Name: use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00
Duration: 19 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise vom GINOP-2.3.2-15-2016-00044 "teaming PHARMPROT" Project unterstützt und auch, finanziert durch die institutionelle Excellence Hochschulprogramm des Ministeriums der menschlichen Fähigkeiten in Ungarn, im Rahmen der Biotechnologie-thematischen Programm der Universität Debrecen. Die Autoren sind dankbar für die Mitglieder des Labor für Retroviren Biochemie für ihre wissenschaftliche Hilfe während der Assay-Entwicklung und auch für ihre Geduld während der Dreharbeiten der Assay (insbesondere an Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz und Vanda Toldi Wer im Hintergrund des Videos angezeigt werden). Die Autoren möchten auch besonderer Dank Gedeon Richter Plc., vor allem Dr. Zoltán Urbányi dafür, dass Beáta Bozókis Arbeit in der Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie als Gastwissenschaftler sagen. Die Autoren möchten auch ihre Dankbarkeit György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi und Zoltán Király aus dem Multimedia und E-Learning Technical Center der Universität Debrecen für die professionelle Unterstützung im Bereich Audio und Video zu verlängern Produktion.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Aufgrund der intensiven industriellen und akademischen Untersuchungen von proteolytischen Enzymen und die ständige Nachfrage für rasche und kostengünstige HTS-kompatiblen Protease Assays Plattformen entsprechend, entwickelten eine magnetische-Perle-basierte fluoreszierende Protease wir Assay. Der Test basiert auf den Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen neuartige Alternativen zu den allgemein verwendeten synthetischen Peptid-Substrate werden können.
Im entwickelten Assay-Format sind die Fusion Protein Substrate an den Oberflächen der Ni-Chelat-beschichtete magnetische Agarose Korne immobilisiert. Die Substrat-Anlage ist durch die N-terminale seine6 Affinität Tag des Fusionsproteins, vorgesehen, die direkt an ein MBP-Tag zur Erleichterung der Faltung und erhöhen die Wasserlöslichkeit der Substrat-13verschmolzen wird. Das MBP folgt Spaltstellen TEV PR und eine Protease von Interesse. Ersteres kann dienen als eine Kontrolle Spaltstelle in der Probe, während letztere durch die Protease untersucht werden verarbeitet werden kann. Die Spaltstelle ist austauschbar; eine kurze DsDNA Sequenz Codierung für die Spaltstelle von Interesse kann in der flexiblen Klonen Kassette des Plasmids Ausdruck durch Unterbindung eingefügt werden. Die rekombinanten Fusionsproteinen enthalten einen hochstabile, Monomere fluoreszierendes Protein-Tag an die C-terminale, wodurch die Endpunkterkennung von dem Enzym befreit, fluoreszierende C-terminale Spaltprodukte frei, worauf proteolytische Spaltung ( Abbildung 1A). Gereinigten fluoreszierende intakt Substrate in verschiedenen Puffer gelöst sind auch für die Kalibrierung verwendet, um die Molaren Konzentrationen der Substrate und Spaltprodukte zu beurteilen. Darüber hinaus können nach Fluorimetry, der Assay-Komponenten durch SDS-PAGE, sowie analysiert werden. Beide Native (nondenatured) und denaturierte fluoreszierende Proteine visualisiert werden im Gel, unmittelbar nach der Elektrophorese oder nach nachfolgenden in Gel Renaturierung bzw.. Diese zusätzliche Verfahren in Kombination mit einer konventionellen Coomassie Brilliant Blue Färbung-Mai werden für die Überprüfung der Untersuchungsergebnisse (Abbildung 1 b) effizient genutzt.
Die Testverfahren besteht aus einfachen, leicht ausführen Schritte in einem Low-Volume-Format, die eine automatische Umgebung mit hohem Durchsatz vollständig angepasst werden können. Allerdings gelten unabhängig von der Durchführung des Tests, entweder manuell oder mit einem Automatisierungssystem, folgende Teile des Tests als entscheidend sein und benötigen besondere Aufmerksamkeit bei der Durchführung des Verfahrens. (i) Homogenität der magnetischen Wulst Lösung. Eine homogene magnetische Wulst-Lösung muss in der gesamten Assay, sowohl in der Reinigung und Waschschritte verwendet werden. Insbesondere hängt die Zuverlässigkeit der Protease Assays richtig Aliquotierung der Stammlösungen Substrat befestigt magnetischer Wulst (SAMB). Um die Wirksamkeit der Aufhängung und Dispersion zu erhöhen, empfiehlt es sich, die Perle-Konzentration zwischen 2 % und 10 % (V/V) festgelegt. Während der Probenvorbereitung, die Verwendung von Puffern ergänzt mit nichtionische Reinigungsmittel (z.B. Triton x-100 oder Tween 20) bis zu 2 % kann auch die Einhaltung der magnetische Beads Kunststoffoberflächen vermindern. Die Einhaltung der Perlen an den Wänden der Probenfläschchen kann vermieden werden, wenn die Perle Suspensionen sorgfältig auf die Böden der Durchstechflaschen statt an den Wänden der Probenröhrchen angewendet werden. Die Homogenität des magnetischen Kügelchen während der enzymatischen Reaktion ist auch kritisch und durch Schütteln kontinuierlich die Proben bei 600 u/min während der Inkubation gewährleistet werden kann. Perlen sind in runden oder flachen Kunststoff waren, richtig verteilt, während der Verwendung von V-Boden-Fläschchen nicht empfohlen wird. Ein suboptimales Ergebnis verursacht durch unsachgemäße Wulst Homogenisierung wird in Abbildung 4 bdargestellt. (II) Beendigung der Reaktion Proben.  Ein weiterer Vorteil der Methode ist, dass die enzymatische Reaktion ohne den Einsatz von Denaturierung Wärmebehandlung oder jede potentiell störende chemische Arbeitsstoffe15beendet werden kann. Die Kündigung kann einfach durch die Trennung der magnetischen Beads aus dem Reaktionsgemisch, mit einem herkömmlichen Magnetpartikel Konzentrator erfolgen. Während der entfernten Reaktion Puffer das aktive Enzym und die generierten C-terminale fluoreszierende Spaltprodukte enthält, bleiben die uncleaved Substrate mit Perlen verbunden. Aufgrund des Vorhandenseins von das aktive Enzym im Puffer Reaktion muss das Trennung Verfahren für zuverlässige Endpunkterkennung sorgfältig durchgeführt werden. Vor der Platzierung der Probenfläschchen in der Konzentrator, empfiehlt es sich, eine kurze Drehung Zentrifugation gelten. Nach der Platzierung der Rohre in der Konzentrator bieten mindestens 15 s für die Perlen gesammelt werden. Leichte Bewegung des Separators hin- und Herbewegung kann die Sammlung der Perlen erleichtern. Bitte beachten Sie, dass während eine manuell durchgeführte Trennung der Kündigung in der Regel mehr Zeit als die Einleitung der Reaktionen dauert. Daher wird ein ca. 2 min registriert Verzögerung zwischen den Einweihungen empfohlen, wenn die gleiche Inkubationszeit auf alle Proben angewendet werden muss.
