Name: use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00
Duration: 19 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

עבודה זו היה נתמך בחלקה על ידי הפרויקט "יצירת צוותים PHARMPROT" GINOP-2.3.2-15-2016-00044 ובמימון, בנוסף, השכלה גבוהה התוכנית מצוינות המוסדי של משרד של הקיבולות האנושי בהונגריה, במסגרת ביוטכנולוגיה נושאיות במגמה אוניברסיטת דברצן. המחברים מודים חברי המעבדה של Retroviral ביוכימיה על עזרתם המדעי במהלך פיתוח assay וגם בשל סבלנותם במהלך הצילומים וזמינותו (במיוחד כדי נורברט Kassay, Joóné Matúz בשיא ו. נכון, ונדה מאוד- מי מופיעים ברקע של הוידאו). המחברים גם רוצה להגיד מיוחדת הודות Gedeon ריכטר Plc., במיוחד ד ר זולטאן Urbányi עבור המאפשר העבודה של Beáta Bozóki למחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית כחוקרת חוות. המחברים גם רוצה להרחיב את תודתם ג'רג Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi של זולטאן Király מולטימדיה ו- E-learning מרכז טכני אוניברסיטת דברצן על הסיוע המקצועי של וידאו ושמע ייצור.

<ol>
	<li>Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+Combinatorial+Assays+for+the+Determination+of+Protease+Activity+and+Inhibition.">Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition.</a> Molecular Informatics. 24 (10), 1141-1148 (2005).</li><li>Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biotechnological+aspects+of+microbial+proteases.">Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3), 597-635 (1998).</li><li>Zhang, G., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+assays.">Protease assays.</a> The Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Woelcke, J., Hassiepen, U., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+biochemical+assay+formats.">Fluorescence-based biochemical assay formats.</a> A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. , (2010).</li><li>Richardson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determination+and+use+of+optimized+protease+substrates+in+drug+discovery+and+development.">The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development.</a> Current Pharmaceutical Design. 8 (28), 2559-2581 (2002).</li><li>Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mapping+protease+specificity.">Methods for mapping protease specificity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 46-51 (2007).</li><li>Schilling, O., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-derived,+database-searchable+peptide+libraries+for+identifying+protease+cleavage+sites.">Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites.</a> Nature Biotechnology. 26 (6), 685-694 (2008).</li><li>Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+protease+activity+assay+using+heat-sensitive+Tus-GFP+fusion+protein+substrates.">Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates.</a> Analytical Biochemistry. 415 (2), 126-133 (2011).</li><li>Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP+based+assay+for+the+determination+of+hydrolytic+activity+and+substrate+specificity+of+subtilisins+under+washing+conditions.">A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions.</a> Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).</li><li>Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+for+site-specific+proteases+using+bead-attached+GFP+substrate.">In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate.</a> Biotechniques. 31 (5), 1194-1198 (2001).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+bioluminescence+resonance+energy+transfer-fluorescence+resonance+energy+transfer-based+ratiometric+protease+assays+with+fusion+proteins+of+firefly+luciferase+and+red+fluorescent+protein.">Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 239-245 (2011).</li><li>Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fusion+protein+platform+for+quantitatively+measuring+activity+of+multiple+proteases.">A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases.</a> Microbial Cell Factories. 13 (1), 44 (2014).</li><li>Fox, J. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maltose-binding+protein+as+a+solubility+enhancer.">Maltose-binding protein as a solubility enhancer.</a> Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).</li><li>Boz&#243;ki, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+fusion+protein-based,+fluorescent+protease+assay+for+high+throughput-compatible+substrate+screening.">A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening.</a> Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).</li><li>M&#243;ty&#225;n, J. A., Miczi, M., Boz&#243;ki, B., T&#246;zs&#233;r, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+supporting+Ni-NTA+magnetic+bead-based+fluorescent+protease+assay+using+recombinant+fusion+protein+substrates.">Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates.</a> Data in Brief. 18, 203-208 (2018).</li><li>Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+characterization+of+maturation+time+of+fluorescent+proteins+in+living+cells.">Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells.</a> Nature Methods. 15, 47-51 (2018).</li><li>Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+variation+of+fluorescence+protein+maturation+times+in+closely+related+Escherichia+coli+strains.">High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains.</a> PLoS One. 8, e75991 (2013).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

