Name: use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00
Duration: 19 min 23 s
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この作品は GINOP-2.3.2-15-2016-00044「PHARMPROT チーミング」プロジェクトによって一部にはサポート、またが融資し、高等教育制度の卓越性プログラム人間容量省ハンガリー、の枠組みの中で、デブレツェン大学のバイオ テクノロジーのテーマ別プログラム。著者らは、研究所のレトロ ウイルス生化学アッセイ開発の間に彼らの科学的な助け、(特に、ノルベルト Kassay、Krisztina Joóné Matúz、バンダ トルディ アッセイを撮影中に彼らの忍耐のメンバーに感謝して、します。人に登場しているビデオの背景)。著者は博士トート Urbányi Beáta Bozóki の生化学および分子生物学客員研究員としての仕事をできるようにするために特に特別なのおかげでジェデオン リヒター Plc 等を言うにも思います。作者がマルチ メディアとデブレツェン大学の E ラーニング テクニカル センターからオーディオとビデオの専門家の支援をトート Király、軸 Pöstényi 軸 Tőgyi ダグラスフィッチ Zsadányi に感謝の意を拡張したいも生産。

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

蛋白分解酵素の集中的な産業および学術調査と HTS 互換プロテアーゼ分析プラットフォームを迅速かつ手頃な価格の一定の需要のためにそれに応じて、我々 は、磁気ビーズによる蛍光プロテアーゼを開発しました。試金。アッセイは、組換えの融合蛋白質を用いた広く利用合成ペプチド基質に新しい選択肢をすることができますに基づいています。
開発試験形式で融合蛋白基質は Ni キレート コーティング磁気アガロース ビーズの表面に固定しました。基板添付ファイルは彼の6親和性タグ折りたたみを容易にするし、基板13の水への溶解度を高めるために MBP タグに直接融合融合蛋白質の N 末端によって提供されます。MBP には TEV PR の胸の谷間サイトや関心のプロテアーゼが続きます。前者として役立つかもしれない、アッセイのコントロール胸の谷間サイト一方、後者は調査するプロテアーゼで処理できます。胸の谷間のサイトは交換可能です。興味のある胸の谷間サイトの短い dsDNA 系列符号化は結紮の発現プラスミドの柔軟な 'クローニング カセット' に挿入することができます。組換えの融合蛋白質には C ターミナル蛋白質分解開裂 (にリリース酵素解放、蛍光灯、胸の谷間の C ターミナルの製品のエンドポイントの検出を可能にする非常に安定した、単量体の蛍光タンパク質タグが含まれて図 1 a)。精製された蛍光そのまま基板上の異なるバッファー解決は校正用基板と開裂製品のモル濃度を評価するためにも使用されます。さらに後/蛍光定量、分析コンポーネントごとに分析できます SDS-PAGE、同様。(Nondenatured) 両方のネイティブおよび変性の蛍光タンパク質で視覚化すること、ゲル電気泳動後すぐにまたはそれ以降のゲルの下後それぞれ。この追加手順との組み合わせ、従来 Coomassie ブリリアント ブルー染色-5 月は、アッセイ結果 (図 1 b) の検証を効率的に使用します。
試金プロシージャは、高スループットの自動環境に完全に適合させることができる低ボリューム形式の単純な簡単に実行の手順から成ります。しかし、独立して手動または自動化システムと分析の実行、アッセイの次の部分と考えられる重要であるし、しながら手順特別な注意が必要があります。i)磁気ビーズ ソリューションの均質性。均一磁気ビーズ ソリューションは、分析、浄化、洗浄の手順の両方で使用する必要があります。特に、プロテアーゼの試金の信頼性に依存正しく早かった基板に接続された磁気ビーズ (SAMB) 原液。懸濁液の分散効果を高めるためには、2% から 10% (v/v) ビーズ濃度を設定することをお勧めします。サンプル調製、使用時まで (トリトン X-100 トゥイーン 20 など) 非イオン性洗剤を添加したバッファーの 2% が磁気ビーズのプラスチック表面への付着を低下も。ビーズ懸濁液はサンプル チューブの壁の代わりにバイアルの底に慎重に適用される場合、ビーズのサンプル瓶の壁への付着を避けることが。酵素反応における磁気ビーズの均一性も重要であり継続的にサンプルを 600 rpm で潜伏中に揺することによって確保することができます。ビーズは正しく円形または平底プラスチック用品と同様の分散した V 底のバイアルの使用は推奨されません。不適切なビーズの均質化による最適な結果は、図 4 bで表されます。ii) 反作用のサンプルの終了。 メソッドのもう一つの利点は、酵素反応を熱変性治療または任意の潜在的干渉の化学薬品15を使用せず終了できること。終了は、反応混合物は、従来の磁気コンセントレーターを使用してから磁気ビーズを分離するだけで実施できます。削除された反応バッファーには、活性酵素と生成された C 末端蛍光開裂製品が含まれますが、分解されていない基板はビーズに接続されたまま。活性酵素反応バッファー内の存在のために分離のプロシージャは信頼性の高いエンドポイントの検出に対して慎重に実行する必要があります。コンセントレーターにサンプル瓶を置く前に、短いスピンの遠心分離を適用することをお勧めします。コンセントレーターにチューブを配置した後、少なくとも 15 を提供収集するビーズの s。区切り記号と前後のわずかな動きは、ビーズのコレクションを促進するかもしれない。手動で行っていた分離終了通常より時間かかります、反応の開始を検討してください。したがって、同じインキュベーション時間はすべてのサンプルに適用する必要がある場合、約 2 分登録遅延は、イニシエーションの間推奨します。
記載されているタンパク質アッセイの原理は比較的簡単です。ただし、システムの汎用性は、柔軟かつ安定した基板構造によって保証されます。アッセイの個々 の最適化は、適用条件、試薬、添加剤との親和性のビーズの互換性によってのみ制限される可能性があります。製造元のプロトコルに一致して、Ni NTA ビード表面に基板の親和性結合大幅に弱める pH ≦ で 6.515分かったしています。したがって、反応試料に平行基板の空白のサンプルに適用するお勧め、自発的な基板解離のレートが結果の評価時に考慮する必要があります。
どこビーズ-互換性のないコンポーネントまたは低 pH の使用による磁気ビーズ アッセイを実行できません、これらのケースでは、精製組換え基板のソリューションで消化も適用できます。これらの場合、反応混合物を電気泳動によって分析できるし、タンパク質は、記述されているプロトコルに基づいてゲルで視覚化することができます。プロテアーゼ活性を調べるためには、ソリューションの消化と蛋白質のゲルの検出もあります/蛍光定量の代替ツール。設計された基板システムの目新しさは、SDS ページの変化後ゲルの下のステップのアプリケーションです。ネイティブ (nondenatured) 蛍光タンパク質の電気泳動の間に彼らの蛍光を保持、蛍光プロパティを変性 (図 7 b) 時に廃止します。ただし、変性タンパク質の蛍光は SDS のゲルからの除去によって部分的に回復しました。したがって、変化の条件を用いた反応成分の分離が可能だけでなく蛍光ベース、重量ベースでは分子識別。Coomassie 染色ゲルの分析と比較して蛍光ゲルの検出のもう一つの利点は、蛍光値によるゲル内 (ネイティブまたは renatured) の蛍光タンパク質を簡単に識別できます (図 7参照)。これは、胸の谷間の反応は無蛍光の汚染物質を含む試料で実行されて場合または高分子量互いに似た蛋白質重要かもしれません。
