talons. En raison de la présence de l’enzyme active dans le tampon de réaction, la procédure de séparation doit être effectuée avec soin pour la détection fiable de point de terminaison. Avant de placer les flacons d’échantillon dans le concentrateur, il est recommandé d’appliquer une centrifugation essorage court. Après avoir placé les tubes dans le concentrateur, fournir au moins 15 s pour les perles à collecter. Léger mouvement du séparateur arrière-et-vient peut faciliter la collecte des perles. Veuillez considérer que, au cours d’une séparation réalisée manuellement, la résiliation prend généralement plus de temps que l’initiation des réactions. Par conséquent, un retard min enregistré environ 2 est recommandé entre les initiations si le même temps d’incubation doit être appliqué à tous les échantillons.
Le principe de l’analyse décrite protéolytique est relativement simple ; Cependant, la polyvalence du système est garantie par la structure du substrat flexible et stable. L’optimisation individuelle du test peut être limitée que par la compatibilité des perles d’affinité avec les conditions stipulées, réactifs et d’additifs. En accord avec protocole du fabricant, nous avons également constaté que l’affinité de substrats pour les surfaces de perle de Ni-NTA affaiblit considérablement à pH ≤ 6,515. Par conséquent, il est recommandé d’appliquer les échantillons blancs substrat parallèles aux échantillons de réaction et la vitesse de dissociation spontanée de substrat doit être examinée au cours de l’évaluation des résultats.
Dans ces cas, où magnétique perle-analyses ne peuvent être effectuées en raison de l’utilisation de composants incompatibles avec perle ou un pH bas, digestion en solution des substrats recombinants purifiés peut être également appliquée. Dans ces cas, les mélanges de réaction peuvent être analysés par électrophorèse, et les protéines peuvent être visualisées dans le gel basé sur le protocole décrit. Pour étudier l’activité protéolytique, digestion en solution et en gel-détection des protéines peuvent aussi être des outils alternatifs de fluorimétrie. Une nouveauté introduite par le système de substrat conçu est l’application d’une étape en gel renaturation après dénaturation SDS-PAGE. Tandis que natives protéines fluorescentes (nondenatured) conservent leur fluorescence pendant l’électrophorèse, la propriété fluorescente est supprimée à compter de la dénaturation (Figure 7 b). Cependant, la fluorescence des protéines dénaturées peut être partiellement récupérée par l’élimination du SDS dans le gel. Ainsi, une séparation des composants de réaction à l’aide de conditions de dénaturation permet non seulement la basés sur la fluorescence, mais l’identification moléculaire-basées sur le poids. Un autre avantage de la détection par fluorescence en gel par rapport à l’analyse d’un gel teinté bleu de Coomassie, c’est que les protéines fluorescentes (natif ou renaturé) peuvent être facilement identifiées dans le gel issu de leur fluorescence (voir Figure 7). Cela peut être important si les réactions sont effectuées dans les échantillons contenant des contaminants non fluorescentes ou protéines ressemblant fortement à poids moléculaires des uns des autres.
Tests de protéase à l’aide de substrats conçus de la même façon ont déjà été publiés précédemment8,9,10, et bien que le site de clivage d’intérêt dans ces cas était également situé entre une balise d’affinité et une protéine fluorescente, le système de test présenté ici non seulement reprend les idées décrites mais combine les différents avantages des plateformes précédentes et leur complète aussi avec d’autres améliorations : i) l’utilisation d’un partenaire de fusion MBP, ii) les présence d’un site de clivage de la commande PR TEV, iii) l’utilisation du FPs monomère nouvellement machiné, iv) l’application d’une procédure d’étalonnage de substrat unique. Le test lui-même a été particulièrement conçu pour être utiles à la spécificité de l’enzyme et des études cinétiques dans un coffre-fort, temps et coût-efficace manière, sans la nécessité pour l’instrumentation coûteuse. La méthode est destinée à être un outil convenable et abordable à ces deux fins de la recherche universitaire et industrielle. En raison de la flexibilité de la cassette « clonage » du plasmide expression, le système peut être adapté pour la génération rapide et peu coûteuse de bibliothèques de substrat recombinant. Le test décrit ci-après est un outil possible pour la mise en œuvre de la spécificité de substrat, mutagénèse d’enzyme, et l’inhibition des études et, également, fournir un outil de rechange pour effectuer la cinétique enzymatique. La plateforme de test (à partir de la perturbation des cellules bactériennes à la détermination des paramètres cinétiques) peut être adaptée à un environnement de base de HTS et automatisation et, potentiellement, peut-être être appliquée au dépistage d’inhibiteur de la protéase industrielle et/ou médicament antiviral développement. En outre, l’adaptation du test de protéolyse concurrentiel est également dans le futur champ d’application de notre laboratoire. Dans un test de concurrence, deux différents substrats, chacun contenant un site de clivage différentes fondues à a différents C-terminal fluorescent tag-sont destiné à être utilisés simultanément dans la même réaction de clivage d’enquêter sur la préférence de l’étudiée enzyme pour les séquences cible donnée. En outre, l’utilisation d’un formulaire de test adaptés plaque de 96 puits (Figure 8) est également optimisée pour le dépistage de la mutation en utilisant une série de substrats avec des séquences de site mis à jour le clivage dans le cas de protéases de cystéine.

Les enzymes protéolytiques appartiennent aux groupes enzyme plus intensivement étudiés en raison de leur importance dans les voies métaboliques et les applications industrielles, aussi bien. Leur rôle essentiel dans les maladies virales, la régulation de la coagulation sanguine, cancer et cardiovasculaires et les maladies neurodégénératives fait des protéases cibles éminents dans le domaine de découverte de médicaments. Par conséquent, la caractérisation détaillée de spécificité de substrat et inhibiteur de la protéase (PR) d’intérêt de profilage sont essentielle et s’effectués de préférence par des épreuves biochimiques rapides, rentables et robustes1,2, 3.