עקב החקירות התעשייה והאקדמיה אינטנסיבית של אנזימים הפרוטאוליטי ואת הביקוש האמריקנית ובמחיר של פלטפורמות וזמינותו של השודדים תואמי פרוטאז קבוע בהתאם, פיתחנו פרוטאז פלורסנט מגנטית מבוססת על חרוז וזמינותו. וזמינותו מבוסס על השימוש של חלבונים פיוז'ן רקומביננטי, אשר יכול להיות הרומן חלופות סובסטרטים פפטיד סינתטי שימוש נרחב.
בתבנית assay מפותחת, מצעים חלבון פיוז'ן הם מתאושש למשטחים של חרוזים ני chelate-מצופה agarose מגנטי. הקובץ המצורף המצע מסופק על ידי N-מסוף שלו תג קירבה6 החלבון פיוז'ן, אשר ישירות דבוקה תג MBP על מנת להקל על קיפול ולשפר את המסיסות במים המצע13. MBP ואחריו אתרים המחשוף של יחסי ציבור אס, פרוטאז עניין. לשעבר עשוי לשמש אתר המחשוף שליטה וזמינותו, בעוד שהשני יוכל לעבד את פרוטאז להיחקר. האתר מחשוף הוא להחלפה; dsDNA קצר רצף קידוד עבור האתר המחשוף עניין שניתן להוסיף גמיש "שיבוט בקלטת' של פלסמיד הביטוי על-ידי מצדו. החלבונים פיוז'ן רקומביננטי מכילה תג יציב מאוד, monomeric חלבון פלואורסצנטי במסוף C-, אשר מאפשרת זיהוי נקודת הקצה תשתחרר-אנזים, פלורסנט C-מסוף המחשוף המוצרים שפורסמו על המחשוף הפרוטאוליטי ( איור 1A). מצעים שלם פלורסנט מטוהרים נפתר במאגרי שונים משמשים גם לצורך כיול כדי להעריך את ריכוזי טוחנת מצעים ומוצרי המחשוף. בנוסף, לאחר fluorimetry, הרכיבים assay ניתן לנתח מאת מרחביות-דף, כמו גם. שניהם ילידי (nondenatured), שפגע בסימני חלבונים פלורסנט להיות visualized הג'ל, מיד לאחר אלקטרופורזה או לאחר renaturation הבאים בג'ל, בהתאמה. נוספים בהליך השילוב קונבנציונאלי כחול מבריק Coomassie מכתים-מאי לשמש ביעילות עבור האימות של התוצאות assay (איור 1B).
ההליך assay מורכב מהשלבים פשוטים, קל-אל-ביצוע בתבנית בנפח נמוך עשוי להיות מותאם באופן מלא כדי סביבה אוטומטית תפוקה גבוהה. עם זאת, באופן עצמאי מלבצע את הבדיקה באופן ידני או באמצעות מערכת אוטומציה, בחלקים הבאים של וזמינותו נחשבים להיות מכרעת ואני צריך תשומת לב מיוחדת תוך כדי ביצוע ההליך. i) ההומוגניות של הפתרון מגנטי חרוז. פתרון חרוז מגנטי הומוגני יש להשתמש בכל רחבי וזמינותו, הן טיהור ושטיפת צעדים. במיוחד, האמינות של מבחני פרוטאז בחוזקה תלוי כראוי aliquoting הפתרונות מניות צמוד-מצע מגנטי חרוז (SAMB). על מנת להגביר את היעילות של השעיה, פיזור, מומלץ להגדיר את הריכוז חרוז בין 2% ל- 10% (v/v). במהלך הכנת הדוגמא, השימוש של מאגרי בתוספת אבקת nonionic (כגון טריטון X-100 או Tween 20) עד 2% יכול גם להקטין את הדבקות של חרוזים מגנטי משטחי פלסטיק. הדבקות של החרוזים הקירות של מבחנות דגימה יכולה להימנע אם המתלים חרוז חלות בתשומת לב שהסוליות של הבקבוקונים במקום על גבי הקירות של צינורות מדגם. ההומוגניות של חרוזים מגנטי במהלך התגובה אנזימטי חיוני גם ומבטיחים יכול להיות ע י ניעור באופן רציף את הדגימות-600 סל ד בתקופת הדגירה. חרוזים מופצים כראוי בסחורות פלסטיק מעוגל או שהונעו, בזמן השימוש בקבוקונים V-התחתון אינו מומלץ. תוצאה שיוצרת הנגרמת על ידי חרוז פסולים המגון מיוצג באיור 4B. ii) סיום של דגימות התגובה.  יתרון נוסף של השיטה הוא כי התגובה אנזימטי יכולה להיפסק ללא שימוש טיפול דנטורציה בחום או כל חומרים כימיים שעלולים מפריעות15. גם לאחר סיום יכול להתבצע בפשטות על-ידי הפרדת את החרוזים מגנטי מעירוב התגובה, באמצעות רכז חלקיקים מגנטיים קונבנציונלי. בעוד המאגר התגובה שהוסר מכיל את האנזים פעיל והמוצרים המחשוף פלורסנט C-מסוף שנוצר, מצעים uncleaved יישארו מחוברים החרוזים. בשל נוכחותם של האנזים פעיל במאגר של התגובה, ההליך ההפרדה צריך להתבצע בקפידה לצורך זיהוי נקודת הקצה אמין. לפני הצבת הבקבוקונים מדגם לתוך במסוע, מומלץ להחיל צנטריפוגה סיבוב קצר. לאחר הנחת הצינורות לתוך במסוע, לספק לפחות 15 s עבור החרוזים להיות שנאספו. תנועה קלה למפריד הגב וושוב עשוי להקל על האוסף של החרוזים. אנא שקול, במהלך פרידה שבוצעו באופן ידני, גם לאחר סיום בדרך כלל לוקח זמן רב יותר החניכה של התגובות. לכן, עיכוב מין רשומים כ- 2 מומלץ בין חנוכת אם באותו זמן דגירה צריך לחול על כל הדגימות.