同様に設計された基板を用いたプロテアーゼの試金はすでに8,9,10は、以前公開と胸の谷間サイトこれらのケースで興味のあった親和性タグの間にも、蛍光タンパク質アッセイ システムを提示ここで記述されているアイデアを繰り返すだけでなく、以前のプラットフォームの別の利点を組み合わせた、また更にそれらを完了: i) で MBP の融合パートナーの利用 ii)TEV PR コントロール胸の谷間サイト iii の存在)、新設計の単量体 FPs と iv の使用) ユニークな基板校正手順のアプリケーション。自体アッセイは、酵素特異性と安全で高価な機器を必要とせず、時間とコスト効率の高い方法論に有用特に設計されました。メソッドは両方の産業と学術研究目的のため適切かつ手頃なツールであること目指しています。発現プラスミドの複製カセットの柔軟性のためシステムが高速かつ安価な世代の組換え基板・ ライブラリの適さない場合があります。ここに記述されたアッセイは基質特異性、酵素の突然変異誘発の実施のための実行可能なツール、抑制研究し、また、酵素反応速度論を実行する代替ツールを提供します。(から速度論的パラメーターの決定に細菌セル中断) アッセイプラット フォーム HTS およびオートメーション ベースの環境に適応することができ、潜在的に、産業プロテアーゼ阻害剤のスクリーニングおよび/または抗ウイルス薬に適用される可能性があります。開発。さらに、競争力の分解のためのアッセイの適応は、将来的に当研究室の範囲ではまたです。このような競争力のある分析では、異なる C 末端蛍光タグ-が同じの開裂反応の研究優先順位を調査するため同時に使用するために融合 2 つ異なる基板各サイトを含む異なる胸の谷間指定されたターゲット シーケンスの酵素。さらに、96 ウェル プレート適応アッセイ フォーム (図 8) の使用も最適化されている変異のスクリーニングのシステインのプロテアーゼの場合変更された胸の谷間サイト シーケンスによる基板のシリーズ。

蛋白分解酵素は、代謝経路と同様、産業用アプリケーションの重要性のため最も集中的に調査した酵素グループに属する。ウイルス性疾患で重要な役割、血液凝固、がんの規制と心血管および神経変性疾患の創薬の分野で著名なターゲット プロテアーゼになります。したがって、基質特異性の解析と興味のプロテアーゼ (PR) の阻害剤のプロファイリングは極めて重要です、迅速でコスト効率の高い、かつ堅牢な生化学的アッセイ1,2、実行できれば 3。
今日では、化合物プロファイリングの創薬の分野でも適用体外プロテアーゼの試金の大半が同質で、蛍光ペプチド ベースと高スループット スクリーニング (HTS)-互換性のあるプラットフォーム4。また、標識ペプチドのみライブラリ スクリーニングに適したが彼らはまた選択した基板上への速度論的パラメーターの酵素の定量のための素晴らしいツールを提供します。基板のラベリングが可能な他のケースで分離に基づく試金蛋白質分解反応3の動力学的特性を評価するために可能な解決策があります。
一般的には、in vitro におけるプロテアーゼの試金は基板の 2 つのタイプの使用に基づいています: 短いペプチドまたは蛋白質の全体。次の標準的な方法で短いペプチッド シーケンスの胸の谷間は十分に胸の谷間プロパティを反映、これらのケースで当てはまる: (i) 標準タンパク質基質酸化インスリン B 鎖、(ii) などテストを調べる市販の基板他のプロテアーゼ、(iii) のコンビナトリアル ・ ケミストリー、または (iv) によって作成された合成と蛍光標識ペプチド ライブラリーをスクリーニング遺伝的メソッドを使用して、例えば、生物学的表示技術5、 6。従来の分類のほかその他新規プラットフォームは、また基板生成のため (例えばの形成プロテオーム由来ペプチド ライブラリ7または遺伝的組換えの融合のような特別なサブタイプタンパク質ベース基板8,9,10、11,12)。
すべての上記基板タイプとの試金がある独自の利点と制限、およびアッセイ フォーマットを組み合わせることおよび/または知られているプラットフォームの利点の改善の開発はまだ需要。ここで、遺伝子組換えの基板を利用して分離に基づく蛍光プロテアーゼの試金のためのプロトコルについて述べる.これらの融合蛋白質は、彼の6と C 末端蛍光タンパク質 (FP) (図 1 a) に直接接続されている興味の基板シーケンスが続いている TEV PR のコントロール胸の谷間サイトへ融合 MBP タグで構成されます。クローン カセットに興味のある胸の谷間サイトのコーディング dna のクローニングは、制限酵素による切断以前線形補間されている発現プラスミドに単一の ligation の反作用によって実行できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> 図 1:蛍光プロテアーゼ アッセイの原理。(A) 蛍光基板とそのひと免疫不全ウイルス 1 型による胸の谷間の略図 (HIV-1) プロテアーゼが表示されます。矢印は、hiv-1 プロテアーゼのマトリックス/キャプシド胸の谷間サイト シーケンス内で胸の谷間の位置を示します (VSQNY * PIVQ)。(B) 蛍光基板同様、ワークフロー ダイアグラムで示すように、Ni NTA 磁気ビーズによるアッセイし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による酵素反応を分析する使用できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
基板を含む関係タグ、蛋白質分解開裂サイト、および蛍光タンパク質-持っている既に同様の組換えタンパク質を用いたタンパク質アッセイされて説明が8,9,10, システム提示ここで統合し、これらの方法の利点を改善しようとします。重要な違いは、このアッセイのプラットフォームに融合蛋白基質がタンパク質溶解度13を強化し、TEV PRs の胸の谷間にある、コントロールのサイトを含む MBP 備わっているです。さらに、基板には、基板の凝集を予防する単量体のフォームを持っている、非常に安定した新世代蛍光タンパク質が含まれています。MTurquoise2 とマップル融合フォーム14の以前に発行されたアプリケーション、ほかも紹介、単量体を含む組換え基板の使用により得られる強化黄色蛍光タンパク質 (mEYFP) 蛍光タグ。ここ我々 は他の蛍光タンパク質を用いたシステムの互換性を示す、プロテアーゼ法によって得ることができる結果のいくつかの一般的な種類を表します。