Das Prinzip des beschriebenen proteolytischen Assays ist relativ einfach; die Vielseitigkeit des Systems ist jedoch durch die flexiblen und stabilen Untergrund-Struktur gewährleistet. Individuelle Optimierung des Assays kann nur durch die Kompatibilität der Affinität Perlen mit angewandten Bedingungen, Reagenzien und Zusatzstoffe beschränkt werden. Im Einvernehmen mit der Hersteller-Protokoll fanden wir auch, dass die Affinität Bindung von Substraten, die Ni-NTA-Perle-Oberflächen bei pH ≤ 6,515erheblich schwächt. Daher, es wird empfohlen, Substrat leer Proben parallel zur Reaktion Proben gelten, und die Rate der spontanen Substrat Dissoziation muss bei der Auswertung der Ergebnisse berücksichtigt werden.
In den Fällen, wo magnetische-Perle-basierte Tests durch den Einsatz von Perle-inkompatible Komponenten oder einen niedrigen pH-Wert durchgeführt werden kann, kann auch in Lösung Verdauung der gereinigten rekombinante Substrate angewendet werden. In diesen Fällen die Reaktionsgemischen durch Elektrophorese analysiert werden können, und die Proteine im Gel basierend auf dem beschriebenen Protokoll visualisiert werden können. Um proteolytische Aktivität zu untersuchen, möglicherweise in Lösung Verdauung und in Gel Detektion der Proteine auch alternative Werkzeuge des Fluorimetry. Eine Neuheit des Systems entwickelten Substrat ist die Anwendung eines Schritts in Gel Renaturierung nach denaturierenden SDS-PAGE. Native (nondenatured) fluoreszierende Proteine ihre Fluoreszenz während der Elektrophorese behalten, ist die fluoreszierende Eigenschaft auf Denaturierung (Abb. 7 b) abgeschafft. Die Fluoreszenz von denaturierten Proteinen kann jedoch teilweise durch die Beseitigung der SDS aus dem Gel wiederhergestellt werden. So macht eine Trennung der Reaktionskomponenten mit denaturierenden Bedingungen nicht nur die Fluoreszenz-basierte, sondern die molekularen Gewicht basierende Identifizierung möglich. Ein weiterer Vorteil der Fluoreszenz in-Gel-Detektion im Vergleich zur Analyse eines Gels Coomassie gefärbt ist, dass die (Native oder renaturierte) fluoreszierende Proteine im Gel basierend auf ihre Fluoreszenz leicht identifiziert werden können (siehe Abbildung 7). Dies kann wichtig sein, wenn Spaltung Reaktionen in Proben mit nonfluorescent Verunreinigungen durchgeführt werden oder Proteine die Molmassen von einander sehr ähnlich.
Protease Assays mit ähnlich gestalteten Substrate wurden bereits vorher veröffentlicht8,9,10, und obwohl die Spaltstelle von Interesse in diesen Fällen auch zwischen einer Affinität Tag befand und eine fluoreszierenden Proteins, das Testsystem präsentiert hier wiederholt nicht nur die beschriebenen Ideen aber verbindet die unterschiedlichen Vorteile der bisherigen Plattformen und schließt sie auch mit weiteren Verbesserungen: (i) die Nutzung von einem MBP Fusion Partner, (Ii) die Präsenz ein TEV PR Kontrolle Spaltstelle, Iii) die Nutzung der neu entwickelte Monomeren FPs und iv) die Anwendung eines einzigartigen Substrat Kalibrierung. Der Test selbst wurde speziell für Enzym Spezifität und kinetische Untersuchungen an einem sicheren, Zeit- und kosteneffiziente Art und Weise, ohne die Notwendigkeit für teure Instrumente nützlich. Die Methode zielt darauf ab, einen geeigneten und erschwinglichen Werkzeug für beide industriellen und akademischen Forschungszwecke sein. Aufgrund der Flexibilität der "Klonen Kassette" des Plasmids Ausdruck möglicherweise das System für die schnelle und kostengünstige Erzeugung von rekombinanten Substrat Bibliotheken geeignet. Der hierin beschriebene Test eignet sich für die Umsetzung der Substratspezifität, Enzym Mutagenese, machbar und Hemmung studiert und bieten auch ein alternatives Instrument, um Enzym Kinetik durchführen. Die Assay-Plattform (aus Bakterienzelle Unterbrechungen für die Ermittlung der kinetischen Parameter) kann zu einer HTS - und Automatisierung-basierte Umgebung angepasst werden und gegebenenfalls im industriellen Protease-Inhibitor-Screening und/oder antivirale Medikament angewandt werden Entwicklung. Darüber hinaus ist die Anpassung des Assays für wettbewerbsfähige Proteolyse auch zukünftig Umfang unseres Labors. In solch einem wettbewerbsfähigen Assay verschmolzen zwei verschiedene Substrate-jeder mit einer unterschiedlichen Spaltstelle, a verschiedene C-terminale fluoreszierende Tag-werden gleichzeitig in die gleiche Reaktion der Spaltung um zu untersuchen, die Bevorzugung von den untersuchten verwendet werden sollen Enzym für die gegebenen Ziel-Sequenzen. Darüber hinaus wird die Verwendung einer 96-Well-Platte angepasst-Assay-Form (Abbildung 8) auch für Mutation Screening optimiert durch eine Reihe von Substraten mit modifizierten Spaltung Website Sequenzen bei Cystein-Proteasen.

Proteolytische Enzyme gehören zu den am intensivsten untersuchten Enzym Gruppen aufgrund ihrer Bedeutung in Stoffwechselwege und in industriellen Anwendungen sowie. Ihre Schlüsselrolle bei Viruserkrankungen, die Regulierung der Blutgerinnung, Krebs und Herz-Kreislauf- und neurodegenerativen Erkrankungen macht Proteasen wichtige Ziele auf dem Gebiet der Wirkstoffforschung. Daher die detaillierte Charakterisierung der Substratspezifität und Inhibitor Profilierung der Protease (PR) von Interesse ist von zentraler Bedeutung und erfolgt vorzugsweise durch schnelle, kostengünstige und robuste biochemischen Assays1,2, 3.
Heutzutage sind die überwiegende Mehrheit der in-vitro-Protease Assays angewendet im Bereich der Arzneimittelforschung für zusammengesetzte Profilerstellung homogene, fluoreszierende Peptid-basierte und Hochdurchsatz-Screening (HTS)-kompatiblen Plattformen4. Darüber hinaus beschriftete Peptide sind nicht nur für Bibliothek Screening geeignet, aber sie bieten auch große Werkzeuge für die Bestimmung des Enzyms kinetische Parameter der ausgewählten Substrate. In anderen Fällen, wo Kennzeichnung des Substrates nicht möglich ist, können die Trennung basierende Assays eine mögliche Lösung für die kinetischen Eigenschaften der proteolytischen Reaktionen3bewerten.
In der Regel in-vitro-Protease Assays basieren auf der Verwendung von zwei Arten von Substrat: kurze Peptide oder ganze Proteine. In den Fällen, wo die Spaltung von kurzen Peptid-Sequenzen entsprechen die Spaltung Eigenschaften ausreichend, gelten die folgenden Standardansätze: (i) standard Protein Substrate wie oxidierte Insulin B-Kette, (Ii) Prüfung Prüfung im Handel erhältlichen Substrate von anderen Proteasen, (Iii) screening synthetischer und Gewebekulturen beschriftet Peptid Bibliotheken erstellt von kombinatorischen Chemie oder (iv) mit genetischen Methoden, zum Beispiel biologische anzeigen Technologien5, 6. Neben der konventionellen Klassifikation, andere neuartigen Plattformen sind erhältlich für Substrat Generation (z. B. die Bildung von Proteom-abgeleitete Peptid Bibliotheken7 oder spezielle Subtypen von genetischen Methoden, wie die rekombinante Fusion Protein-basierten Substrate8,9,10,11,12).