עקרון וזמינותו הפרוטאוליטי המתואר היא יחסית פשוטה; עם זאת, צדדיות של המערכת מובטחת על ידי המבנה המצע גמיש ויציב. אופטימיזציה בודדים של וזמינותו מוגבלים רק על ידי התאימות של חרוזים זיקה עם תנאים יישומית, ריאגנטים, תוספים. מסכים עם הפרוטוקול של היצרן, מצאנו גם כי הכריכה זיקה של סובסטרטים למשטחים חרוז Ni-נ באופן משמעותי מחליש-pH ≤ 6.515. לכן, מומלץ ליישם את המצע ריק דגימות במקביל הדוגמאות התגובה, הקצב של דיסוציאציה ספונטנית המצע צריך להיחשב במהלך הערכת תוצאות.
במקרים אלה, שבו לא ניתן לבצע מבחני מגנטית מבוססת על חרוז עקב השימוש של רכיבים חרוז-לא תואם או pH נמוך, עיכול בפתרון סובסטרטים רקומביננטי מטוהרים ניתן גם ליישם. במקרים אלה, ניתן לנתח את תערובות התגובה על ידי אלקטרופורזה, ניתן לאבחן את החלבונים הג'ל מבוסס על הפרוטוקול המתואר. לחקור פעילות הפרוטאוליטי, בפתרון לעיכול, זיהוי בג'ל של החלבונים יכול להיות גם כלים חלופיים של fluorimetry. חידוש של מערכת המצע מעוצב הוא היישום של שלב בג'ל renaturation לאחר denaturing מרחביות-דף. בעוד חלבונים פלורסנט (nondenatured) יליד לשמור שלהם פלורסצנטיות במהלך אלקטרופורזה, המאפיין פלורסנט פוליטי על דנטורציה (איור 7 ב). עם זאת, ידי קרינה פלואורסצנטית של חלבונים שפגע בסימני ניתן לשחזר חלקית על ידי הסרת מרחביות של הג'ל. לפיכך, הפרדה של רכיבי התגובה באמצעות תנאים denaturing מאפשר לא רק את מבוסס על קרינה פלואורסצנטית אלא זיהוי מולקולרי-לפי משקל. יתרון נוסף של הזיהוי בג'ל פלורסנט לעומת הניתוח של ג'ל שהוכתמו Coomassie הוא כי ניתן לזהות בקלות החלבונים פלורסנט (מקורי או renatured) הג'ל מבוסס על קרינה פלואורסצנטית שלהם (ראה איור 7). זה עשוי להיות חשוב אם המחשוף תגובות מבוצעות דגימות המכילים מזהמים nonfluorescent או חלבונים מאוד דמוי משקולות מולקולרית של אחד את השני.
מבחני פרוטאז שימוש דומה מצעים מעוצב כבר פורסם בעבר8,9,10, ולמרות האתר המחשוף של הריבית באותם מקרים גם היה ממוקם בין תג זיקה ו- a חלבון פלואורסצנטי, מערכת assay שהוצגו כאן לא רק חוזר על הרעיונות המתואר אבל משלב את היתרונות השונים של פלטפורמות הקודם, גם משלים אותם עם שיפורים נוספים: i) הניצול של שותף פיוז'ן MBP, השני) נוכחות של אתר המחשוף שליטה אס PR, השלישי) השימוש מהונדסים לאחרונה FPs monomeric, ו- iv) היישום של תהליך כיול המצע ייחודי. וזמינותו עצמו תוכנן במיוחד כדי להיות שימושי עבור אנזים ירידה לפרטים ולימודי קינטי בכספת, אופן זמן - ו וחסכוניים, ללא צורך מכשור יקר. השיטה מיועדת להיות כלי מתאים ובמחיר למטרות מחקר אקדמיים ותעשייתיים בשני. בשל הגמישות של 'בקלטת שיבוט' של פלסמיד הביטוי, המערכת עשוי להיות מתאים עבור הדור מהירה וזולה של ספריות המצע רקומביננטי. וזמינותו המתוארים במסמך זה הוא כלי ריאלי עבור יישום היחודיות המצע, אנזים מוטגנזה מכוונת, ועיכוב מחקרים, גם, לספק כלי אלטרנטיבי לבצע קינטיקה אנזימטית. פלטפורמת assay (מתוך תא החיידק disruption קביעת הפרמטרים קינטי) ניתן להתאים סביבה HTS-אוטומציה מבוססי ואת, באופן פוטנציאלי, ניתן להחיל סינון מעכב פרוטאז תעשייתי ו/או תרופה קוטלת נגיפים פיתוח. בנוסף, הסתגלות of וזמינותו עבור proteolysis תחרותי הוא גם בעתיד היקף המעבדה שלנו. ב- assay כזה תחרותי, שני שונים סובסטרטים, כל המכיל אתר המחשוף שונים דבוקה אצבע שונות C-מסוף פלורסנט תג-הם נועד לשמש בו זמנית ב אותה התגובה המחשוף לחקור את ההעדפה של למדה האנזים על הרצף יעד נתון. יתר על כן, השימוש בטופס 96-ובכן הותאם צלחת assay (איור 8) גם להיות ממוטבת להקרנה מוטציה באמצעות סדרה של מצעים עם מחשוף ששונה רצפים האתר במקרה של פרוטאזות ציסטאין.