組換えの融合蛋白質エシェリヒア属大腸菌BL21(DE3) セルで表されます、ニッケル ニトリロ三酢酸 (Ni 国税庁) の試金のため基板として使用されます-磁気-アガロース-ビーズ-添付フォームをコーティングします。C ターミナル開裂製品は、関心のプロテアーゼによる培養上清を胸の谷間にビード表面から解放され。磁気ビーズから上清 (酵素と開裂製品含む) の分離、酵素の胸の谷間のプロパティを決定する蛍光を測定できます。上記の方法とは対照的、ここで提示システム基板と C 末端開裂製品の量が一意に定量化詳細基板の校正手順に基づきます。検体; の SDS-PAGE 解析によるアッセイ システムをサポートできます。電気泳動後すぐにまたはそれぞれ14nondenatured と変性蛍光成分のゲルの下後その後蛍光ゲルの可視化を適用できます。
柔軟性とクローニング カセットの構造時間とコスト効率の高いさまざまなシーケンスを構造体に挿入を許可して、したがって、基板ライブラリの生成を促進します。以来、すべての試金のステップがオートメーションと互換高温超伝導、システムすることができます、特に魅力的な例えば、プロテアーゼ特異性測定や突然変異誘発の研究が効果的に活用も産業プロテアーゼ阻害剤スクリーニングや、抗ウイルス薬の開発。
開発の分離に基づくアッセイ; によって酵素の速度論的パラメーター (k猫、 Km) が指定します。したがって、それは時間コース ・基質依存的阻害研究などの各酵素キネティック測定を実行するが適さない場合があります。これは組換えの融合蛋白基質頻繁利用合成ペプチド基質の良い選択肢を提供するポリタンパク質基材への高い類似性による自然発生を表すを証明します。酵素-基質相互作用より正確に。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10K Amicon tubes</td>
			<td style="width:269px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC501096</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">M6250</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;">1610148</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">100063</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Agarose</td>
			<td style="width:269px;">SERVA</td>
			<td style="width:137px;">11404.04</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Alpha Imager HP gel documentation system</td>
			<td style="width:269px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A3678</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A9518</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">392185</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Black half-area plates</td>
			<td style="width:269px;">Greiner bio-One</td>
			<td style="width:137px;">675086</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">B0126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">CutSmart buffer (10x)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7204S</td>
			<td style="width:191px;">For plasmid linearization (step 1.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:269px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:137px;">DR-45M</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">M0303L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dynamag-2&#160;magnetic particle&#160;concentrator</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12321D</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Escherichia coli BL21(DE3) competent cells&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">C600003</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethanol</td>
			<td style="width:269px;">Merc-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">100983</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">798681</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7024S</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycerol</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">356350</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">G7126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">High-Speed Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:269px;">GeneAid</td>