Alle der oben genannten Substrat Typen und Tests haben ihre eigenen Vorzüge und Grenzen, und die Entwicklung von Assays Formaten kombiniert und/oder die Vorteile der bekannten Plattformen zu verbessern ist nach wie vor gefragt. Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine Trennung-basierte fluoreszierende Protease-Assay, der rekombinante Substrate verwendet. Diese Schmelzverfahren Proteine bestehen aus seinen6 und MBP Tags verschmolzen zu einem Steuerelement Spaltstelle von TEV PR, gefolgt von der Substrat-Reihenfolge des Interesses, die direkt mit einer C-terminalen fluoreszierenden Proteins (FP) (Abbildung 1A) verbunden ist. Das Klonen einer DNA-Sequenz, die Codierung für eine Spaltstelle von Interesse in der "Klonen Kassette" kann durch einen einzigen Ligatur Reaktion in das Expressionsplasmid durchgeführt werden, die zuvor durch Beschränkung Endonucleases linearisiert worden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> Abbildung 1: Prinzip des fluoreszierenden Protease Assays. (A) die schematische Darstellung von einem fluoreszierenden Substrat und seiner Spaltung durch humane Immundefizienz-Virustyp 1 (HIV-1) Protease wird angezeigt. Der Pfeil zeigt die Position der Spaltung innerhalb der Matrix/Kapsid Spaltung Website Sequenz von HIV-1 Protease (VSQNY * PIVQ). (B) die fluoreszierenden Substrate können verwendet werden, Enzymreaktionen analysieren durch Ni-NTA magnetischer Wulst-basierende Assays und Polyacrylamid Gelelektrophorese, ebenso, wie in der Workflow-Abbildung dargestellt ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Obwohl proteolytischen Assays mit ähnlichen rekombinanten Proteins Substrate-mit einer Affinität-Tags, eine proteolytische Spaltung-Website und ein fluoreszierendes Protein-Have bereits beschrieben wurden8,9,10, das System präsentiert hier beabsichtigt, zu integrieren und auf die Vorteile dieser Methoden zu verbessern. Ein wichtiger Unterschied ist, dass die Fusion Protein Substrate in diesem Assay-Plattform mit MBP Protein Löslichkeit13 und enthalten ein Steuerelement Spaltstelle TEV PRS ausgestattet sind. Darüber hinaus enthalten die Substrate neue Generation fluoreszierende Proteine, die sind sehr stabil und haben eine Monomere Form Substrat Aggregation zu verhindern. Neben den zuvor veröffentlichten Anwendung des mTurquoise2 und mApple verschmolzen Formen14zeigen hier wir auch, dass Ergebnisse durch den Einsatz eines rekombinanten Substrats mit einem Monomeren fluoreszierende Tag gelb fluoreszierende Protein (mEYFP) erweitert. Hiermit haben wir die Kompatibilität des Systems mit anderen fluoreszierende Proteine zu demonstrieren und vertreten einige allgemeinen Arten von Ergebnissen, die durch die Protease Assays erworben werden können.
Die rekombinanten Fusionsproteinen in E. Coli BL21(DE3) Zellen exprimiert werden und dienen als Substrate für die Probe in einer Nickel-Nitrilotriacetic Säure (Ni-NTA)-magnetisch-Agarose Bead-attached Form beschichtet. Die C-terminale Spaltprodukte werden von der Oberfläche der Perle in der Überstand nach Spaltung durch die Protease des Interesses befreit. Nach der Trennung des Überstands (mit dem Enzym und die Spaltprodukte) von der magnetischen Beads kann die Spaltung Eigenschaften des Enzyms bestimmen die Fluoreszenz gemessen werden. Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Methoden in das hier vorgestellte System basierend auf einer detaillierten Substrat Kalibrierverfahren eindeutig die Mengen an Substrat und C-terminalen Spaltprodukte quantifiziert. Das Testsystem kann durch eine SDS-PAGE-Analyse der Probe Proben unterstützt werden; eine anschließende fluoreszierende in Gel-Visualisierung kann unmittelbar nach der Elektrophorese oder nach in-Gel Renaturierung der nondenatured und denaturierten fluoreszierenden Komponenten, bzw.14angewendet werden.
Die Flexibilität und die Struktur der "Klonen Kassette" erlauben eine Zeit- und kosteneffiziente Einfügung einer Vielzahl von Sequenzen in das Konstrukt und fördert somit die Generation der Substrat-Bibliotheken. Da alle Test-Schritte Automatisierung und HTS-kompatibel sind, kann das System besonders attraktiv für, zum Beispiel werden Protease Spezifität Messungen und Mutagenese Studien oder es auch effektiv für industrielle Protease-Inhibitor-Screening genutzt werden kann und/oder antivirale Medikamentenentwicklung.
Enzym kinetische Parameter (kKatze, Km) können durch die entwickelten Trennung basierende Assays bestimmt werden; Daher kann es einzelne Enzym kinetische Messungen, z. B. den Zeitverlauf, Substrat-abhängige und Hemmung Studien geeignet sein. Dies beweist, dass die rekombinante Fusion Protein Substrate gute Alternativen für die häufig eingesetzten synthetischen Oligopeptid-Substrate bieten, und aufgrund ihrer hohen Ähnlichkeit mit der funkionalen Substrate, sie repräsentieren die natürlich vorkommenden Enzym-Substrat-Interaktionen genauer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10K Amicon tubes</td>
			<td style="width:269px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC501096</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">M6250</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;">1610148</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">100063</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Agarose</td>
			<td style="width:269px;">SERVA</td>
			<td style="width:137px;">11404.04</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Alpha Imager HP gel documentation system</td>
			<td style="width:269px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A3678</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A9518</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">392185</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Black half-area plates</td>
			<td style="width:269px;">Greiner bio-One</td>
			<td style="width:137px;">675086</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">B0126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">CutSmart buffer (10x)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7204S</td>
			<td style="width:191px;">For plasmid linearization (step 1.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:269px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:137px;">DR-45M</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">M0303L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dynamag-2&#160;magnetic particle&#160;concentrator</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12321D</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Escherichia coli BL21(DE3) competent cells&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">C600003</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethanol</td>
			<td style="width:269px;">Merc-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">100983</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">798681</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7024S</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycerol</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">356350</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">G7126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">High-Speed Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:269px;">GeneAid</td>
			<td style="width:137px;">PD300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Imidazole</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">56750</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">AM9464</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Jouan CR 412 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Jouan</td>
			<td style="width:137px;">CR412</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Labinco LD-76 Rotator&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Labinco</td>
			<td style="width:137px;">7600</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L3022</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Lysozyme&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L6876</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:269px;">Scharlau</td>
			<td style="width:137px;">MA0036</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MERCK eurolab ultrasonic bath</td>
			<td style="width:269px;">MERCK</td>
			<td style="width:137px;">USR54H</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Millifuge Eppendorf spin centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">CT10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T9281</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NheI-HF restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R3131L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nickel(II) sulfate (NiSO4)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">656895</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ni-NTA magnetic agarose beads&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">36113</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">OS-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PacI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R0547L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PageBlue Protein Staining Solution&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">24620</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P7626</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Protein Lobind Micro-centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">22431102</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:269px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Snijders Press-to-Mix shaker&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Gemini</td>
			<td style="width:137px;">34524</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-acetate trihydrate</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S7670</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-chloride</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S9888</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S5881</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">S7563</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:269px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M180A</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Thermo shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">TS-100</td>
			<td style="width:191px;">with SC-24 accessory block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tris</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T1503</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tween 20</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P2287</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter</td>
			<td style="width:269px;">Wallac Oy, Turku, Finland</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation

Proteasen sind intensiv untersuchten Enzyme aufgrund ihrer wesentlichen Aufgaben in mehreren biologischer Signalwege von lebenden Organismen und Pathogenese; Sie sind daher wichtige Drogeziele. Wir haben eine magnetische-Agarose Bead-basierte Test-Plattform für die Untersuchung der proteolytischen Aktivität entwickelt, auf den Einsatz von rekombinanten Fusion Protein Substrate basiert. Um die Verwendung von diesem Testsystem zu zeigen, wird ein Protokoll am Beispiel des humanen Immundefizienz-Virustyp 1 (HIV-1) Protease vorgestellt. Die eingeführten Assay-Plattform genutzt werden effizient in die biochemische Charakterisierung der Proteasen, einschließlich der Enzym-Aktivität-Messungen in Mutagenese, kinetische, Hemmung oder Spezifität Studien, und es möglicherweise für Hochdurchsatz-geeignet Substrat-Screening oder anderen proteolytischen Enzymen angepasst werden kann.