De nos jours, la grande majorité des tests in vitro protéase appliquée dans le domaine de découverte de médicaments pour le profilage de composés est homogène, fluorescent dépistage peptidique et haut débit (HTS)-plateformes compatibles4. En outre, peptides marqués ne conviennent pas uniquement pour le dépistage de la bibliothèque, mais ils offrent également d’excellents outils pour le dosage de l’enzyme des paramètres cinétiques sur les substrats sélectionnés. Dans d’autres cas, où l’étiquetage du substrat n’est pas possible, analyses séparation peuvent fournir une solution possible pour évaluer les propriétés cinétiques des réactions protéolytiques3.
Généralement, les dosages in vitro protéase reposent sur l’utilisation de deux types de substrat : courts peptides ou protéines entières. Dans ces cas, où le clivage des séquences peptidiques court reflètent les propriétés de clivage suffisamment, les approches standards suivantes sont applicables : (i) examiner les substrats de la protéine standard telles que l’insuline oxydé chaîne B, (ii) test substrats disponibles dans le commerce des autres protéases, (iii) bibliothèques de peptides synthétiques et fluorescent étiquetés créés par la chimie combinatoire, ou (iv) de dépistage à l’aide des méthodes génétiques, par exemple, biologique afficher technologies5, 6. Outre la classification conventionnelle, autres nouvelles plates-formes sont également disponibles pour la production du substrat (par exemple, la formation de peptides dérivés du protéome bibliothèques7 ou sous-types spéciales des méthodes génétiques, comme la fusion recombinante substrats à base de protéines8,9,10,11,12).
Tous les types de substrats susmentionnées et les dosages ont leurs propres avantages et limites, et le développement des formats de dosage combinant et/ou d’améliorer les avantages des plates-formes connues est toujours en demande. Nous décrivons ici un protocole pour un dosage de protéase fluorescent axée sur la séparation, qui utilise des substrats recombinants. Ces protéines de fusion se composent de ses balises MBP fusionnés à un site de clivage de contrôle de TEV PR, qui est suivie de la séquence de substrat d’intérêt qui est directement relié à une protéine fluorescente C-terminal (FP) (Figure 1 a) et6 . Le clonage d’une séquence d’ADN codant pour un site de clivage de l’intérêt dans la cassette « clonage » peut être effectué par une réaction de ligature unique dans le plasmide d’expression, qui a été linéarisé précédemment par endonucléases de restriction.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> Figure 1 : Principe de l’analyse de la protéase fluorescent. Protéase (A) la représentation schématique d’un substrat fluorescent et son clivage par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est montré. La flèche indique la position de clivage au sein de la séquence de site de clivage de matrice/capside de protéase du VIH-1 (VSQNY * PIVQ). Substrats (B), la fluorescence peuvent être utilisés pour analyser les réactions enzymatiques lors du test de billes magnétiques dotés de Ni-NTA et électrophorèse sur gel de polyacrylamide, ainsi, comme le montre le diagramme de flux de travail. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Protéolytiques essais en utilisant une protéine recombinante similaire des substrats contenant une balise d’affinité, un site de clivage protéolytique et un protéine fluorescent-ont déjà été décrits8,9,10, le système présenté ici a l’intention d’intégrer et d’améliorer les avantages de ces méthodes. Une différence importante est que les substrats de protéine de fusion dans cette plateforme d’essai sont équipés de MBP pour améliorer les protéines solubilité13 et contiennent un site de clivage de contrôle vét SPE. En outre, les substrats contiennent des protéines fluorescentes de nouvelle génération, qui sont très stables et ont une forme monomérique pour empêcher l’agrégation de substrat. Outre la demande précédemment publiée de mTurquoise2 et érable ondé-fusionné avec formes14, ici nous montrons aussi résultats donnés par l’utilisation d’un substrat recombinant contenant un monomère amélioré tag fluorescent protéine fluorescente jaune (mEYFP). Par les présentes, nous démontrer la compatibilité du système avec d’autres protéines fluorescentes et représentent certains types généraux de résultats qui peuvent être acquis par le dosage de la protéase.
Les protéines de fusion recombinantes sont exprimés dans les cellules d’e. coli BL21 (de3) et sont utilisés comme substrats pour l’essai dans un acide nitrilotriacétique-nickel (Ni-NTA)-enduit magnétique d’agarose-perle-rattaché au formulaire. Les produits de clivage C-terminal soient libérés de la surface de la perle dans le surnageant par clivage de la protéase d’intérêt. Après la séparation du liquide surnageant (contenant l’enzyme et les produits de clivage) de billes magnétiques, la fluorescence peut être mesurée pour déterminer les propriétés de clivage de l’enzyme. Par contraste avec les méthodes décrites précédemment, dans le système présenté ici, la quantité de substrat et produits de clivage C-terminal est unique quantifiée basé sur une procédure de calibrage de substrat détaillée. Le système de dosage peut être soutenu par une analyse en SDS-PAGE de l’essai des échantillons ; une visualisation de dans-gel fluorescente subséquente peut-être être appliquée immédiatement après l’électrophorèse ou la renaturation de dans-gel des composants fluorescents nondenatured et dénaturés, respectivement le14.
La flexibilité et la structure de la cassette de « clonage » permettent une insertion de temps et coût-efficace d’une grande variété de séquences dans la construction et, par conséquent, favorise la génération de bibliothèques de substrat. Étant donné que toutes les étapes de test sont compatible automation et HTS, le système peut être particulièrement attrayant pour, par exemple, protéase spécificité des mesures et études de mutagenèse ou il peut également être utilisé efficacement pour le dépistage d’inhibiteur de la protéase industrielle et/ou le développement de médicaments antiviraux, aussi bien.