			<td style="width:137px;">PD300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Imidazole</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">56750</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">AM9464</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Jouan CR 412 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Jouan</td>
			<td style="width:137px;">CR412</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Labinco LD-76 Rotator&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Labinco</td>
			<td style="width:137px;">7600</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L3022</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Lysozyme&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L6876</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:269px;">Scharlau</td>
			<td style="width:137px;">MA0036</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MERCK eurolab ultrasonic bath</td>
			<td style="width:269px;">MERCK</td>
			<td style="width:137px;">USR54H</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Millifuge Eppendorf spin centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">CT10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T9281</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NheI-HF restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R3131L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nickel(II) sulfate (NiSO4)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">656895</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ni-NTA magnetic agarose beads&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">36113</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">OS-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PacI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R0547L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PageBlue Protein Staining Solution&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">24620</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P7626</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Protein Lobind Micro-centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">22431102</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:269px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Snijders Press-to-Mix shaker&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Gemini</td>
			<td style="width:137px;">34524</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-acetate trihydrate</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S7670</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-chloride</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S9888</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S5881</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">S7563</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:269px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M180A</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Thermo shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">TS-100</td>
			<td style="width:191px;">with SC-24 accessory block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tris</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T1503</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tween 20</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P2287</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter</td>
			<td style="width:269px;">Wallac Oy, Turku, Finland</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation

プロテアーゼは生きている有機体のいくつかの生物学的経路と病態の本質的な役割により集中的に調査の酵素したがって、彼らは重要な創薬ターゲットであります。組換えの融合蛋白質の基質の使用に基づいているプロテアーゼ活性の調査のための磁気アガロース ビーズ-ベースのアッセイ プラットフォームを開発しました。このアッセイ システムの使用を示すために、プロトコルでは、1 (hiv-1) プロテアーゼをひと免疫不全ウイルスの種類の例に提示されます。プロテアーゼ、変異、キネティック、阻害、または特異性の研究、酵素活性測定などの生化学的解析の導入アッセイプラット フォームを効率的に利用できる、高スループットに適してことがあります。基板スクリーニングまたは他のタンパク質分解酵素に適応することがあります。
このアッセイ システムで応用基板は N 末端 hexahistidine (彼の6) マルトース結合タンパク質 (MBP) タグが含まれている、タバコの胸の谷間サイト エッチ (TEV) ウイルスおよび HIV 1 プロテアーゼと C 末端蛍光タンパク質。基板は、大腸菌細胞に効率的に生産できるし、ニッケル (Ni) - キレート - コーティングを施したビーズを使用して簡単に浄化します。アッセイ中ビーズ付属基板の蛋白質分解開裂は二測定できる蛍光胸の谷間フラグメントのリリースに します。さらに、胸の谷間の反応はナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって分析できます。蛍光タンパク質の部分画により分子量と蛍光の検出も、分析コンポーネントのゲルの下のプロトコルは記述されています。

図 1 aは、サイトにあるその特定の胸の谷間のシーケンスで HIV 1 PR によって処理することができます代表蛍光遺伝子組換え蛋白質の基質の構造を示しています。図 1 bは、基板生産とプロテアーゼの試金、Ni NTA 磁気ビーズによるアッセイやページなどでその応用を表します。
二信頼性の高いデータを取得するには、校正手順が蛍光基板と開裂製品の量を決定するために、必要です。このため、別のバッファー条件の異なる基板上の蛍光強度の値を測定する必要し、測定濃度範囲 (図 3) 濃度と相関することが必要があります。基板と、検体の開裂製品の量を決定する較正曲線の勾配値を適用できます。検量線の斜面は基板 (表 11) に挿入される胸の谷間サイト系列の独立して同じ種類の蛍光タンパク質を融合した基板のシリーズされる可能性がありますすることができます。ズームでグラフ同様低い濃度範囲を拡大するため、すべての線形回帰 (図 3) のとおりです。キャリブレーションがデータ ポイントの適切な分布が信頼性の高い校正に必要なために、慎重に実行する必要があることに注意してくださいすることが重要です。R2値は蛍光タンパク質の濃度と蛍光データ ポイント数が足りない場合にのみ良い相関を示すために二重シリアル希釈を校正サンプルを準備する適用この理由全体の濃度範囲をカバーするのに使用されています。さらに、実験誤差校正; の確度に影響する高したがって、回帰直線のグラフィカルな評価は必要もあります。
反応速度 (図 4 a) に基質濃度の効果の検討を含むプロテアーゼ法によって様々 な酵素の計測を実行できます。非線形回帰によって酵素の速度論的パラメータ ( vmaxとKmなど) を決定するデータを使用できます。不足ビーズ懸濁、分散と不適切な反応終了は、最適ではない結果は、信頼性の高い酵素の速度論的値を計算するのには適していません (図 4 b) を引き起こす可能性があります。
(例えば中胸の谷間反応パラメーターの最適化) (図 5 a) の定量による時間プロダクト形成の依存性を決定できます。酵素阻害剤の存在下ですることができます活性酵素濃度と阻害定数の測定 (図 5 b) を検討しました。同じ方法論を使用して、他の阻害剤の効果は、アッセイによって上映されることができます。
プロテアーゼのアッセイは、酵素活性に及ぼす pH の調査に便利です。図 6 aは、全体最適の pH 範囲 (pH 6-9) のある TEV PR の例による pH 依存性酵素活性を表します。酵素活性の pH 依存性の検討 (または酸性 pH 最適を持つ酵素を測定する必要)、ビーズに組換え基板の親和性結合がわずかに酸性 pH で制限されていることを考慮する必要は。ビーズ (図 6 b) から基板の高解離試験結果の歪みが生じる。ビーズから自発的な基板解離を考慮するために反作用のサンプルの測定値は、B サンプルのものに修正する必要があります。
図 7は、青い光透視 (図 7 a) を使用して、色に基づいてゲルの nondenatured 蛍光蛋白質を区別できることを示します。基板/胸の谷間の断片の分子量の測定が必要な場合、条件の変化も使えるサンプル準備のため蛍光蛋白質部分的にゲルで renatured をすることができ、UV 照射によって検出することができますので(図 7 b)、Coomassie の染色 (図 7)。R サンプルを分析した場合 C ターミナル胸の谷間の製品のみが表示されます (図 7)、N 端末胸の谷間断片と分解されていない基板ビーズに接続されたまま。時折、蛋白質は、nondenaturing 条件 (図 7) を使っていても部分的に変性する可能性があります、nondenatured 蛋白質が多い中、変性フォームもサンプルで検出可能です。この現象は蛋白質分解開裂の検出には影響しませんが、nondenatured サンプルの定量的密度測定の場合考慮する必要があります。
詳細な説明は、2 mL チューブ ベースの試金のためにだけ示されていますが、アッセイが 96 ウェル プレート ベース システム (図 8)、(表示されていません) 当研究室で正常にテストされて既にために適応させることができます。96 ウェル プレートに適合した形式は蛍光光度法による電気泳動分析、同様と完全に互換性のある、このペーパーで説明する方法に基づいて、得られたデータを評価できます。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> 図 3:検量線。代表的な基板較正曲線が別の C 末端蛍光タグに融合組換え基板上の 2 つの例で示されて: (AとB) 彼の6- MBP-VSQNY * PIVQ mTurquoise2、Cおよび D ) 彼の6- MBP-VSQNY * PIVQ mEYFP。0 0.005 のデータ ポイントの線形回帰を表すためにズームで台数を表示また mM 基板濃度範囲。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> 図 4: 酵素の速度論的パラメーターの測定。基板依存性運動測定を行った HIV 1 PR (41.2 の最終的なアクティブな濃度で nM)。