In diesem Testsystem Spaltstellen für Tabak Ätzen Virus (TEV) und HIV-1-Proteasen und eine C-terminale fluoreszierenden Proteins, der eingesetzten Substrate enthalten N-terminalen Hexahistidine (seine6) und Maltose-bindende Protein (MBP) Tags. Die Substrate in Escherichia coli Zellen effizient herstellbar und leicht gereinigt mit Nickel (Ni) - Chelat - beschichtete Perlen. Während der Test führt der proteolytische Spaltung von Perle befestigt Substraten zur Freisetzung fluoreszierende Spaltung Fragmente, die durch Fluorimetry gemessen werden kann. Darüber hinaus können die Spaltung Reaktionen von Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert werden. Ein Protokoll für die in-Gel-Renaturierung von Assay Komponenten ist auch beschrieben, wie teilweise Renaturierung von fluoreszierenden Proteinen ihre Erkennung anhand Molekulargewicht und Fluoreszenz ermöglicht.

Abbildung 1A zeigt den schematischen Aufbau der ein repräsentatives Leuchtstoffröhren rekombinantes Protein-Substrat, das auf seine spezifische Spaltung Website Abfolge von HIV-1 PR verarbeitet werden kann. Abbildung 1 b stellt die Substrat-Produktion und ihre Einsatzmöglichkeiten in Protease Assays, einschließlich Ni-NTA magnetischer Wulst-basierende Assays und/oder Seite.
Um zuverlässige Daten von Fluorimetry zu erhalten, ist eine Kalibrierung erforderlich, um die Mengen an fluoreszierenden Substrate und Spaltprodukte zu bestimmen. Hierzu die Fluoreszenz Intensitätswerte der verschiedenen Substrate in den verschiedenen Pufferbedingungen gemessen werden müssen und ihre Konzentrationen im definierten Konzentrationsbereich (Abbildung 3) korreliert werden müssen. Die Neigungswerte die Kalibrierkurven können angewendet werden, um die Mengen an Substraten und Spaltprodukte in der Assay-Proben zu bestimmen. Die Pisten der Kalibrierkurven sind unabhängig von der Spaltung Website Sequenzen in den Substraten (Tabelle 11) eingefügt und können für eine Reihe von Substraten verschmolzen auf die gleiche Art von fluoreszierenden Proteins genutzt werden. Zoom-in Graphen sind für alle lineare Regressionen, die unteren Konzentrationsbereichen sowie zu vergrößern (Abbildung 3) dargestellt. Es ist wichtig zu beachten, dass die Kalibrierung muss sorgfältig durchgeführt werden, da eine ordnungsgemäße Verteilung der Datenpunkte für eine zuverlässige Kalibrierung erforderlich ist. Aus diesem Grund wird zweifach serielle Verdünnung angewendet, um Vorbereitung der Proben für die Kalibrierung, weil der R-2 -Wert zeigt eine gute Korrelation zwischen der Konzentration des fluoreszierenden Proteins und Fluoreszenz nur dann, wenn eine ausreichende Anzahl von Datenpunkten wurden zur Deckung des gesamten Konzentrationsbereichs. Darüber hinaus können experimentellen Fehler sehr beeinflussen die Genauigkeit der Kalibrierung; so kann auch eine grafische Auswertung der Regression Linien erforderlich sein.
Eine Vielzahl von enzymatischen Messungen erfolgt durch die Protease Assays, einschließlich einer Untersuchung der Wirkung von der Substratkonzentration auf die Geschwindigkeit der Reaktion (Abb. 4A). Durch nicht-lineare Regression können die Daten zur Bestimmung Enzym kinetische Parameter (z. B. Vmax und Km) verwendet werden. Eine unzureichende Wulst Federung und Streuung und eine falsche Reaktion Kündigung verursachen suboptimale Ergebnisse (Abbildung 4 b), die sich nicht für die Berechnung der kinetischen Werte zuverlässig Enzym eignen.
Eine Abhängigkeit von der Produktbildung pünktlich kann (zum Beispiel bei der Optimierung der Spaltung Reaktionsparameter) Assay (Abb. 5A) bestimmt. Enzym-Aktivität im Beisein eines Inhibitors kann auch untersucht (Abb. 5 b) für die Bestimmung der aktiven Enzym Konzentration und hemmenden konstant. Mit der gleichen Methode, können Effekte von anderen Inhibitoren auch von den Assay untersucht.
Die Protease-Assay ist nützlich, wenn untersuchen die Auswirkungen des pH-Wertes auf Enzym-Aktivität. Abbildung 6A stellt die Abhängigkeit der Enzymaktivität von pH am Beispiel des TEV PR, hat einen breiten optimale pH-Bereich (pH 6-9). Wenn die pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität studiert (oder Enzyme mit einer optimalen sauren pH-Wert gemessen werden müssen), ist es notwendig zu berücksichtigen, dass die Affinität Bindung des rekombinanten Substrate, die Perlen im leicht sauren pH-Wert eingeschränkt sein kann. Eine erhöhte Dissoziation der Substrate aus Perlen (Abb. 6 b) verursachen eine Verzerrung der Untersuchungsergebnisse. Um die spontane Substrat Dissoziation von Perlen zu betrachten, die Messwerte für Reaktion Proben von denen B-Proben korrigiert werden müssen.
Abbildung 7 zeigt, dass die nondenatured fluoreszierende Proteine im Gel anhand ihrer Farbe unterschieden werden können mit blauem Licht Durchleuchtung (Abbildung 7A). Wenn die Bestimmung der Molmassen der Substrate/Spaltung Fragmente notwendig ist, kann denaturierenden Bedingungen auch für die Probenvorbereitung, verwendet werden, da fluoreszierende Proteine können teilweise renaturierte im Gel, und durch UV-Beleuchtung erfasst werden können (Abb. 7 b) oder durch Coomassie-Färbung (Abbildung 7). Wenn die R-Proben analysiert werden, sind nur die C-terminale Spaltprodukte sichtbar (Abbildung 7), während die N-terminale Spaltung Fragmente und die uncleaved Substrate die Perlen befestigt bleiben. Gelegentlich, Proteine können teilweise denaturiert werden, trotz Verwendung von nondenaturing Bedingungen (Abbildung 7), und zwar die nondenatured Proteine reichlicher, denaturierte Formen sind auch in der Probe nachweisbar. Dieses Phänomen hat keinen Einfluss auf die Erkennung der proteolytischen Spaltung aber muss bei quantitativen Densitometrie nondenatured Proben in Betracht kommen.