Paramètres cinétiques de l’enzyme (kchat, Km) peuvent être déterminées par l’essai reposant sur la séparation développé ; par conséquent, il peut être adapté pour effectuer des mesures cinétiques enzymatiques individuels, tels que les études d’évolution temporelle, axées sur le substrat et l’inhibition. Cela prouve que les substrats de protéine recombinante fusion constituerait un bon pour les substrats d’oligopeptide synthétique fréquemment utilisés, et en raison de leur similitude élevée aux substrats polyprotéine, ils représentent la naturellement les interactions enzyme / substrate avec plus de précision.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10K Amicon tubes</td>
			<td style="width:269px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC501096</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">M6250</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;">1610148</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">100063</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Agarose</td>
			<td style="width:269px;">SERVA</td>
			<td style="width:137px;">11404.04</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Alpha Imager HP gel documentation system</td>
			<td style="width:269px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A3678</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A9518</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">392185</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Black half-area plates</td>
			<td style="width:269px;">Greiner bio-One</td>
			<td style="width:137px;">675086</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">B0126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">CutSmart buffer (10x)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7204S</td>
			<td style="width:191px;">For plasmid linearization (step 1.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:269px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:137px;">DR-45M</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">M0303L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dynamag-2&#160;magnetic particle&#160;concentrator</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12321D</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Escherichia coli BL21(DE3) competent cells&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">C600003</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethanol</td>
			<td style="width:269px;">Merc-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">100983</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">798681</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7024S</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycerol</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">356350</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">G7126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">High-Speed Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:269px;">GeneAid</td>
			<td style="width:137px;">PD300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Imidazole</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">56750</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">AM9464</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Jouan CR 412 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Jouan</td>
			<td style="width:137px;">CR412</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Labinco LD-76 Rotator&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Labinco</td>
			<td style="width:137px;">7600</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L3022</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Lysozyme&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L6876</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:269px;">Scharlau</td>
			<td style="width:137px;">MA0036</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MERCK eurolab ultrasonic bath</td>
			<td style="width:269px;">MERCK</td>
			<td style="width:137px;">USR54H</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Millifuge Eppendorf spin centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">CT10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T9281</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NheI-HF restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R3131L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nickel(II) sulfate (NiSO4)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">656895</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ni-NTA magnetic agarose beads&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">36113</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">OS-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PacI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R0547L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PageBlue Protein Staining Solution&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">24620</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P7626</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Protein Lobind Micro-centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">22431102</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:269px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Snijders Press-to-Mix shaker&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Gemini</td>
			<td style="width:137px;">34524</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-acetate trihydrate</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S7670</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-chloride</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S9888</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S5881</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">S7563</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:269px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M180A</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Thermo shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">TS-100</td>
			<td style="width:191px;">with SC-24 accessory block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tris</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T1503</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tween 20</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P2287</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter</td>
			<td style="width:269px;">Wallac Oy, Turku, Finland</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation

Protéases sont des enzymes étudiés en raison de leur rôle essentiel dans plusieurs voies biologiques des organismes vivants et la pathogenèse ; Ils sont donc des cibles thérapeutiques importants. Nous avons développé une plateforme magnétique d’agarose-perle-test pour l’étude de l’activité protéolytique, qui repose sur l’utilisation des substrats protéiques fusion recombinantes. Afin de démontrer l’utilisation de ce système de dosage, un protocole est présenté sur l’exemple du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) protéase. La plateforme de test introduits peut être utilisée efficacement dans la caractérisation biochimique des protéases, y compris les mesures de l’activité enzymatique dans la mutagenèse, cinétique, inhibition ou études de spécificité, et il peut être approprié pour le haut débit dépistage de substrat ou peut être adaptée à d’autres enzymes protéolytiques.
Dans ce système de dosage, les substrats appliquées contiennent la protéine N-terminale (ses6) et les balises de la protéine (PBM) liant le maltose, sites de clivage du tabac etch virus (TEV) et protéases du VIH-1 et une protéine fluorescente C-terminal. Les substrats peuvent être efficacement produites en cellules d’Escherichia coli et facilement purifié à l’aide de perles - chélate - revêtement de nickel (Ni). Au cours de l’essai, le clivage protéolytique des substrats rattaché au talon entraîne la libération de fragments de clivage fluorescent, qui peut être mesurée par fluorimétrie. En outre, les réactions de clivage peuvent être analysées par électrophorèse sur gel sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE). Un protocole pour la renaturation de dans-gel des éléments d’analyse est également décrite, car la renaturation partielle des protéines fluorescentes permet leur détection basée sur la masse moléculaire et de la fluorescence.

Figure 1 a montre la structure schématique d’un substrat fluorescent représentatifs de la protéine recombinante qui peut être traitée par le VIH-1 PR à sa séquence de site spécifique de clivage. Figure 1 b représente la production du substrat et leurs applications possibles dans les essais de protéase, y compris analyse magnétique-perle-basée de Ni-NTA et/ou de la PAGE.
Pour obtenir des données fiables par fluorimétrie, une procédure d’étalonnage est nécessaire, afin de déterminer les quantités de produits de clivage et de substrats fluorescents. Pour ce faire, les valeurs d’intensité de fluorescence des différents substrats dans les conditions de tampon différents doivent être mesurés et doivent être corrélés à leurs concentrations dans la gamme de concentration dosé (Figure 3). Les valeurs de la pente des courbes d’étalonnage peuvent être appliqués pour déterminer les montants des substrats et des produits de clivage dans les échantillons d’essai. Les pentes des courbes d’étalonnage sont indépendantes des séquences clivage site insérés dans les substrats (tableau 11) et peuvent potentiellement être utilisés pour une série de substrats fusionné au même type de protéine fluorescente. Zoom en graphiques sont indiquées pour toutes les régressions linéaires, pour agrandir les plages de concentration inférieures ainsi (Figure 3). Il est important de noter que l’étalonnage doit être effectuée avec précaution car une distribution appropriée des points de données est requise pour un étalonnage fiable. Pour cette raison, dilution en série double est appliquée afin de préparer les échantillons pour l’étalonnage, parce que la valeur de2 R indique une bonne corrélation entre la concentration de la protéine fluorescente et fluorescence que si un nombre suffisant de points de données ont été utilisés pour couvrir la gamme entière de concentration. En outre, erreurs expérimentales peuvent influer fortement sur la précision de l’étalonnage ; ainsi, une évaluation graphique droites de régression peut être également nécessaire.