אנזימים הפרוטאוליטי שייכים לקבוצות אנזים ובדוקים באופן אינטנסיבי ביותר בשל חשיבותם מסלולים מטבוליים, יישומים תעשייתיים, כמו גם. תפקיד המפתח שלהם מחלות ויראליות, ויסות קרישת, סרטן הדם, הלב וכלי הדם מחלות ניווניות גורם פרוטאזות מטרות הבולטים בתחום גילוי תרופות. לכן, אפיון מפורט היחודיות המצע פרופיל מעכב הפרוטאז (PR) עניין מרכזי ויש רצוי מתבצע על ידי מבחני הביוכימי מהירים, חסכוניים, חזקים1,2, 3.
כיום, הרוב המכריע של מבחני פרוטאז במבחנה מיושם בתחום גילוי סמים עבור יצירת פרופילים מורכבים הן הומוגניות, פלורסנט מבוססת על פפטיד, תפוקה גבוהה ההקרנה (HTS)-פלטפורמות תואם4. יתר על כן, פפטידים שכותרתו אינם מתאימים להקרנה הספרייה בלבד, אך הם גם מציעים כלים נהדרים הקביעה של אנזים פרמטרים קינטי סובסטרטים שנבחרו. במקרים אחרים, שבהם תיוג של המצע אינה אפשרית, מבחני המבוססות עשויה לספק פתרון אפשרי כדי להעריך את מאפייני תגובות הפרוטאוליטי3קינטי.
באופן כללי, מבחני פרוטאז במבחנה מבוססים על השימוש בשני סוגי המצע: קצר פפטידים או כל החלבונים. במקרים אלה, בהם המחשוף של רצפים קצרים פפטיד משקפות את המאפיינים המחשוף מספיק, חלים סטנדרטי לנקוט בגישות הבאות: (א) בחינת סובסטרטים חלבון סטנדרטית כמו אינסולין מחמצנים B-שרשרת, (ii) בדיקות מצעים זמינים מסחרית של פרוטאזות אחרים, (iii) הקרנה ספריות פפטידים סינתטיים ומתויגים fluorescently שנוצר על ידי כימיה קומבינטורית, או (iv) תוך שימוש בשיטות גנטיות, למשל, ביולוגית להציג טכנולוגיות5, 6. מלבד הסיווג קונבנציונאלי, פלטפורמות הרומן אחרות זמינים גם לדור המצע (למשל, היווצרות של ספריות נגזר פרוטאום פפטיד7 או תתי סוגים מיוחדים בשיטות גנטיות, כמו הפיוז'ן רקומביננטי חלבון מבוססת סובסטרטים8,9,10,11,12).
כל סוגי המצע הנ ל מבחני יש יתרונות ומגבלות משלהם, פיתוח פורמטים assay המשלב ו/או לשפר את היתרונות של פלטפורמות מוכרות הוא עדיין ביקוש. כאן נתאר פרוטוקול להצפנה וזמינותו המבוססות פרוטאז פלורסנט, אשר מנצל סובסטרטים רקומביננטי. חלבונים אלה פיוז'ן מורכב שלו6 ו- MBP תגיות התמזגו המחשוף שליטה באתר של אס ציבור, אשר מלווה את רצף המצע עניין המחובר ישירות C-מסוף חלבון פלואורסצנטי (FP) (איור 1 א'). השיבוט של רצף ה-DNA קידוד אתר המחשוף עניין לתוך 'בקלטת שיבוט' יכול להתבצע על ידי תגובת מצדו יחיד לתוך פלסמיד הביטוי, אשר יש כבר לליניארית בעבר על ידי הגבלת endonucleases.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> איור 1: עקרון וזמינותו פרוטאז פלורסנט. (א) ייצוג סכמטי של מצע פלורסנט, המחשוף שלה על ידי וירוס הכשל החיסוני האנושי סוג 1 (HIV-1) פרוטאז מוצג. החץ מציין את מיקום המחשוף בתוך הרצף באתר מטריקס/capsid המחשוף של פרוטאז HIV-1 (VSQNY * PIVQ). (B) פלורסנט סובסטרטים יכול לשמש כדי לנתח אנזים תגובות וזמינותו מגנטית מבוססת על חרוז Ni-נ ועל ידי לזיהוי בג'ל, וכן, כפי שמוצג בדיאגרמה של זרימת העבודה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
אף על פי מבחני הפרוטאוליטי שימוש דומה חלבון רקומביננטי סובסטרטים המכילות תג קירבה אתר הפרוטאוליטי המחשוף, יש חלבון פלואורסצנטי כבר תוארו8,9,10, המערכת הציגו כאן בכוונת לשלב ולשפר על היתרונות של שיטות אלה. הבדל חשוב הוא סובסטרטים חלבון פיוז'ן פלטפורמה זו assay מצוידים MBP מכיל אתר המחשוף הבקרה עבור אס PRs ולשפר מסיסות חלבון13 . יתר על כן, מצעים מכילים חלבונים פלורסנט דור חדש, אשר יציב מאוד, יש טופס monomeric כדי למנוע צבירת המצע. מלבד היישום שפורסמו בעבר mTurquoise2 - ו מאפל-התמזגו טפסים14, כאן אנו גם מראים התוצאות ניתנה על ידי שימוש מצע רקומביננטי המכיל של monomeric משופרת תגית פלורסנט צהובות חלבון פלואורסצנטי (mEYFP). בזאת אנו מדגימים את התאימות של המערכת עם חלבונים אחרים פלורסנט, מייצגים כמה סוגים כלליים של התוצאות ניתן לרכוש באמצעות וזמינותו פרוטאז.
החלבונים פיוז'ן רקומביננטי מבוטאים בתאים BL21(DE3) e. coli ו משמשים סובסטרטים וזמינותו בחומצה ניקל-nitrilotriacetic (Ni-נ)-מצופה מגנטי-agarose-חרוז-מצורף טופס. C-מסוף המחשוף המוצרים הם משוחררת מהמשטח חרוז לתוך תגובת שיקוע על המחשוף ע י פרוטאז עניין. לאחר ההפרדה של תגובת שיקוע (מכיל את האנזים והמוצרים המחשוף) של החרוזים מגנטי, ניתן למדוד את קרינה פלואורסצנטית כדי לקבוע את המאפיינים המחשוף של האנזים. בניגוד השיטות שתוארו, במערכת המובאים כאן, הכמויות של המצע ומוצרים המחשוף C-מסוף הן באופן ייחודי לכמת בהתבסס על הליך הכיול המצע מפורט. מערכת assay ייתמכו על-ידי ניתוח מרחביות-דף של הדגימות assay; פריט חזותי בג'ל פלורסנט הבאים ניתן להחיל מיד לאחר אלקטרופורזה או לאחר את renaturation בג'ל המרכיבים nondenatured, שפגע בסימני פלורסנט, בהתאמה14.
הגמישות ואת המבנה של "בקלטת שיבוט" לאפשר של הכנסה זמן - ו וחסכוניים של מגוון רחב של רצפי לתוך הבונה ומקדמת, לפיכך, הדור של ספריות המצע. מאז כל השלבים assay אוטומציה ו HTS-תואם, המערכת יכולה להיות אטרקטיביים במיוחד, למשל, פרוטאז ירידה לפרטים מדידות, מחקרים מוטגנזה מכוונת, או זה עשוי גם להיות יעיל מנוצל להקרנה מעכב פרוטאז תעשייתי ו/או פיתוח תרופה קוטלת נגיפים, גם כן.
אנזים פרמטרים קינטי (kהחתול, Km) יכול להיקבע על ידי וזמינותו המבוססות מפותחות; לכן, זה עשוי להיות מתאים לביצוע מדידות קינטי אנזים בודדים, כגון המחקרים זמן כמובן תלויי-המצע, עיכוב. זה מוכיח כי סובסטרטים חלבון רקומביננטי פיוז'ן לספק חלופות טובות סובסטרטים שימוש תכוף oligopeptide סינתטי, בשל דמיון גבוהה שלהם מצעים polyprotein, שהם מייצגים את באופן טבעי אנזים-סובסטרט אינטראקציות באופן מדויק יותר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10K Amicon tubes</td>
			<td style="width:269px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC501096</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">M6250</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;">1610148</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">100063</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Agarose</td>
			<td style="width:269px;">SERVA</td>