初速値は基質の濃度に対してプロットした、ミカエリス-メンテン型非線形回帰分析を行った。誤差範囲を表す SD (n = 2)。彼の6- MBP-VSQNY の例 A (A) 代表的な最適な結果が表示されます * PIVQ マップル融合タンパク質基質。(B) A 代表的な最適ではない結果をまた示します彼6- MBP KARVL * AEAM mTurquoise2 基板、適切な基質濃度の設定は SAMB 原液の不十分な均質化による問題、一方、比較的高いエラーが不適切な反応終了によって引き起こされました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> 図 5: 経時的抑制研究。(A)彼6- MBP VSQNY * PIVQ mEYFP (0.00326 mM の最終的な集中) で組換えの融合蛋白質の基板が HIV 1 PR による開裂 (41.2 の最終的なアクティブな濃度で nM)、蛍光 PIVQ mEYFP の消化フラグメントのリリースを測定したと経時的解析を実行します。測定値は、5 つの異なる時点で行われました。誤差範囲を表す SD (n = 2)。(B) 彼の6- MBP-VSQNY * PIVQ mEYFP は、アンプレナビルの HIV-1 広報の活動抑制効果を決定する (0.0015 mM) の基板として使用された (163.8 の濃度で nM)。半最大阻害濃度 (IC50)、データを評価できるプロットと活性酵素濃度 (41.2 の最終的なアクティブ濃度 nM) 応用の HIV-1 広報の可能性がまたに基づいて算出されます阻害曲線。誤差範囲を表す SD (n = 3)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> 図 6: 依存性酵素活性と博士に自発的な基板解離を勉強(A)、彼の6- MBP-VSQNY * TEV PR の酵素活性を測定する使用された (で 0.033 mM) PIVQ mTurquoise2 基板 (91.42 の最終濃度で nM) 6.5 8.5 の範囲間の異なる pH に設定されて胸の谷間バッファー内。誤差範囲を表す SD (n = 2)。プロットされたデータがされている14は、以前公開します。(B) 彼の自発性の解離基板ブランク試料の相対蛍光強度値に基づいて6- MBP VSQNY * PIVQ mTurquoise2 基板 (0.033 mM) 磁気ビーズを胸の谷間のバッファーを使用して検討しました。異なる ph は、6.0 8.5 間。プロットされたデータがされている14は、以前公開します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> 図 7:ゲルの別の方法で蛋白質を検出します。(A) 分解されていないと nondenaturing のサンプル準備の後 HIV 1 PR 消化融合蛋白基質は SDS ページの後青い光透視によって想像されたもの。ソリューションの消化によって開裂反応を行った。(B) ページの直後にのみ nondenatured タンパク質検出できるゲルで SDS の除去後、紫外線の照射によって以前変性蛍光タンパク質の一部となった renatured と検知します。Ni NTA 磁気ビーズによるアッセイの培養上清から調製。(C) クマシー染色も、ゲルの下後のタンパク質検出用使用することができます。ゲル、SDS 現在ネイティブ蛋白質の部分的な変性がネイティブのサンプルで nondenatured フォームが多い。Ni NTA 磁気ビーズによるアッセイの培養上清から調製。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> 図 8:アッセイプラット フォームの 96 ウェル プレート ベース適応します。2 mL 管は 96 ウェル プレートの井戸だけでなく、試金 (A) を実行できます。野生型 (wt) または変異 (mut-1 mut 4) を含んだ蛍光基板の一連を使用して架空のプロテアーゼの特異性を研究するアッセイのアプリケーションの概略を示す胸の谷間サイト シーケンス。磁気ビーズを処理、96 ウェル対応磁気コンセントレーター (MPC) は、実験で使用されます。示されているすべてのボリュームは、単一の井戸に関連しています。異なる基板の開裂の効率を比較するため基質変換基板空白修正 RFU 値関連の RFU の基板ブランク補正値を考慮した反作用のサンプルの割合から評価できます。基板 100 としてコントロールのサンプル。 (B)/蛍光定量、サンプルはページ、および蛍光タンパク質成分によっても分析できるアッセイの分離培養上清は、直接または nondenaturing と変化させるサンプルの場合ゲルの下後分析することができます後準備、それぞれ。3 つの異なる測定サンプル タイプは各図にも示されている: C B 基板の制御を = = 空白、基板と R = 反応。基板制御サンプルは空白の基板中の溶出バッファーで、反作用のサンプルは胸の谷間のバッファー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>バッファー</td>
			<td>蛍光タンパク質</td>
			<td>勾配 (%) の CV %</td>
		</tr>
<tr>
<td>溶出</td>
			<td rowspan="2">mTurquoise2</td>
			<td>6.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>胸の谷間</td>
			<td>9.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>溶出</td>
			<td rowspan="2">マップル</td>
			<td>10.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>胸の谷間</td>
			<td>12.68</td>
		</tr>
</tbody></table>表 11: 基板較正曲線の斜面の差異 (CV % 値) 値の係数。組換え蛋白質の基質の蛍光が挿入された胸の谷間サイトに依存しているかどうかをテストするための校正は縮合マップルと mTurquoise2 基板 (六つのバリエーションごとに、異なる胸の谷間サイトを含む一連によって行われました。hiv-1 プロテアーゼのシーケンス)、胸の谷間と溶出バッファーの両方。斜面の CV % 値が下単一基板校正同じ蛍光タグを含む基板バリエーションによって実行されるさまざまな測定値の評価のために利用できることを意味するすべての場合、15% であることがわかった。

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Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

蛍光プロテアーゼ アッセイプラット フォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