Une variété de mesures enzymatiques peut être effectuée par le dosage de la protéase, y compris l’examen de l’effet de la concentration du substrat sur la vitesse de réaction (Figure 4 a). Par régression non linéaire, les données peuvent servir à déterminer les paramètres cinétiques de l’enzyme (par exemple, vmax et Km). Une suspension de perle insuffisante et dispersion et un arrêt de la réaction inadéquate peuvent provoquer des résultats sous-optimaux (Figure 4 b), qui ne conviennent pas pour le calcul des valeurs cinétiques enzymatiques fiables.
Une dépendance à l’égard de la formation du produit à l’heure peut être déterminée par l’essai (Figure 5 a) (par exemple, au cours de l’optimisation des paramètres de réaction du clivage). L’activité enzymatique en présence d’un inhibiteur peut également être étudiée (Figure 5 b) pour la détermination de la concentration de l’enzyme active et constante inhibitrice. Selon la même méthodologie, les effets d’autres inhibiteurs peuvent également projetés lors du test.
Le dosage de la protéase est utile pour étudier les effets du pH sur l’activité de l’enzyme, ainsi. Figure 6 a représente la dépendance à l’égard de l’activité enzymatique pH par l’exemple de TEV PR, qui dispose d’une gamme de pH optimal large (pH 6-9). Si on étudie l’influence du pH sur de l’activité enzymatique (ou besoin d’enzymes ayant un pH acide optimal à mesurer), il est nécessaire de considérer que l’affinité des substrats recombinants aux talons peut être restreinte à un pH légèrement acide. Une dissociation élevée des substrats de la perle (Figure 6 b) peut causer une distorsion des résultats de l’analyse. Afin d’étudier la dissociation spontanée de substrat des perles, les valeurs mesurées pour les échantillons de réaction doivent être corrigées par celles des échantillons B.
La figure 7 montre que les protéines fluorescentes nondenatured peuvent être différenciés dans le gel issu de leurs couleurs, à l’aide de transillumination de lumière bleue (Figure 7 a). Si la détermination des poids moléculaires des fragments de substrats/clivage est nécessaire, des conditions dénaturantes peuvent également servir pour la préparation de l’échantillon, car les protéines fluorescentes peuvent être partiellement renaturé dans le gel et peuvent être détectées par illumination UV (Figure 7 b) ou de bleu de Coomassie coloration (Figure 7). Si les échantillons de R sont analysés, seuls les produits de clivage C-terminal sont visibles (Figure 7), tandis que les fragments de clivage N-terminal et les substrats clivés restent attachées aux talons. Occasionnellement, protéines peuvent être partiellement dénaturés malgré l’utilisation des conditions non dénaturantes (Figure 7), et tandis que les protéines nondenatured sont plus abondants, dénaturés formes sont aussi décelables dans l’échantillon. Ce phénomène n’influence pas la détection de clivage protéolytique mais doit être envisagé dans le cas de la densitométrie quantitative d’échantillons nondenatured.
Bien que la description détaillée est montrée que pour un 2 mL tube-test, le test peut être adapté pour un 96 puits plaque système (Figure 8), qui a déjà été testé avec succès dans notre laboratoire (non illustré). Le format adapté à la plaque de 96 puits est entièrement compatible avec le fluorimétrique et l’analyse électrophorétique, ainsi, et les données obtenues peuvent également être évaluées à l’issu des méthodes décrites dans cet article.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> Figure 3 : Courbes d’étalonnage. Courbes d’étalonnage représentative de substrat sont démontrés avec l’exemple de deux substrats recombinants fusionnée à différentes étiquettes fluorescentes de C-terminal : (A et B) son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 (etC D ) Son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zoom en chiffres sont également indiqués pour représenter la régression linéaire de points de données dans le 0-0,005 plage de concentrations de substrat mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> Figure 4 : Détermination des paramètres cinétiques enzymatiques. Substrat-dépendante des mesures cinétiques ont été effectuées par le VIH-1 PR (à une concentration finale d’active de 41,2 nM). Les valeurs de la vitesse initiale ont comploté contre la concentration du substrat et une analyse de régression non linéaire de Michaelis-Menten a été réalisée. Les barres d’erreur représentent SD (n = 2). Résultat optimal représentatif (A) A est montré avec l’exemple de son6- MBP-VSQNY * substrat protéique de PIVQ-mApple fusion. (B) un résultat sous-optimal représentatif montre aussi pour le son6- MBP-KARVL * substrat AEAM-mTurquoise2, où le paramètre de concentrations du substrat approprié était problématique à cause d’une homogénéisation insuffisante de la solution mère de SAMB , alors que les erreurs relativement élevées ont été causés par la cessation d’une mauvaise réaction. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> Figure 5 : Étude temporelle et inhibitrice. (A) Sa 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP substrat protéique fusion recombinantes (à une concentration finale de 0,00326 mM) a été coupée par le VIH-1 PR (à une concentration finale d’active de 41,2 nM), et la libération de fragments protéolytiques de fluorescent PIVQ-mEYFP a été mesurée à effectuer une analyse temporelle. Les mesures ont été effectuées à cinq moments différents. Les barres d’erreur représentent SD (n = 2). (B), son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP a été utilisé comme substrat (à 0,0015 mM) afin de déterminer l’effet inhibiteur de l’amprénavir sur l’activité du VIH-1 PR (à une concentration totale de 163,8 nM). Par tracer les données, la moitié de la concentration inhibitrice maximale (CI50) pouvaient être évaluées et la