			<td style="width:137px;">11404.04</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Alpha Imager HP gel documentation system</td>
			<td style="width:269px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A3678</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A9518</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">392185</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Black half-area plates</td>
			<td style="width:269px;">Greiner bio-One</td>
			<td style="width:137px;">675086</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">B0126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">CutSmart buffer (10x)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7204S</td>
			<td style="width:191px;">For plasmid linearization (step 1.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:269px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:137px;">DR-45M</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">M0303L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dynamag-2&#160;magnetic particle&#160;concentrator</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12321D</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Escherichia coli BL21(DE3) competent cells&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">C600003</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethanol</td>
			<td style="width:269px;">Merc-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">100983</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">798681</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7024S</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycerol</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">356350</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">G7126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">High-Speed Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:269px;">GeneAid</td>
			<td style="width:137px;">PD300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Imidazole</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">56750</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">AM9464</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Jouan CR 412 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Jouan</td>
			<td style="width:137px;">CR412</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Labinco LD-76 Rotator&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Labinco</td>
			<td style="width:137px;">7600</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L3022</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Lysozyme&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L6876</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:269px;">Scharlau</td>
			<td style="width:137px;">MA0036</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MERCK eurolab ultrasonic bath</td>
			<td style="width:269px;">MERCK</td>
			<td style="width:137px;">USR54H</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Millifuge Eppendorf spin centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">CT10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T9281</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NheI-HF restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R3131L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nickel(II) sulfate (NiSO4)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">656895</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ni-NTA magnetic agarose beads&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">36113</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">OS-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PacI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R0547L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PageBlue Protein Staining Solution&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">24620</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P7626</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Protein Lobind Micro-centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">22431102</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:269px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Snijders Press-to-Mix shaker&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Gemini</td>
			<td style="width:137px;">34524</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-acetate trihydrate</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S7670</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-chloride</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S9888</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S5881</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">S7563</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:269px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M180A</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Thermo shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">TS-100</td>
			<td style="width:191px;">with SC-24 accessory block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tris</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T1503</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tween 20</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P2287</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter</td>
			<td style="width:269px;">Wallac Oy, Turku, Finland</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation

פרוטאזות הם אנזימים למד באופן אינטנסיבי בשל התפקידים החיוניים שלהם מספר מסלולים ביולוגיים של אורגניזמים חיים, פתוגנזה; לכן, הם מטרות תרופה חשובה. פיתחנו פלטפורמה מגנטי agarose חרוז-מבוססת על שיטת החקירה של פעילות הפרוטאוליטי, אשר מבוססת על השימוש של סובסטרטים חלבון רקומביננטי פיוז'ן. כדי להדגים את השימוש במערכת זו assay, פרוטוקול מוצג על הדוגמה של סוג וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1) 1 פרוטאז. פלטפורמת assay הציג יכול להיות מנוצל ביעילות איפיון ביוכימי של פרוטאזות, כולל מדידות פעילות האנזים מוטגנזה מכוונת, קינטי, עיכוב או ירידה לפרטים מחקרים, והוא עשוי להיות מתאים עבור תפוקה גבוהה המצע הקרנה או שעשוי להיות מותאם אנזימים הפרוטאוליטי אחרים.
במערכת זו assay, סובסטרטים יישומית מכילה N-מסוף hexahistidine (שלו6) ותגים חלבון (MBP) מחייב מלטוז, המחשוף אתרים בחברת טבק לחרוט וירוס (אס), HIV-1 פרוטאזות חלבון פלואורסצנטי C-מסוף. מצעים יכול להיות מיוצר ביעילות בתאים Escherichia coli וטיהרו בקלות באמצעות חרוזים מצופים - chelate - ניקל (Ni). במהלך וזמינותו, מוביל המחשוף הפרוטאוליטי של סובסטרטים צמוד-חרוז שחרורו של שברי ביקוע פלורסנט, אשר נמדד על ידי fluorimetry. בנוסף, ניתן לנתח תגובות ביקוע על ידי נתרן dodecyl סולפט-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד). עבור renaturation בג'ל של רכיבים assay פרוטוקול מתוארת גם, כפי renaturation חלקית של חלבונים פלורסנט מאפשרת גילוי שלהם מבוסס על משקל מולקולרי זריחה.