Obwohl die detaillierte Beschreibung nur für einen 2-mL-Tube-basierte Assay angezeigt wird, kann der Assay angepasst für eine 96-Well-Platte-basiertes System (Abbildung 8), werden in unserem Labor (nicht dargestellt) bereits erfolgreich getestet wurde. Die 96-Well-Platte angepasst-Format ist voll kompatibel mit der fluorimetrischen und elektrophoretischen Analysen, sowie, und die gewonnenen Daten können auch basierend auf den in diesem Artikel beschriebenen Methoden ausgewertet werden.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> Abbildung 3 : Kalibrierkurven. Repräsentative Substrat Kalibrierkurven werden demonstriert am Beispiel der beiden rekombinanten Substrate verschmolzen zu verschiedenen C-terminale fluoreszierende Tags: (A und B) seine6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 und (C und D ) Seine6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zoom-in Zahlen sind auch gezeigt, dar, die lineare Regression der Datenpunkte in der 0-0,005 mM Substrat Konzentrationsbereich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> Abbildung 4 : Ermittlung der kinetischen Parameter Enzym. Substrat-abhängige kinetische Messungen wurden von HIV-1-PR (an eine aktive Endkonzentration von 41,2 nM). Die Anfangsgeschwindigkeit Werte wurden gegen die Substratkonzentration aufgetragen und eine nicht-lineare Regressionsanalyse Michaelis-Menten wurde durchgeführt. Die Fehlerbalken darzustellen SD (n = 2). (A) A repräsentatives optimales Ergebnis zeigt sich am Beispiel von seinem6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple Fusion Protein Substrat. (B) ein repräsentatives suboptimales Ergebnis zeigt sich auch für seine6- MBP-KARVL * AEAM mTurquoise2 Substrat, wo die Einstellung der richtigen Substrat-Konzentrationen problematisch wegen eine ungenügende Homogenisierung der Vorratslösung SAMB war , während relativ hohe Fehler durch falsche Reaktion Terminierung verursacht wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> Abbildung 5 : Zeitverlauf und hemmenden Studie. (A) Seine 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP rekombinanten Fusion Protein Substrat (auf eine Endkonzentration von 0,00326 mM) wurde von HIV-1 PR gespalten (an eine aktive Endkonzentration von 41,2 nM), und die Freisetzung von fluoreszierenden PIVQ mEYFP proteolytischen Fragmente wurde gemessen führen Sie eine Analyse der zeitlichen Verlauf. Die Messungen wurden an fünf verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. Die Fehlerbalken darzustellen SD (n = 2). (B) seine6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP wurde als Substrat (bei 0,0015 mM) verwendet, um festzustellen, die hemmende Wirkung von Amprenavir auf die Aktivität des HIV-1-PR (bei einer totalen Konzentration von 163,8 nM). Plotten, die Daten, die halbe maximale inhibitorische Konzentration (IC50) beurteilt werden konnte, und die aktive Enzym-Konzentration (eine aktive Endkonzentration von 41,2 nM) der angewandten HIV-1 PR könnte auch werden berechnet auf der Grundlage der Hemmung-Kurve. Die Fehlerbalken darzustellen SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> Abbildung 6 : Studium der Abhängigkeit der Enzymaktivität und spontane Substrat Dissoziation auf pH. (A) die seine6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 Substrat (in 0,033 mM) wurde verwendet, um die Enzymaktivität der TEV PR messen (an eine totale Endkonzentration von 91.42 nM) im Dekolleté Polsterset einem anders pH-Wert zwischen 6,5-8,5-Bereich. Die Fehlerbalken darzustellen SD (n = 2). Die gezeichneten Daten wurde vorher14veröffentlicht. (B) anhand der relativen fluoreszierende Intensitätswerte der Substrat leer Proben, die spontane Spaltung seiner6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 Substrat (0,033 mM) von der magnetischen Beads wurde mithilfe von Spaltung Puffer untersucht mit einem anders pH-Wert zwischen 6,0-8,5. Die gezeichneten Daten wurde vorher14veröffentlicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> Abbildung 7 : Erkennung von Proteinen im Gel mit verschiedenen Methoden. (A) Uncleaved und HIV-1 PR verdaut Fusion Protein Substrate nach nondenaturing Probenvorbereitung wurden durch blaues Licht durchleuchtbaren nach SDS-PAGE visualisiert. Die Spaltung Reaktion erfolgte durch in-Lösung Verdauung. (B) unmittelbar nach der Seite nur nondenatured Proteine nachgewiesen werden konnte im Gel durch UV-Beleuchtung, während nach der Entfernung der SDS, der zuvor denaturiert fluoreszierende Proteine wurde teilweise renaturierte und nachweisbar. Die Proben wurden von der Überstände des Ni-NTA magnetische-Perle-basierte Tests vorbereitet. (C) Coomassie-Färbung kann auch für die Erkennung von Proteinen nach der Renaturierung in Gel verwendet werden. Die SDS-Gegenwart in der Gel-Mai der partiellen Denaturierung des nativen Proteins verursachen, aber in nativen Proben, die nondenatured Formen sind häufiger. Die Proben wurden von der Überstände des Ni-NTA magnetische-Perle-basierte Tests vorbereitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> Abbildung 8 : 96-Well-Platte-basierte Anpassung der Assay-Plattform. (A) der Test durchgeführt werden kann, nicht nur in 2 mL-Tuben, sondern in den Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Hier zeigen wir die schematische Darstellung für die Anwendung des Tests zu studieren die Spezifität des fiktiven Protease mithilfe einer Reihe von fluoreszierenden Substrate, enthalten Wildtyp (wt) oder mutierte (Mut-1-Mut-4) Spaltung Website Sequenzen. Für den Umgang mit magnetischen Beads, soll ein 96-Well kompatibel Magnetpartikel Konzentrator (MPC) in den Experimenten verwendet werden. Die angegebenen Mengen beziehen sich auf einen einzigen Brunnen. Um die Effizienz der Spaltung der verschiedenen Substrate zu vergleichen, kann Substrat Konvertierung aus dem Prozentsatz der Substrat-Blank-korrigierte RFU Werte der Reaktion Proben, wenn man bedenkt das Substrat-Blank-korrigierte RFU Werte der damit zusammenhängenden beurteilt werden Substrat Kontrollproben als 100. (B) nach Fluorimetry, die getrennten Überstände des Assays Proben auch von PAGE und die fluoreszierende Protein-Komponenten analysiert werden können direkt oder nach-Gel Renaturierung bei nondenaturing und Geruchsstoffen Probe analysiert werden können Vorbereitung, beziehungsweise. Die drei verschiedenen Assay Probentypen sind auch in jeder Abbildung illustriert: C = Substrat Control, B = Substrat leer und R = Reaktion. Substrat Kontrollproben sind im Elution Buffer, während das Substrat leer und die Reaktion Proben im Dekolleté Puffer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Puffer</td>
			<td>Fluoreszierendes protein</td>
			<td>CV % der Pisten (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elution</td>
			<td rowspan="2">mTurquoise2</td>
			<td>6.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dekolleté</td>
			<td>9.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elution</td>
			<td rowspan="2">mApple</td>
			<td>10,92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dekolleté</td>
			<td>12.68</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 11: Koeffizient der Varianz (CV %) Werte von den Hängen des Substrat-Kalibrierkurven. Um zu testen ob die Fluoreszenz des rekombinanten Proteins Substrate der eingefügten Spaltstelle abhängt, wurden Kalibrierungen durch Reihe von mApple und mTurquoise2 verschmolzen Substrate (sechs Varianten für die einzelnen, mit verschiedenen Spaltstelle durchgeführt. Sequenzen von HIV-1 Protease), beide in Elutions- und Spaltung Puffern. Wir fanden, dass CV %-Werte der Piste unter 15 % auf jeden Fall, was bedeutet, dass eine einzelnes Substrat-Kalibrierung für die Bewertung der verschiedenen Messungen von Substrat-Varianten mit der gleichen fluoreszierende Beschriftung genutzt werden kann.