concentration de l’enzyme active (une concentration active finale de 41,2 nM) du VIH-1 PR appliquée pourrait également calculées d’après la courbe de l’inhibition. Les barres d’erreur représentent SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> Figure 6 : Étudier la dépendance de l’activité enzymatique et dissociation spontanée de substrat sur Ph. (A) le son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (en 0,033 mM) a été utilisé pour mesurer l’activité enzymatique de TEV PR (à une concentration totale finale de 91.42 nM) dans un tampon de clivage a un pH différent, entre la plage de 6,5 à 8,5. Les barres d’erreur représentent SD (n = 2). Les données tracées ont été publiées auparavant14. (B) basé sur les valeurs d’intensité de fluorescence relative des échantillons vide substrat, la dissociation spontanée de son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (0,033 mM) de billes magnétiques a été étudiée à l’aide de tampons de clivage avec un pH différent, entre 6,0-8,5. Les données tracées ont été publiées auparavant14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> Figure 7 : Détection de protéines dans le gel par des procédés différents. (A) clivées et substrats protéiques fusion VIH-1 PR digérés après préparation de l’échantillon non dénaturant ont été visualisées par bleue clair transillumination après SDS-PAGE. La réaction de clivage était interprétée par digestion solution. (B) immédiatement après la PAGE, seulement nondenatured protéines pouvaient être détectés dans le gel par illumination UV, alors que, après l’enlèvement du SDS, les protéines fluorescentes précédemment dénaturés est devenu partiellement renaturé et détectable. Les échantillons ont été préparés à partir les surnageants du dosage billes magnétiques dotés Ni-NTA. (C) coloration de Coomassie peut également être utilisée pour la détection de protéines, après la renaturation en gel. Le SDS-présent dans le gel-mai provoquer la dénaturation partielle de la protéine native, mais dans les échantillons de natifs, les formes nondenatured sont plus abondantes. Les échantillons ont été préparés à partir les surnageants du dosage billes magnétiques dotés Ni-NTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> Figure 8 : adaptation axée sur la plaque de 96 puits de la plate-forme de test. (A), l’analyse peut être effectuée non seulement dans les tubes de 2 mL, mais dans les puits d’une plaque 96 puits, aussi bien. Ici, nous montrons la représentation schématique de l’application du test étudier la spécificité d’une protéase fictive à l’aide d’une série de substrats fluorescents, qui peut contenir le type sauvage (wt) ou muté (mut-1 à mut-4) séquences de site de clivage. Pour la manutention des billes magnétiques, un concentrateur de particules magnétiques compatibles 96 puits (MPC) doit être utilisé dans les expériences. Tous les volumes indiqués sont liés à un puits unique. Pour comparer l’efficacité de clivage des substrats différents, conversion du substrat peut être évaluée par le pourcentage des valeurs RFU substrat-blanc-corrigé des échantillons réaction, compte tenu des valeurs RFU substrat-blanc-corrigé de la connexes échantillons de contrôle de substrat que 100. (B) après la fluorimétrie, les surnageants séparés du dosage des échantillons peuvent également être analysés par PAGE ainsi que les composants de la protéine fluorescente peuvent être analysés directement ou après renaturation en gel en cas d’échantillon non dénaturant et dénaturation préparation, respectivement. Les trois types de test différents échantillon sont aussi illustrés dans chaque figure : C = contrôle de substrat, B = blanc substrat et R = réaction. Échantillons de contrôle de substrat sont dans la mémoire tampon d’élution, tandis que le substrat blanc et les échantillons de réaction dans le tampon de clivage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mémoire tampon</td>
			<td>Protéine fluorescente</td>
			<td>CV % de pistes (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Élution</td>
			<td rowspan="2">mTurquoise2</td>
			<td>6.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>Clivage</td>
			<td>9.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Élution</td>
			<td rowspan="2">mApple</td>
			<td>10.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Clivage</td>
			<td>12.68</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 11 : Coefficient des valeurs de variation (CV %) des pentes des courbes d’étalonnage substrat. Pour vérifier si la fluorescence des substrats de la protéine recombinante est dépendante sur le site de clivage inséré, étalonnages ont été réalisés par série de mApple et mTurquoise2-fusionné avec des substrats (six variantes pour chacun, contenant du site de clivage différent séquences de protéase du VIH-1), tous deux dans les tampons d’élution et clivage. Nous avons trouvé que CV % valeurs les pentes sont moins 15 % dans tous les cas, ce qui implique qu’un étalonnage de substrat unique peut être utilisé pour évaluer les différentes mesures effectuées par des variantes de substrat contenant la même balise fluorescente.

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Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Utilisation des protéines de Fusion recombinantes dans une plate-forme de test de protéase Fluorescent et leur Renaturation en gel

Nous présentons ici la procédure détaillée d’une plateforme de test de protéase récemment développés utilisant la protéine liant le maltose/protéine N-terminale et fusionné avec protéines recombinantes substrats fluorescents attachés à la surface de nickel-nitrilotriacétique acide magnétique agarose perles. Une analyse ultérieure de dans-gel de l’essai des échantillons séparés par électrophorèse sur gel sodium dodécyl sulfate polyacrylamide est également présentée.