איור 1A מציג את מבנה סכמטי של מצע נציג חלבון רקומביננטי פלורסנט אשר ניתן לעבד על ידי HIV-1 יחסי ציבור-הרצף באתר שלו המחשוף ספציפיים. איור 1B מייצג את הייצור המצע שלהם יישומים אפשריים במבחני פרוטאז, כולל assay מגנטית מבוססת על חרוז Ni-נ ו/או דף.
כדי לקבל מידע אמין על-ידי fluorimetry, הליך הכיול נדרש, על מנת לקבוע את הכמויות של סובסטרטים פלורסנט ומוצרים המחשוף. בשביל זה, ערכי העוצמה של זריחה של סובסטרטים שונים בתנאים שונים המאגר צריך להימדד ויש צורך בקורלציה שלהם ריכוזי בטווח ריכוז לבדיקה (איור 3). ניתן להחיל את ערכי השיפוע של עקומות כיול כדי לקבוע את הכמויות של מצעים ומוצרי המחשוף הדגימות וזמינותו. המדרונות של עקומות כיול עצמאיים של הרצף האתר המחשוף מוכנס לתוך סובסטרטים (טבלה 11) והוא יכול לשמש באופן פוטנציאלי עבור סדרה של סובסטרטים התמזגו לאותו סוג של חלבון פלואורסצנטי. זום-אין גרפים מוצגים עבור כל regressions ליניארית, כדי להגדיל את הטווחים ריכוז נמוך יותר גם (איור 3). חשוב לציין כי הכיול צריך להתבצע בזהירות כי חלוקה נכונה של נקודות נתונים נדרש כיול אמין. מסיבה זו, דילול טורי כפולה מוחל להכין הדגימות כיול, כי הערך2 R מציין מתאם טוב בין את הריכוז של חלבון פלואורסצנטי פלורסצנטיות רק אם מספר מספיק של נקודות נתונים שימשו כדי לכסות את טווח הריכוז כולו. יתר על כן, שגיאות ניסיוני יכול מאוד להשפיע על הדיוק של הכיול; לפיכך, הערכה גרפי של קווי הרגרסיה עשויים להיות גם כן
מגוון רחב של מידות אנזימטי יכול להתבצע על ידי פרוטאז וזמינותו, כולל בחינה של השפעת ריכוז המצע על מהירות התגובה (איור 4A). מאת רגרסיה לא ליניארית, הנתונים ניתן לקבוע פרמטרים קינטי אנזים (למשל, vmax ו- Km). ההשעיה של חרוז לא מספיק ואת פיזור של סיום התגובה לא תקין עלול לגרום תוצאות שיוצרת (איור 4B), אשר אינם מתאימים עבור חישוב ערכים קינטי אנזים אמין.
התלות של היווצרות המוצר בזמן יכול להיקבע על ידי וזמינותו (איור 5A) (למשל, במהלך אופטימיזציה של הפרמטרים התגובה המחשוף). פעילות אנזים בנוכחות מעכב יכול להיות גם חקירה (איור 5B) על הקביעה של ריכוז האנזים פעיל ו קבוע מעכבות. באמצעות המתודולוגיה אותו, ההשפעות של מעכבי אחרים יכולים גם להיות מוקרן על ידי וזמינותו.
וזמינותו פרוטאז שימושית כאשר חוקרים את השפעת pH על פעילות האנזים, גם כן. איור 6A מייצג את התלות של פעילות אנזים pH מהדוגמה של ציבור אס, אשר כולל מגוון pH אופטימלי רחב (pH 6-9). אם התלות ה-pH על פעילות האנזים הוא למד (או אנזימים שיש של אופטימום pH חומצי צריך להימדד), יש לקחת בחשבון כי הכריכה זיקה של סובסטרטים רקומביננטי כדי החרוזים עשוי להיות מוגבל ב- pH חומצי מעט. דיסוציאציה מוגברות של סובסטרטים של החרוזים (איור 6B) עלול לגרום עיוות של התוצאות וזמינותו. כדי לשקול את הדיסוציאציה המצע ספונטנית של החרוזים, הערכים שנמדדו עבור התגובה דגימות צריך לתקן על ידי אלה דוגמאות B.
איור 7 מראה כי החלבונים פלורסנט nondenatured ניתן להבחין בין הג'ל מבוסס על הצבעים שלהם, באמצעות transillumination אור כחול (איור 7 א). אם הקביעה של משקולות מולקולרית של קטעים מצעים/מחשוף הוא הכרחי, denaturing תנאים יכול לשמש גם עבור הכנת הדוגמא, בגלל החלבונים פלורסנט יכולה להיות חלקית renatured הג'ל, יכול להתגלות על ידי תאורה UV (איור 7 ב) או על-ידי Coomassie מכתים (איור 7C). אם הדגימות R מנותחים, רק את המוצרים המחשוף C-מסוף הם גלויים (איור 7C), בעוד שברי ביקוע N-מסוף ותערובות uncleaved יישארו מחוברים החרוזים. לעיתים, חלבונים עשויה להיות חלקית שפגע בסימני למרות שימוש בתנאים nondenaturing (איור 7C), ואילו החלבונים nondenatured שופע יותר, שפגע בסימני טפסים הם גם לזיהוי במדגם. תופעה זו אינה משפיעה הגילוי של פצילות הפרוטאוליטי אבל צריך לקחת בחשבון במקרה של densitometry כמותית של דגימות nondenatured.
למרות תיאור מפורט מוצג רק עבור 2 מ"ל-צינור מבוססי assay, וזמינותו ניתן להתאים למערכת 96-ובכן המבוסס על צלחת (איור 8), אשר כבר נבדק בהצלחה במעבדה שלנו (לא מוצג). התבנית הותאם צלחת 96-ובכן הוא תואם באופן מלא עם fluorimetric, ניתוחים electrophoretic, כמו גם, והוא נתונים המתקבלים גם ניתן להעריך על סמך בשיטות המתוארות במאמר זה.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> איור 3 : עקומות כיול. עקומות כיול המצע נציג מודגמות לדוגמה של שני מצעים רקומביננטי התמזגו לתגים פלורסצנט C-מסוף שונים: (A ו- B) - MBP-VSQNY שלו6* PIVQ-mTurquoise2, (ג , D ) - MBP-VSQNY שלו6* PIVQ-mEYFP. זום-אין דמויות מוצגים גם לייצג את הרגרסיה הליניארית של נקודות נתונים ב- 0-0.005 mM טווח ריכוז המצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> איור 4 : קביעת פרמטרים קינטי אנזים. מדידות קינטי תלויי-המצע בוצעו על ידי HIV-1 יחסי ציבור (בריכוז הפעיל הסופי של 41.2 ננומטר). הערכים מהירות התחלתית שורטטו כנגד ריכוז המצע ובוצע ניתוח רגרסיה לא ליניארית קינטיקת מיכאליס-מנטן. קווי השגיאה מייצגים SD (n = 2). (א) A תוצאה אופטימלית נציג מוצג עם הדוגמה של6שלו - MBP-VSQNY * לסובסטרט חלבון פיוז'ן PIVQ-מאפל. התוצאה שיוצרת נציג (B) A מוצג גם שלו6- MBP-KARVL * המצע AEAM-mTurquoise2, איפה ההגדרה של ריכוז המצע המתאים היה בעייתי עקב המגון לא מספיקות של הפתרון מניות SAMB , ואילו שגיאות גבוה יחסית נגרמו על ידי סיום התגובה לא תקין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> איור 5 : חקר זמן-קורס או מעכבות. (א) שלו 6- MBP-VSQNY * לסובסטרט חלבון רקומביננטי פיוז'ן (ב ריכוז הסופי של 0.00326 מ מ) היה ביקע מאת PR HIV-1 PIVQ-mEYFP (בריכוז הפעיל הסופי של 41.2 nM), ואת שחרורו של פלורסנט שברי הפרוטאוליטי PIVQ-mEYFP נמדדה כדי ביצוע ניתוח זמן כמובן. המדידות בוצעו בחמש נקודות זמן שונות. קווי השגיאה מייצגים SD (n = 2). (B) - MBP-VSQNY שלו6* PIVQ-mEYFP