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Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Hier präsentieren wir Ihnen die Einzelheiten des Verfahrens einer neu entwickelten Protease Assays Plattform nutzen N-terminalen Hexahistidine/Maltose-bindendes Protein und fluoreszierende Protein fusioniert rekombinante Substrate an der Oberfläche der Nickel-Nitrilotriacetic befestigt saure magnetische Agarose Korne. Eine anschließende Gelanalyse der Assay-Proben durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt wird ebenfalls dargestellt.

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Proteasen sind eine der am häufigsten untersuchten Gruppen biomolekularer Unterstützungen in der akademischen und industriellen Forschung. Ihre starke Rolle in mehreren physiologischen und pathologischen Prozessen macht sie zu einem prominenten Ziel auch auf dem Gebiet der Drogenentdeckung. In Bezug auf ihre intensive Forschung besteht ein großer und kontinuierlicher Bedarf an zeit- und kostensparenden Hochdurchsatz-Screening-kompatiblen Fluoreszenz-Protease-Assay-Plattformen.Hier möchten wir ein Protokoll für die Anwendung einer separationsbasierten, hochdurchsatzfähigen Screening-kompatiblen Fluoreszenz-Assay-Plattform einführen, die sowohl mTurquoise2- als auch mApple-fused rekombinante Fusionsproteasesubstrate verwendet. Zusätzlich möchten wir ein Verfahren zur In-Gel-Renaturierung der Substrate und der Spaltungsfragmente der Assayproben nach der Denaturierung von SDS-PAGE demonstrieren. Alle Experimente werden am Beispiel der HIV-1-Virusprotease durchgeführt.Der Ausdruck Plasmid trägt die Kodierungssequenz eines Hexa Histin-Affinitäts-Tags und eines Maltose-bindenden Fusionsproteins, gefolgt von einer Kontrollspaltungsstelle der Tabak-Etch-Virus-Protease, einer Klonkassette und einem C-terminalen fluoreszierenden Protein. Linearisieren Sie den Ausdruck Plasmid durch PacI- und NheI-Restriktionsendonukleasen. Führen Sie das Glühen des Escherichia coli codon optimiert vorwärts und umgekehrt Oligonukleotid-Primer, die Code für die Substratsequenz von Interesse und Flanke von PacI und NheI kohäsive Enden.Führen Sie das Einfügen der geglühten Primer in das linearisierte Expressionsplasmid durch Ligation durch. Zur Proteinexpression BL21(DE3)kompetente Zellen durch das Ligationsgemisch transformieren. Die fluoreszierenden Proteine befinden sich erst nach erfolgreicher Ligation im selben offenen Leserahmen mit den N-Terminal-Fusions-Tags.Wenige Tage nach der Transformation zeigen die Kolonien, die den Ausdruck Plasmid enthalten, der die eingefügte Spaltstelle von Interesse kodiert, sichtbare Fluoreszenz mit oder sogar ohne Verwendung eines blauen Transilluminators des Dunklen Readers. Fügen Sie 10 Mikroliter Glycerinbestand der BL21(DE3)Zellen, die die Expression Plasmid-Codierung für die Spaltung Website Sequenz von Interesse zu fünf Milliliter LB Medium enthält 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Inkubieren Sie die Suspension bei 37 Grad für 15 Stunden, während ständig schütteln.Übertragen Sie fünf Milliliter Bakterienkultur auf 50 Milliliter frisches LB-Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin. Wachsen Sie die Zellen bei 37 Grad auf eine Absorption von 0,6 bis 0,8 bei 600 Nanometer Wellenlängen. An diesem Punkt, induzieren Proteinexpression durch die Zugabe von IPTG.Danach bebrüten Sie die Kultur für drei Stunden bei 37 Grad, während sie ständig zittern. Nach der Inkubation 25 Milliliter der Kultur in saubere 50 Milliliter Zentrifugenrohre übertragen und die Zellen per Zentrifugation ernten. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie die bakteriellen Zellpellets mindestens eine Stunde lang bei minus 70 Grad.Zellpellets, die die erfolgreich exprimierten fluoreszierenden Proteine enthalten, zeigen deutlich eine Fluoreszenz mit oder sogar ohne Verwendung eines blauen Transilluminaators von Dark Reader. Das gefrorene Zellpellet auf Eis legen und 15 Minuten auftauen lassen. Fügen Sie dem Pellet zwei Milliliter Lysepuffer hinzu und setzen Sie die Zellen aus.Danach proteame Inhibitor hinzufügen, die Suspension durch Lyzozym und DNase frei, suspendieren die Zellen, und inkubieren die Suspension auf Eis für 15 Minuten. Zwei Mal eine Milliliter-Aufhängung in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre geben und die Suspensionen drei Minuten lang in Runden von 10 Sekunden Beschallung und fünf Sekunden Pause beschallen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 10.000 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur.Gelöschte bakterielle Zelllysate, die das fluoreszierende Substrat von Interesse enthalten, zeigen sichtbare Fluoreszenz mit oder sogar ohne Verwendung eines blauen Transilluminaators von Dark Reader. Das Verfahren des entwickelten Protease-Assays beginnt mit der Herstellung der Assayproben. Erstens werden die rekombinanten Substrate mit der Affinität magnetischeRinnen inkubiert, und die substratgebundenen Magnetperlen, abgekürzt als SAMBs, werden gebildet.SAMBs werden mehrmals gewaschen, und schließlich wird die SAMB-Lagerlösung durch die Aliquotierung vorbereitet, aus der Assayproben erstellt werden. Die Reaktionen werden durch zugabe der Proteaselösung initialisiert. Nach Derspaltung durch die Protease werden die proteolytischen Fragmente in den Überstand freigesetzt.Die Reaktion wird durch die Trennung der magnetischen Perlen vom Reaktionspuffer beendet, der die fluoreszierenden Spaltungsprodukte und das Enzym enthält. Die Überstandstoffe werden auf die Brunnen einer Mikrotiterplatte aufgetragen und die Fluoreszenz wird durch Fluorimmetrie bestimmt. Kalibrierkurven werden mit gereinigten fluoreszierenden Substraten erzeugt, die in jedem Assaypuffer gelöst werden.Die Konzentration der C-Terminal-Fluoreszenzspaltungsprodukte sowie der des in den Assayproben aufgebrachten Substrats werden anhand der Steigung der Kalibrierkurven bestimmt. Legen Sie die Röhre mit neuen oder recycelten Nickel-NPA-Magnetagaroseperlen in einen magnetischen Partikelkonzentrator. Perlen können an der Wand und/oder in den Deckel des Mikrozentrifugenrohrs kleben.Drehen Sie daher den Konzentrator in alle Richtungen auf den Kopf, um sicherzustellen, dass alle Perlen gesammelt werden. Entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. 