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Les protéases sont l’un des groupes les plus étudiés de soutiens biomoléculaires dans la recherche universitaire et industrielle. Leur rôle puissant dans plusieurs processus physiologiques et pathologiques en fait également une cible de premier plan dans le domaine de la découverte de médicaments. En ce qui concerne leurs recherches intensives, il existe une forte demande continue pour le développement de plates-formes d’analyse de la fluorescence compatibles avec le dépistage à haut débit et à haut débit.Ici, nous aimerions introduire un protocole pour l’application d’une plate-forme d’analyse de fluorescence compatible au criblage à haut débit basée sur la séparation utilisant à la fois des substrats de protéase de fusion recombinants fusionnés mTurquoise2 et mApple. En outre, nous aimerions démontrer une méthode pour la renaturation en gel des substrats et les fragments de clivage des échantillons d’essai après avoir dénaturé SDS-PAGE ainsi. Toutes les expériences sont menées sur l’exemple de la protéase virale du VIH-1.Le plasmide d’expression porte la séquence de codage d’une étiquette d’affinité d’histadine d’hexa et d’une protéine de fusion liant maltose suivie d’un emplacement de clivage de contrôle de la protéase de virus d’etch de tabac, d’une cassette de clonage, et d’une protéine fluorescente de C-terminal. Linéariser l’expression plasmide par PacI et NheI restriction endonucleases. Effectuez l’annealing du codon Escherichia coli optimisé vers l’avant et vers l’arrière des amorces oligonucléotides qui codent pour la séquence de substrat d’intérêt et le flanc par PacI et NheI extrémités cohésives.Effectuer l’insertion des amorce annelés dans l’expression linéarisée plasmide par ligature. Pour l’expression des protéines, transformer les cellules compétentes BL21(DE3) par le mélange de ligature. Les protéines fluorescentes seront dans le même cadre de lecture ouvert avec les balises de fusion N-terminal seulement après une ligature réussie.Quelques jours après la transformation, les colonies contenant l’expression plasmide codant le site inséré de clivage d’intérêt montreront une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un transilluminateur bleu Dark Reader. Ajouter 10 microlitres de stock de glycérol des cellules BL21(DE3) transportant le codage plasmide d’expression pour la séquence du site de clivage d’intérêt à cinq millilitres LB moyen contenant 100 microgrammes par ampicilline millilitre dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres. Incuber la suspension à 37 degrés pendant 15 heures tout en secouant constamment.Transférer la culture bactérienne de cinq millilitres à 50 millilitres de milieu LB frais contenant 100 microgrammes par ampicilline millilitre. Faire croître les cellules à 37 degrés à une absorption de 0,6 à 0,8 à 600 longueurs d’onde nanométriques. À ce stade, induire l’expression des protéines par l’ajout d’IPTG.Par la suite, incuber la culture pendant trois heures à 37 degrés tout en secouant continuellement. Après l’incubation, transférer 25 millilitres de la culture dans des tubes de centrifugeuse propres de 50 millilitres et récolter les cellules par centrifugation. Jetez le supernatant et conservez les granulés de cellules bactériennes à moins 70 degrés pendant au moins une heure.Les granulés cellulaires contenant les protéines fluorescentes exprimées avec succès montrent clairement une fluorescence avec ou même sans utiliser un transilluminateur bleu Dark Reader. Déposer la pastille de cellules congelées sur la glace et laisser décongeler pendant 15 minutes. Ajouter deux millilitres tampon de lyse à la pastille et suspendre les cellules.Par la suite, ajouter l’inhibiteur de la protéase, libérer la suspension par lyzozyme et DNase, suspendre les cellules, et incuber la suspension sur la glace pendant 15 minutes. Transférer deux fois une suspension millilitre dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et sonifier les suspensions pendant trois minutes en rondelles de 10 secondes de sonication et de pause de cinq secondes. Centrifuger les tubes à 10 000 g pendant 20 minutes à température ambiante.Les lysates de cellules bactériennes déblayés contenant le substrat fluorescent d’intérêt montrent une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un transilluminateur bleu Dark Reader. La procédure de l’analyse de protéase développée commence par la préparation des échantillons d’analyse. Tout d’abord, les substrats recombinants sont incubés avec les perles magnétiques d’affinité, et les perles magnétiques attachées au substrat, abrégées en SAMBs, sont formées.SamBs sont lavés plusieurs fois, et enfin la solution de stock SAMB est préparé par l’aliquoting dont les échantillons d’analyse sont créés. Les réactions sont paraphées par l’ajout de la solution de protéase. Au clivage par la protéase, les fragments protéolytiques sont libérés dans le surnatant.La réaction est terminée par la séparation des perles magnétiques du tampon de réaction qui contient les produits fluorescents de clivage et l’enzyme. Les supernatants sont appliqués sur les puits d’une plaque de microtiter et la fluorescence est déterminée par fluorure. Les courbes d’étalonnage sont générées à l’aide de substrats fluorescents purifiés résolus dans chaque tampon d’essai.La concentration des produits de clivage fluorescent du terminal C et aussi celle du substrat appliqué dans les échantillons d’analyse sont déterminées en fonction de la pente des courbes d’étalonnage. Placer le tube contenant des perles d’agarose magnétiques nickel-NPA neuves ou recyclées dans un concentrateur de particules magnétiques. Les perles peuvent coller au mur et/ou dans le couvercle du tube de microcentrifugeuse.Par conséquent, tournez le concentrateur à l’envers dans toutes les directions pour s’assurer que toutes les perles sont collectées. Retirer le surnatant et le jeter. Ajouter un tampon de lyse de 1,8 millilitres aux perles et retirer les tubes fermés du concentrateur.Suspendre les perles dans le tube en secouant et/ou en retournant le tube à l’envers jusqu’à ce que les perles soient complètement homogènes. Placez