שימש המצע (ב מ מ 0.0015) כדי לקבוע את ההשפעה המעכבת של amprenavir על הפעילות של יחסי ציבור HIV-1 (בריכוז מוחלט של 163.8 ננומטר). על ידי התוויית הנתונים, חצי הריכוז המעכב מקסימלי (IC50) יכול להיות מוערך וריכוז האנזים פעיל (ריכוז הפעיל הסופי של 41.2 ננומטר) של HIV-1 יישומית ליחסי ציבור יכול גם להיות מחושב בהתבסס על העקומה עיכוב. קווי השגיאה מייצגים SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> איור 6 : לומד תלות של פעילות אנזים, דיסוציאציה המצע ספונטנית על תואר דוקטורט (א) שלו - MBP6-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 המצע (ב- 0.033 מ"מ) נעשה שימוש כדי למדוד את פעילות האנזים אס PR (ב ריכוז מוחלט הסופי של 91.42 ננומטר) במאגר המחשוף מוגדר pH שונים, בין הטווח של 6.5-8.5. קווי השגיאה מייצגים SD (n = 2). הנתונים המותווים כבר פורסם בעבר14. (B) על סמך ערכי העוצמה פלורסנט היחסי של הדגימות ריק המצע, הדיסוציאציה ספונטנית שלו6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 המצע (0.033 מ מ) בין החרוזים מגנטי נחקר על-ידי שימוש המחשוף מאגר עם pH שונים, בין 6.0-8.5. הנתונים המותווים כבר פורסם בעבר14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> איור 7 : גילוי חלבונים הג'ל על ידי שיטות שונות- Uncleaved (א) ו- HIV-1 יחסי ציבור-מעוכלים פיוז'ן סובסטרטים חלבון לאחר הכנת הדוגמא nondenaturing היו דמיינו ידי transillumination אור כחול אחרי מרחביות-עמוד. התגובה המחשוף בוצע על ידי עיכול תוך-פתרון. (B) מיד לאחר העמוד, חלבונים nondenatured רק יכול להתגלות הג'ל על ידי תאורה UV, ואילו לאחר הסרת מרחביות, החלבונים פלורסנט בעבר denatured הפך חלקית renatured, לזיהוי. הדגימות הוכנו מ supernatants של וזמינותו מגנטית מבוססת על חרוז Ni-נ. ת. (ג) Coomassie מכתים יכול לשמש גם לגילוי חלבון, לאחר renaturation בג'ל. ההווה-מרחביות הג'ל-מאי דנטורציה חלקית את החלבון מקורי, אבל בדגימות מקורית, הצורות nondenatured שופע יותר. הדגימות הוכנו מ supernatants של וזמינותו מגנטית מבוססת על חרוז Ni-נ. ת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> איור 8 : 96-ובכן עיבוד מבוסס-צלחת של פלטפורמת assay. (א) וזמינותו יכול להתבצע לא רק 2 mL צינורות אלא הבארות של צלחת 96-ובכן, גם כן. הנה אנחנו מראים על ייצוג סכמטי של יישום וזמינותו ללמוד יחודיות של פרוטאז בדויים באמצעות סדרה של מצעים פלורסנט, אשר עשוי להכיל פראי-סוג (wt) או מוטציה (mut-1 mut-4) המחשוף האתר רצפים. טיפול מגנטי החרוזים, רכז תואם 96-ובכן חלקיקים מגנטיים (MPC) יש להשתמש בניסויים. בכל אמצעי האחסון שצוין קשורות לבאר בודדת. כדי להשוות את יעילות המחשוף סובסטרטים, המצע המרה יכול להיות מוערך מן האחוז של ערכים RFU המצע-ריק-מתוקן של הדגימות התגובה, שוקל את הערכים RFU המצע-ריק-מתוקן של הקשור המצע דגימות הבקרה כמו 100. (B) לאחר fluorimetry, את supernatants מופרדים של וזמינותו דגימות ניתן לנתח גם על-ידי דף ולאחר הרכיבים חלבון פלואורסצנטי ניתן לנתח באופן ישיר או לאחר בבית-ג'ל renaturation במקרה של מדגם nondenaturing, denaturing הכנה, בהתאמה. שלושת הסוגים לדוגמה assay שונים מומחשים גם כל איור: C = המצע שליטה, B = המצע ריק, ו- R = התגובה. המצע שליטה הדגימות במאגר • תנאי, ואילו המצע ריק, התגובה הדגימות במאגר המחשוף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מאגר</td>
			<td>חלבון פלואורסצנטי</td>
			<td>CV % של מדרונות (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>• תנאי</td>
			<td rowspan="2">mTurquoise2</td>
			<td>6.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>פצילות</td>
			<td>9.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>• תנאי</td>
			<td rowspan="2">מאפל</td>
			<td>10.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>פצילות</td>
			<td>12.68</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 11: מקדם של ערכי סטיה (CV %) של המדרונות של עקומות כיול המצע. כדי לבדוק אם זריחה של סובסטרטים חלבון רקומביננטי תלויה המחשוף שנוספו לאתר, ולידציות בוצעו על ידי סדרה של סובסטרטים מאפל - ו mTurquoise2-התמזגו (שישה משתנים עבור כל אחד, המכילים המחשוף שונים באתר רצפים של פרוטאז HIV-1), שניהם במאגרי • תנאי, המחשוף. מצאנו כי CV % ערכים של המדרונות הם מתחת לגיל 15% בכל המקרים, ממנה משתמע כי כיול סובסטרט יחיד יכול להיות מנוצל עבור הערכת המידה השונות המבוצעת על ידי משתנים המצע המכילים אותו תג ניאון.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

השימוש פיוז'ן רקומביננטי חלבונים פלטפורמה Assay פרוטאז פלורסנט, Renaturation שלהם בג'ל

כאן, אנו מציגים את ההליך מפורט של פלטפורמה assay פרוטאז שפותחו לאחרונה ניצול N-מסוף hexahistidine/מלטוז-מחייב חלבון ותערובות פלורסנט התמזגו חלבון רקומביננטי המחובר למשטח של ניקל-nitrilotriacetic חומצה agarose מגנטי חרוזים. גם מוצג ניתוח בג'ל עוקבות של הדגימות assay המופרדות על-ידי נתרן גופרתי-לזיהוי dodecyl בג'ל.

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

זיהוי רגיש מאוד, כמותית של חלבונים ושל שלהם איזופורמים בשיטה התמקדות לגירויי כאב נימי

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Assay לוציפראז תפוקה גבוהה כדי להעריך את Proteolysis של PCSK9 יחיד-מחזור פרוטאז

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

כיצד ניתן לכמת את השבר של Photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

אפיון חלבונים סלולריים עם החמצון בתוך תא מהיר לפוטוכימיקלים של חלבונים

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

חממת פלטפורמה עם שלב Movable XY: פלטפורמה חדשה ליישום חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...