1,8 Milliliter Lysepuffer zu den Perlen geben und die geschlossenen Rohre aus dem Konzentrator entfernen.Hängen Sie die Perlen in der Röhre durch Schütteln und/oder Drehen des Rohres auf den Kopf, bis die Perlen vollständig homogen sind. Legen Sie die Rohre wieder in den Konzentrator und drehen Sie sie in alle Richtungen auf den Kopf, um sicherzustellen, dass alle Perlen gesammelt werden. Öffnen Sie das Rohr und entsorgen Sie den Überstand.Löschendes bakterielles Lysat, das das substratdes Substrat enthält, hinzufügen und das geschlossene Rohr aus dem Konzentrator entfernen. Drehen Sie die Rohre auf den Kopf, bis die Perlen vollständig homogen sind und drehen Sie die Rohre mit Rotator, langsam, bei Raumtemperatur für 30 Minuten. SAMBs zeigen sichtbare Fluoreszenz mit oder sogar ohne Verwendung eines blauen Transilluminators von Dark Reader.Waschen Sie die SAMBs dreimal um 1,8 Milliliter 1%Tween 20, Waschpuffer und Dekolletépuffer. Fügen Sie den gewaschenen SAMBs einen Spaltungspuffer hinzu, um eine SAMB-Lagerlösung zu erstellen. Bei Verwendung von zwei Milliliter-Protein-Niedrigbindungs-Mikrozentrifugenröhren beträgt das Volumen des aufgebrachten Spaltungspuffers bis zu 1,9 Milliliter.Nach dem Hinzufügen des Puffers, schütteln oder drehen Sie das Rohr nicht auf den Kopf. Schließen Sie das Rohr und entfernen Sie es aus dem Konzentrator. Bereiten Sie zwei Milliliter Protein-niedrig bindende Mikrozentrifugen-Röhren für die Assay-Proben vor.Setzen Sie die SAMB-Lagerlösung aus, bis sie vollständig homogen ist, und messen Sie die Menge des substrats, das in den Reaktionen analysiert werden soll, indem Sie die SAMB-Lagerlösung sofort in die Probenfläschchen übertragen. Das Volumen der zu übertragenden SAMB-Lagerlösung wird auf 25 bis 300 Mikroliter empfohlen, soll aber nach dem individuellen Versuchsdesign eingestellt werden. Legen Sie die Probenröhrchen, die die aliquoteden SAMB-Aufhängungen enthalten, in den Konzentrator.Entfernen Sie den Überstand vorsichtig aus den SAMBs und entsorgen Sie ihn. Entfernen Sie die Rohre aus dem Konzentrator und fügen Sie den Reaktionspuffer vorsichtig zu den SAMBs hinzu. Das Volumen des zugesetzten Reaktionspuffers ist nach dem individuellen Versuchsdesign zu berechnen, es wird jedoch empfohlen, das Endvolumen des Reaktionsgemisches zwischen 50 und 150 Mikroliter nzuzen, wenn Zweimilliliter-Röhren verwendet werden.Schließen Sie die Deckel der Rohre. Jetzt sind die Proben für die Initialisiert. Fügen Sie die Enzymlösung zu den Reaktionsproben hinzu.Rühren Sie die Perlen vorsichtig auf, indem Sie die Rohre vorsichtig bewegen und die Rohre sofort in den bereits schüttelnden Thermoshaker legen. Bei Substrat-Rohproben und Substratkontrollproben je nach Substrat-Leer- und Elutionspuffer hinzufügen. 30 Sekunden vor dem Ende der Inkubation, nehmen Sie die Probe aus dem Thermoshaker und drehen Sie sie prompt.Legen Sie das Rohr auf den Konzentrator und lassen Sie das Rohr 15 Sekunden stehen. Die Sammlung der SAMBs kann durch leichtes Hin- und Herbewegen des Konzentrators erleichtert werden. Öffnen Sie den Deckel und übertragen Sie den Überstand vorsichtig in eine Platte oder ein neues Rohr.Berühren Sie die konzentrierten Perlen nicht an der Spitze der Pipette. Der gesammelte Überstand der Substratkontrollproben und der Reaktionsproben mit einem hohen Dekolletégrad kann eine sichtbare Fluoreszenz mit oder sogar ohne Verwendung eines blauen Transilluminaators von Dark Reader aufweisen. Zwei Mal 30 Mikroliter der abgetrennten Probenüberstandmittel in eine schwarze Halbflächen-Mikroplatte übertragen.Messen Sie die Fluoreszenz durch Fluorimeter mit den entsprechenden Filtern entsprechend dem angewendeten Fluoreszenzprotein. Für die Reinigung der fluoreszierenden Substrate die gleiche Lösung wie zuvor beschrieben vorbereiten und den Überstand entsorgen. 400 bis 600 Mikroliter Elutionspuffer zu den SAMBs geben und die Rohre bei Raumtemperatur fünf Minuten lang langsam rotieren.Übertragen Sie das Eluat in neue proteinarme Mikrozentrifugenröhrchen. Es zeigt deutlich sichtbare Fluoreszenz mit oder ohne Verwendung eines blauen Transilluminaators von Dark Reader. Nach Reinigung, Pufferaustausch und Messung des Proteingehalts eine doppelte serielle Verdünnung in mindestens acht Schritten, sowohl aus dem Elution-Puffer-als auch aus dem Spaltungspuffer gelösten Substratlösungen, mit Elution bzw. Dekolletépuffer zur Verdünnung.Übertragen Sie 30 Mikroliter jedes Verdünnungspunktes in eine schwarze Halbflächen-Mikroplatte. Messen Sie die Fluoreszenz nach Fluorimeter mit den gleichen Einstellungen, die bei der Messung der Assay-Probe Überstände angewendet wurden. Als Beispiel für die Datenverarbeitung wurden die substratabhängigen kinetischen Messungen der HIV-1-Protease an einer mTurquoise2-fused Form des rekombinanten Substrats durchgeführt, das die Spaltungsstelle zwischen der Matrix und den Kapsidproteinen im natürlichen klaffenden Proteinvorläufer kodiert.Zeichnen Sie die korrigierten relativen Fluoreszenzintensitätswerte gegen die Molkonzentration der gereinigten Substrate, lösen Sie entweder den Spaltungs- oder Elutionspuffer und führen Sie eine lineare Regression durch. Berechnen Sie die Molkonzentration der C-Klemmenspaltungsprodukte in den Reaktionsproben mit der Steigung der spaltpufferbasierten Kalibrierkurve. Berechnen Sie auch die aufgebrachte Substratkonzentration in den Reaktionsproben auf Basis der Molkonzentration des eluierten Substrats in den Substratkontrollproben unter Verwendung der Steigung der elutionspufferbasierten Kalibrierkurve.Die Anfangsgeschwindigkeitswerte wurden aus der Menge der C-Klemmenspaltungsfragmente berechnet und dann gegen die aufgebrachte Substratkonzentration aufgeplottet. Auch kinetische Parameter wurden durch die nichtlineare Regressionsanalyse von Michaelis-Menten bestimmt. Nach der Durchführung des Nickel-NTA-Magnetperlen-basierten Assays können die Assay-Überschärbe auch durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert werden.Neben der Analyse der Assayproben ist es jedoch auch möglich, die gereinigten fluoreszierenden Substrate und/oder die Spaltungsfragmente nach der In-Lösung-Verdauung zu analysieren. Zur In-Lösung-Verdauung die gereinigten fluoreszierenden Substrate, die im Spaltungspuffer in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren verdaut werden sollen, aliquoten und die Enzymlösung zu den Proben hinzufügen. Inkubieren Sie die Proben nach dem experimentellen Design und beenden Sie die Reaktionen durch das Verfahren der Probenvorbereitung für PAGE.Mischen Sie die zu analysierenden Proben für die nicht denaturierte Probenvorbereitung mit einem nicht dentierenden Probenladepuffer, der keine