les tubes dans le concentrateur et tournez-le à l’envers dans toutes les directions pour vous assurer que toutes les perles sont collectées. Ouvrez le tube et jetez le surnatant.Ajouter le lysate bactérien autorisé contenant le substrat d’intérêt et retirer le tube fermé du concentrateur. Retourner les tubes à l’envers jusqu’à ce que les perles soient complètement homogènes et faire pivoter les tubes par rotateur, lentement, à température ambiante pendant 30 minutes. Les SAMBs affichent une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un transilluminateur bleu Dark Reader.Lavez les SAMBs trois fois par 1,8 millilitre 1%Tween 20, tampon de lavage, et tampon de clivage. Ajoutez un tampon de clivage aux SAMB lavés pour créer une solution de stock SAMB. Si vous utilisez des tubes de microcentrifugeuse à faible liaison protéique de deux millilitres, le volume du tampon de clivage appliqué peut aller jusqu’à 1,9 millilitres.Après l’ajout du tampon, ne secouez pas ou ne retournez pas le tube à l’envers. Fermez le tube et retirez-le du concentrateur. Préparez des tubes de microcentrifugeuse à faible liaison protéique de deux millilitres pour les échantillons d’analyse.Suspendre la solution de stock SAMB jusqu’à ce qu’elle soit complètement homogène et mesurer la quantité de substrat à analyser dans les réactions en transférant immédiatement la solution de stock SAMB dans les flacons d’échantillon. Le volume de la solution de stock SAMB à transférer est recommandé d’être de 25 à 300 microlitres, mais il doit être fixé selon la conception expérimentale individuelle. Placez les tubes d’échantillon contenant les suspensions SAMB aliquoted dans le concentrateur.Retirez soigneusement le surnatant des SAMBs et jetez-le. Retirez les tubes du concentrateur et ajoutez soigneusement le tampon de réaction aux SAMBs. Le volume du tampon de réaction supplémentaire doit être calculé en fonction de la conception expérimentale individuelle, mais il est recommandé de définir le volume final du mélange de réaction entre 50 et 150 microlitres si des tubes de deux millilitres sont utilisés.Fermer les couvercles des tubes. Maintenant, les échantillons sont prêts à être paramé paramésiés. Ajouter la solution enzymatique aux échantillons de réaction.Remuer soigneusement les perles en déplaçant doucement les tubes et placer les tubes immédiatement dans le thermoshaker déjà en secousses. Dans le cas d’échantillons vierges de substrat et d’échantillons de contrôle du substrat, ajoutez respectivement un tampon de clivage et un tampon d’élitution. Trente secondes avant la fin de l’incubation, sortez l’échantillon du thermoshaker et faites-le tourner rapidement.Placez le tube sur le concentrateur et laissez reposer le tube pendant 15 secondes. La collecte des SAMBs peut être facilitée en déplaçant légèrement le concentrateur d’avant en arrière. Ouvrez le couvercle et transférez soigneusement le surnatant dans une assiette ou un nouveau tube.Ne touchez pas les perles concentrées par la pointe de la pipette. Le supernatant recueilli des échantillons de contrôle du substrat et les échantillons de réaction avec un degré élevé de clivage peuvent montrer une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un transilluminateur bleu Dark Reader. Transférer deux fois 30 microlitres des supernatants d’échantillon séparés dans une microplaque noire de demi-surface.Mesurer la fluorescence par fluorure à l’aide des filtres appropriés en fonction de la protéine fluorescente appliquée. Pour la purification des substrats fluorescents, préparez la même solution que décrite précédemment et jetez le surnatant. Ajouter 400 à 600 microlitres tampon d’élitution aux SAMBs et faire pivoter les tubes par rotateur lentement à température ambiante pendant cinq minutes.Transférer l’élitate dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse à faible liaison protéique. Il montre une fluorescence clairement visible avec ou sans l’aide d’un transilluminateur bleu Dark Reader. Après purification, échange tampon et mesure de la teneur en protéines, préparez une double dilution en série en au moins huit étapes, à la fois à partir des solutions de substrat résolus par l’elution-buffer et le tampon de clivage, en utilisant respectivement l’élitution ou le tampon de clivage pour la dilution.Transférer 30 microlitres de chaque point de dilution dans une microplaque noire de demi-surface. Mesurer la fluorescence par fluorure en utilisant les mêmes paramètres qui ont été appliqués dans la mesure des surnatants de l’échantillon d’analyse. À titre d’exemple pour le traitement des données, les mesures cinétiques dépendantes du substrat de la protéase VIH-1 ont été effectuées sur une forme fusionnée mTurquoise2 du substrat recombinant codant le site de clivage entre la matrice et les protéines capsides dans le précurseur naturel des protéines gapiques.Tracez les valeurs d’intensité de fluorescence relative corrigées par rapport à la concentration molaire des substrats purifiés, résolvez le clivage ou le tampon d’élitution et effectuez une régression linéaire. Calculer la concentration molaire des produits de clivage du terminal C dans les échantillons de réaction à l’aide de la pente de la courbe d’étalonnage à base de tampon de clivage. Calculez également la concentration de substrat appliquée dans les échantillons de réaction en fonction de la concentration molaire du substrat élulisé dans les échantillons de contrôle du substrat à l’aide de la pente de la courbe d’étalonnage à base d’élitution-tampon.Les valeurs initiales de vitesse ont été calculées à partir de la quantité des fragments de clivage du terminal C, puis tracées par rapport à la concentration appliquée du substrat. Des paramètres cinétiques ont également été déterminés par l’analyse de régression non linéaire de Michaelis-Menten. Après avoir effectué l’analyse à base de perles magnétiques nickel-NTA, les surnatants d’essai peuvent également être analysés par électrophoresis de gel de polyacrylamide.Cependant, en plus de l’analyse des échantillons d’analyse, il est également possible d’analyser les substrats fluorescents purifiés et/ou les fragments de clivage après