ここでは、N 末端 hexahistidine/マルトース結合蛋白質とニッケル ニトリロ三の表面に付着した蛍光タンパク質融合組換え基板を利用した最近開発されたプロテアーゼ アッセイプラット フォームの詳細な手順を提案します。酸の磁気アガロース ビーズ。ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミド ゲル電気泳動で区切られた検体の後のゲルの分析について述べる。

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

プロテアーゼは、学術研究および産業研究における生体分子支援の最も調査されたグループの1つです。いくつかの生理学的および病理学的プロセスにおける彼らの強力な役割は、彼らに同様に創薬の分野で顕著なターゲットになります。その集中的な研究に関しては、時間とコストを節約する高スループットのスクリーニング適合性蛍光プロテアーゼアッセイプラットフォームの開発に対する大きな継続的な需要があります。ここでは、mTurquoise2とmApple融合融合プロテアーゼ基質の両方を用いた分離ベースのハイスループットスクリーニング適合蛍光アッセイプラットフォームの応用プロトコルを紹介する。また、SDS-PAGEを変性した後の基質のインゲル化とアッセイサンプルの切断断片の解別方法を実演したい。すべての実験は、HIV-1ウイルスプロテアーゼの例で行われる。発現プラスミドは、ヘキサヒスタジンアフィニティータグとマルトース結合融合タンパク質のコード配列を運び、続いてタバコエッチウイルスプロテアーゼの制御切断部位、クローニングカセット、およびC末端蛍光タンパク質を運ぶ。PacIおよびNheI制限エンドヌクレアーゼによって発現プラスミドを線形化する。PacIとNheI凝集端によって目的とする基質配列とフランクをコードする前方および逆オリゴヌクレオチドプライマーを最適化したエシェリヒア・コリコドンのアニーリングを行う。結紮によって線形化発現プラスミドにアニールプライマーを挿入する。タンパク質発現の場合は、ライゲーション混合物によりBL21(DE3)コンピテント細胞を変換します。蛍光タンパク質は、結紮が成功した後にのみ、N末端融合タグと同じオープンリーディングフレームになります。変換の数日後、目的の挿入切断部位をコードする発現プラスミドを含むコロニーは、ダークリーダーブルーのトランスイルミネーターを使用する有無にかかわらず、可視蛍光を示す。50ミリリットル遠心分離管に1ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含む5ミリリットルLB培地に目的の切断部位配列をコードする発現プラスミドを運ぶBL21(DE3)細胞の10マイクロリットルのグリセロールストックを加える。絶えず揺れながら、サスペンションを37度で15時間インキュベートします。5ミリリットルの細菌培養物を、ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含む新鮮なLB培地に移す。600ナノメートルの波長で0.6〜0.8の吸光度に37度で細胞を成長させます。この時点で、IPTGを添加してタンパク質発現を誘導する。以降、連続的に振りながら37度で3時間培養する。インキュベーション後、培養物25ミリリットルを清潔50ミリリットル遠心管に移し、遠心分離により細胞を収穫する。上清を捨て、少なくとも1時間はマイナス70度で細菌細胞ペレットを保管します。正常に発現した蛍光タンパク質を含む細胞ペレットは、ダークリーダーブルーのトランスイルミエーターを使用した場合または使用しなくても蛍光を明確に示す。凍結した細胞ペレットを氷の上に置き、15分間解凍させます。ペレットに2ミリリットルのライシスバッファーを加え、細胞を一時停止します。以下、プロテアーゼ阻害剤を添加し、リゾザイム及びDNaseにより懸濁液を解放し、細胞を懸濁し、懸濁液を氷上で15分間インキュベートする。1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に1ミリリットルのサスペンションを2回移し、10秒間の超音波処理と5秒の休憩のラウンドで3分間のサスペンションを超音波処理します。チューブを室温で20分間10,000gで遠心分離します。目的の蛍光基質を含むクリアされた細菌細胞ライセートは、ダークリーダーブルーのトランイルミエーターを用いることなく、あるいは使用せずに目に見える蛍光を示す。開発されたプロテアーゼアッセイの手順は、アッセイサンプルの調製から始まります。まず、組換え基質は親和性磁性ビーズと共にインキュベートされ、かつ基板に付着した磁気ビーズは、MMBと略して形成される。Sambを数回洗浄し、最終的にSAMBストック溶液は、アッセイサンプルが作成されるアリクォートによって調製される。反応はプロテアーゼ溶液の添加により初期化される。プロテアーゼによる切断時に、タンパク質分解断片が上清に放出される。反応は、蛍光切断生成物と酵素を含む反応バッファーからの磁気ビーズの分離によって終了する。上清はマイクロタイタープレートのウェルに適用され、蛍光は蛍光法によって決定されます。校正曲線は、各アッセイバッファーで解決された精製蛍光基材を使用して生成されます。C末端蛍光切断産物の濃度およびまたアッセイサンプル中の適用された基質の濃度は、較正曲線の傾きに基づいて決定される。新しいまたはリサイクルされたニッケル-NPA磁気アガロースビーズを含むチューブを磁性粒子濃縮器に入れる。ビーズは、壁やマイクロ遠心管の蓋に付着することがあります。したがって、すべてのビーズが収集されるように、コンセントレータをあらゆる方向に逆さまにします。上清を取り除き、捨てます。ビーズに1.8ミリリットルのライシスバッファーを加え、コンセントレータから閉じたチューブを取り除きます。ビーズが完全に均一になるまでチューブを振ったり、逆さまにしたりして、チューブ内のビーズを吊り下げます。チューブをコンセントレータに戻し、あらゆる方向に逆さまにして、すべてのビーズが収集されるようにします。チューブを開き、上清を捨てます。目的の基質を含む除去細菌滅菌ライセートを追加し、濃縮器から閉じたチューブを除去します。ビーズが完全に均質になるまでチューブを上下に逆さまにし、ローテーターでゆっくりと30分間チューブを回転させます。SMBは、ダークリーダーブルーのトランスイルミエーターを使用する場合でも、あるいは使用せずに目に見える蛍光を示します。SMBを1.8ミリリットル1%Tween 20、洗浄バッファー、および切断バッファーで3回洗浄します。洗浄されたSambsに切断バッファーを追加して、SAMB ストック溶液を作成します。2ミリリットルタンパク質低結合マイクロ遠心分離チューブを使用する場合、適用される切断バッファーの体積は最大 1.9 ミリリットルです。バッファーを追加した後、チューブを逆さまに振ったり、逆さまにしないでください。チューブを閉じてコンセントレータから取り外します。アッセイサンプル用に2ミリリットルのタンパク質低結合マイクロ遠心分離チューブを用意します。SAMBストック溶液が完全に均一になるまで一時停止し、SAMBストック溶液をサンプルバイアルに直ちに移すことで反応で分析する基質の量を測定します。転送されるSAMBストック溶液の体積は25~300マイクロリットルにすることが推奨されますが、個々の実験計画に従って設定する必要があります。