Reduktionsmittel enthält. Mischen Sie im Falle der denaturierten Probenvorbereitung die zu analysierenden Proben mit dem Denaturierungsprobenladepuffer und setzen Sie die Proben 10 Minuten lang bei 95 Grad einer Wärmebehandlung aus. Die nicht denaturierten und die denaturierten Proben in die Brunnen des SDS-Polyacrylamid-Gels auftragen und Elektrophorese durchführen.Entfernen Sie die Gelkassette aus dem laufenden Modul. Nicht denaturierte Proben sind im Gel bereits mit bloßem Auge oder mit dem Blauen Transilluminator Dark Reader sichtbar. Um die fluoreszierenden Komponenten der denaturierten Proben auf dem Transilluminator zu detektieren, führen Sie die In-Gel-Renaturierung durch Waschen des SDS aus dem Gel durch.100 Milliliter destilliertes Wasser in das Gel geben und mindestens 30 Minuten abspülen. Visualisieren Sie die fluoreszierenden Proteine, indem Sie das ungefärbte Gel auf den blauen Transilluminator von Dark Reader legen. Die rekombinanten fluoreszierenden Fusionsproteine wurden entwickelt, um als Substrate in proteolytischen Assays verwendet zu werden.Bei Spaltung durch die Protease an der spezifischen Spaltstelle wird das C-terminale fluoreszierende Spaltungsfragment freigesetzt und seine Fluoreszenz kann nachgewiesen werden. Ihre Verwendung in Nickel-NTA-Magnetperlen-basierten Assays und die Fluoreszenzdetektion durch PAGE-Analyse wurden mit HIV-1-Protease optimiert. Die entwickelte Assay-Plattform kann jedoch auch für andere Proteasen geeignet sein.Kalibrierkurven der in Spaltungs- oder Elutionspuffer gelösten gereinigten Substrate werden an den Beispielen der mTurquoise2- und mEYFP-verschmolzenen Form des rekombinanten Substrats veranschaulicht, das die Spaltseite zwischen der Matrix und den Kapsidproteinen des natürlichen HIV-Anechoproteins kodiert. Der Nickel-NTA-Magnetperlen-Assay ist ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Wirkung der Substratkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit und ermöglicht damit auch die Bestimmung der enzymkinetischen Parameter wie Vmax und Km. Diagramm A zeigt ein optimales Ergebnis, das nach einer erfolgreich durchgeführten Analyse der substratabhängigen Aktivität auf einem mApple-verschmolzenen Substrat erzielt wurde.Im Gegensatz dazu stellt Diagramm B ein suboptimales Ergebnis dar, bei dem die unzureichende Homogenisierung der SAMB-Lagerlösung Probleme bei der Einrichtung der richtigen Substratkonzentrationen verursacht, während eine unsachgemäße Beendigung der Reaktionsproben zu relativ hohen Fehlern führt. Der Assay bietet auch ein geeignetes Werkzeug für die Durchführung von Zeit-Kurs und hemmende Studien sowie. Diagramm A zeigt die zeitliche Abhängigkeit der proteolytischen Spaltung der HIV-1-Protease auf einem mEYFP-gebundenen Substrat, während Diagramm B die hemmende Wirkung von Amprenavir auf die Spaltungsreaktion darstellt.Aus den durch die hemmende Studie gewonnenen Daten können sowohl die aktive Enzymkonzentration als auch die hemmende Konstante bestimmt werden. Der Assay kann auch optimiert werden, um die Abhängigkeit der Enzymaktivität vom pH-Wert zu untersuchen, wie er durch Diagramm A am Beispiel der Tabak-Etch-Virus-Protease dargestellt wird. Schaubild B weist auf eine Begrenzung des Assays durch pH-Wert hin und zeigt, dass neutraler oder leicht alkalischer pH-Wert vollständig mit den Messungen kompatibel ist, während saurer pH-Wert die spontane Trennung der Substrate von der Oberfläche der Magnetperlen erleichtert.Die vorliegende Abbildung zeigt die gereinigten intakten fluoreszierenden Substrate, die fluoreszierenden C-terminalen Spaltungsfragmente, die durch in-Solution-Verdauung durch HIV-1-Protease erzeugt werden. Die fluoreszierenden Komponenten können im SDS-haltigen Polyacrylamid-Gel durch Blaulichttransillumination direkt nach der Elektrophorese nachgewiesen werden, wenn während der Probenvorbereitung nicht denaturierende Bedingungen angewendet wurden. Die verschiedenen fluoreszierenden Proteine können je nach Farbe unterschieden werden.Nach dem magnetischen Perlentest können die nicht denaturierten fluoreszierenden Proteine in den Probenüberbleibsanten auch durch UV-Beleuchtung im Gel nachgewiesen werden. Wenn hingegen während der Probenvorbereitung Denaturierungsbedingungen angewendet werden, können die denaturierten Proteine nicht unmittelbar nach der SDS-SEITE im Gel nachgewiesen werden. Die denaturierten fluoreszierenden Proteine können jedoch durch die Entfernung des SDS aus dem Gel teilweise renaturiert und nachweisbar werden.Daher folgt auf die SDS PAGE das In-Gel-Renaturierungsverfahren. Die Renaturierungsfähigkeit der fluoreszierenden Proteine ermöglicht ihre Identifizierung nicht nur auf der Grundlage ihrer Fluoreszenz, sondern auch aufgrund ihres Molekulargewichts. Hier haben wir das Protokoll für den Einsatz unserer kürzlich entwickelten magnetperlenbasierten fluoreszierenden Protease-Assay-Plattform demonstriert.Wir haben die Verwendung dieses Systems am Beispiel von enzymkinetischen Studien zur HIV-1-Protease nachgewiesen. Wir verwendeten mTurquoise-und mApple-fused Formen des rekombinanten Assaysubstrats, das die Spaltungs-Standortsequenz der Protease enthielt. Neben der fluorimetrischen Analyse wurden die Assay-Proben anschließend auch von SDS PAGE analysiert.Wir haben gezeigt, dass die denaturierten fluoreszierenden Proteine im Gel nach SDS PAGE teilweise renaturiert werden können, was sowohl eine fluoreszierende als auch molekulare Identifizierung des Substrats und der proteolytischen Fragmente ermöglicht.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Forschung

Biochemie

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Wie den Anteil der photoaktiviert fluoreszierende Proteine in großen Mengen und in lebenden Zellen zu quantifizieren

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluoreszierende silberne Färbung von Proteinen im Polyacrylamid-Gele

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Messung von Wechselwirkungen zwischen fluoreszierenden Sonden und Lignin in Pflanzenabschnitten durch sFLIM basierend auf nativer Autofluoreszenz

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Charakterisierung zellulärer Proteine mit in-zelliger schneller photochemischer Oxidation von Proteinen

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Plattform-Inkubator mit beweglicher XY-Stufe: Eine neue Plattform zur Implementierung der in-Cell schnellen photochemischen Oxidation von Proteinen

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...