digestion en solution. Pour la digestion en solution, aliquote les substrats fluorescents purifiés à digérer dissous dans le tampon de clivage en tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, et ajouter la solution enzymatique aux échantillons. Incuber les échantillons selon la conception expérimentale et mettre fin aux réactions par la procédure de préparation de l’échantillon pour PAGE.Pour la préparation de l’échantillon non dénaturé, mélanger les échantillons à analyser avec un tampon de chargement d’échantillons non dénaturant ne contenant aucun agent réducteur. Dans le cas de la préparation dénaturée de l’échantillon, mélanger les échantillons à analyser avec le tampon de chargement de l’échantillon dénaturant et exposer les échantillons au traitement thermique à 95 degrés pendant 10 minutes. Appliquer les échantillons non dénaturés et dénaturés dans les puits du gel SDS-polyacrylamide et effectuer l’électrophoresis.Retirez la cassette gel du module en cours d’exécution. Des échantillons non dénaturés sont déjà visibles dans le gel même à l’œil nu ou avec le transilluminateur bleu Dark Reader. Afin de détecter les composants fluorescents des échantillons dénaturés sur le transilluminateur, effectuer la renaturation dans le gel en lavant le SDS à partir du gel.Ajouter 100 millilitres d’eau distillée au gel et rincer au moins pendant 30 minutes. Visualisez les protéines fluorescentes en plaçant le gel non taché sur le transilluminateur bleu Dark Reader. Les protéines de fusion fluorescente recombinantes ont été conçues pour être utilisées comme substrats dans les analyses protéolytiques.Lors du clivage par la protéase au site de clivage spécifique, le fragment de clivage fluorescent du terminal C est libéré et sa fluorescence peut être détectée. Leur utilisation dans l’analyse à base de perles magnétiques nickel-NTA et la détection fluorescente par l’analyse PAGE ont été optimisées à l’aide de la protéase VIH-1. Cependant, la plate-forme d’essai développée peut être appropriée à d’autres protéases aussi bien.Les courbes d’étalonnage des substrats purifiés résolus dans le tampon de clivage ou d’élitution sont illustrées sur les exemples de la forme fusionnée mTurquoise2 et mEYFP du substrat recombinant codant le côté clivage entre la matrice et les protéines capsidiques de la protéine anechoïque naturelle du VIH. L’analyse à base de perles magnétiques nickel-NTA est un outil utile pour examiner l’effet de la concentration du substrat sur la vitesse de réaction et rend ainsi possible la détermination des paramètres cinétiques enzymatiques tels que Vmax et Km. Le diagramme A montre un résultat optimal obtenu après une analyse réussie de l’activité substrat-dépendante sur un substrat mApple-fusionné.En revanche, le diagramme B présente un résultat sous-optimal où l’homogénéisation insuffisante de la solution de stock SAMB cause des problèmes dans la mise en place des concentrations de substrat appropriées tandis que l’arrêt inadéquat des échantillons de réaction entraîne des erreurs relativement élevées. L’essai fournit également un outil approprié pour exécuter des études de temps-cours et inhibitrices aussi bien. Le diagramme A démontre la dépendance au temps du clivage protéolytique de la protéase HIV-1 sur un substrat fusionné par mEYFP, tandis que le diagramme B représente l’effet inhibiteur de l’amprévir sur la réaction de clivage.À partir des données obtenues par l’étude inhibitrice, la concentration active d’enzymes et la constante inhibitrice peuvent être déterminées. L’essai peut également être optimisé pour étudier la dépendance de l’activité enzymatique sur le pH, car il est représenté par le diagramme A sur l’exemple de la protéase du virus de l’etch du tabac. Le diagramme B indique une limitation de l’analyse par pH et montre que le pH neutre ou légèrement alcalin est entièrement compatible avec les mesures, tandis que le pH acide facilite la dissociation spontanée des substrats de la surface des perles magnétiques.La figure actuelle montre les substrats fluorescents intacts purifiés, les fragments fluorescents de clivage du terminal C, générés par la digestion in-solution par la protéase VIH-1. Les composants fluorescents peuvent être détectés dans le gel de polyacrylamide contenant du SDD par transillumination de lumière bleue juste après l’électrophorèse si des conditions non dénaturantes ont été appliquées pendant la préparation de l’échantillon. Les différentes protéines fluorescentes peuvent être différenciées en fonction de leur couleur.Après l’analyse à base de perles magnétiques, les protéines fluorescentes non dénaturées dans les supernatants de l’échantillon peuvent également être détectées dans le gel par illumination UV. En revanche, si des conditions de dénaturation sont appliquées pendant la préparation de l’échantillon, les protéines dénaturées ne peuvent pas être détectées dans le gel immédiatement après la PAGE SDS. Cependant, les protéines fluorescentes dénaturées peuvent être partiellement renaturées par l’élimination du SDS du gel et devenir détectables.Par conséquent, la PAGE SDS est suivie de la procédure de renaturation en gel. La capacité de renaturation des protéines fluorescentes permet leur identification non seulement en fonction de leur fluorescence, mais aussi en fonction de leur poids moléculaire. Ici, nous avons démontré le protocole pour l’utilisation de notre plate-forme d’analyse fluorescente à base de perles magnétiques récemment développée.Nous avons démontré l’utilisation de ce système sur l’exemple d’études cinétiques enzymatiques sur la protéase VIH-1. Nous avons utilisé des formes fusionnées mTurquoise et mApple du substrat d’essai recombinant, qui contenait la séquence du site de clivage de la protéase. Outre l’analyse fluorimétrique, les échantillons d’analyse ont ensuite été analysés par SDS PAGE ainsi.Nous avons démontré que les protéines fluorescentes dénaturées peuvent être partiellement renaturées dans le gel après SDS PAGE qui fournit à la fois l’identification fluorescente et moléculaire basée sur le poids du substrat et les fragments protéolytiques.

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