サリクォートされた SAMB 懸濁液を含むサンプルチューブをコンセントレータに入れる。慎重にSMBから上澄を削除し、それを破棄します。コンセントレータからチューブを取り外し、慎重に反応バッファーをMMBに追加します。添加した反応バッファーの体積は、個々の実験計画に従って計算されるが、2ミリリットルチューブを使用する場合は50~150マイクロリットルの反応混合物の最終体積を設定することが推奨される。チューブの蓋を閉じます。これで、サンプルは初期化の準備が整いました。酵素溶液を反応サンプルに加えます。チューブを軽く動かしてビーズを慎重にかき混ぜ、すでに揺れているサーモシェーカーにチューブをすぐに入れます。基板ブランクサンプルおよび基質制御サンプルの場合は、それぞれ切断緩衝液および溶出バッファーを添加する。インキュベーション終了の30秒前に、サーモシェーカーからサンプルを取り出し、速やかに回転させます。チューブをコンセントレータに置き、チューブを15秒間放置します。DCB のコレクションは、コンセントレータをわずかに前後に移動することによって容易にできます。蓋を開け、上清をプレートまたは新しいチューブに慎重に移します。ピペットの先端で濃縮ビーズに触れないでください。集めた基板制御サンプル及び高い切断を有する反応試料の集められた上清は、ダークリーダーブルーのトランイルミネーターを用いることなく、あるいは使用せずに、目に見える蛍光を示し得る。分離したサンプル上清の30マイクロリットルを黒い半面積マイクロプレートに2回移す。適用された蛍光タンパク質に従って適切なフィルターを使用して蛍光計で蛍光を測定する。蛍光基材の精製のために、前述と同様の溶液を調製し、上清を廃棄する。400~600マイクロリットル溶出バッファーをSambsに加え、室温でゆっくりと回転させてチューブを5分間回転させます。溶出物を新しいタンパク質低結合マイクロ遠心分離チューブに移します。ダークリーダーブルーのトランスイルミエーターを使用する有無にかかわらず、はっきりと目に見える蛍光を示す。精製後、バッファー交換、およびタンパク質含有量の測定は、溶出バッファーと切断バッファーを解決した基質溶液の両方から、希釈用の溶出または切断バッファーを使用して、少なくとも 8 段階で 2 倍の連続希釈を調製する。各希釈点の30マイクロリットルを黒い半面積マイクロプレートに移します。測定サンプル上清の測定に適用したのと同じ設定を使用して、蛍光計で蛍光を測定します。データ処理の例として、HIV-1プロテアーゼの基質依存性運動学的測定を、天然のギャップタンパク質前駆体におけるマトリックスとキャプシドタンパク質との間の切断部位をコードする組換え基質のmTurquoise2融合型で行った。精製された基質のモル濃度に対して補正された相対蛍光強度値をプロットし、切断または溶出バッファーのいずれかを解決し、線形回帰を実行します。切断バッファーベースの較正曲線の傾きを使用して、反応サンプル中の C 末端切断生成物のモル濃度を計算します。また、溶出バッファーベースの較正曲線の傾きを用いて、基質制御試料中の溶出基質のモル濃度に基づいて反応サンプル中の適用基板濃度を算出する。初期速度値は、C末端切断断片の量から計算し、次いで適用された基質濃度に対してプロットした。また、運動パラメータはミカエル-メンテン非線形回帰分析によって決定された。ニッケルNTA磁気ビーズベースのアッセイを行った後、アッセイ上清はポリアクリルアミドゲル電気泳動法によっても分析することができます。しかし、アッセイサンプルの分析の他に、精製された蛍光基質および/または溶液中消化後の切断断片を分析することも可能である。溶液中消化のために、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに切断バッファーに溶解して消化される精製された蛍光基体をアリクォートし、サンプルに酵素溶液を加える。実験計画に従ってサンプルをインキュベートし、PAGE用のサンプル調製の手順によって反応を終了する。非変性サンプル調製の場合、分析するサンプルを還元剤を含みない非否定サンプルローディングバッファーと混合します。変性サンプル調製の場合、分析するサンプルを変性サンプルローディングバッファと混合し、サンプルを95度で10分間熱処理に曝します。非変性および変性したサンプルをSDSポリアクリルアミドゲルのウェルに塗布し、電気泳動を行います。ランニングモジュールからゲルカセットを取り出します。非変性サンプルは、肉眼でもダークリーダーブルーのトランジミネータでもゲル内にすでに見えます。トランスイルミネータ上の変性サンプルの蛍光成分を検出するために、SDSをゲルから洗い出してインゲル化を行う。ゲルに100ミリリットルの蒸留水を加え、少なくとも30分間すすいでください。未染色ゲルをダークリーダーブルーのトランジミエータに配置して、蛍光タンパク質を可視化します。組換え蛍光融合タンパク質を、タンパク質分解アッセイの基質として用いるように設計した。特定の切断部位でプロテアーゼによる切断時に、C末端蛍光切断断片が放出され、その蛍光が検出される。ニッケルNTA磁気ビーズベースのアッセイでの使用とPAGE分析による蛍光検出は、HIV-1プロテアーゼを用いて最適化されています。しかし、開発されたアッセイプラットフォームは、他のプロテアーゼにも適しています。切断または溶出バッファーで解かれた精製基質の較正曲線は、天然HIV無響性タンパク質のマトリックスとキャプシドタンパク質との間の切断側をコードする組換え基質の mTurquoise2-mEYFP 融合形態の両方の例に示されている。ニッケルNTA磁気ビーズベースアッセイは、反応速度に対する基質濃度の影響を調べる有用なツールであり、VmaxやKmなどの酵素運動パラメータの決定も可能です。図Aは、mApple融合基板上で基板依存性の活性を解析した後に得られた最適な結果を示す。これに対し、図Bは、SAMBストック溶液の均質化が不十分な場合に適切な基質濃度の設定に問題が生じ、反応サンプルの不適切な終了が比較的高い誤差をもたらす最適な結果を提示する。アッセイはまた、同様に時間コースおよび阻害研究を行うための適切なツールを提供します。図AはmEYFP融合基質上でのHIV-1プロテアーゼのタンパク質分解性切断の時間依存性を示し、図Bは切断反応に対するアンプレナビルの阻害効果を表す。阻害試験により得られたデータから、活性酵素濃度と阻害定数の両方を決定することができる。アッセイはまた、タバコエッチウイルスプロテアーゼの例に図Aで表されるように、pHに対する酵素活性の依存性を研究するために最適化することができる。図Bは、pHによるアッセイの制限を示し、中性またはわずかにアルカリ性pHが測定と完全に適合していることを示し、酸性pHは磁気ビーズの表面からの基質の自発的な解離を促進する。本図は、精製されたインタクト蛍光基質、蛍光C末端切断断片を、HIV-1プロテアーゼによる溶液内消化によって生成したものである。蛍光成分は、試料調製中に非変性条件を適用した場合、電気泳動直後に青色光トランスイルミネーションによりSDS含有ポリアクリルアミドゲルで検出することができる。異なる蛍光タンパク質は、その色に基づいて分化することができます。磁気ビーズベースのアッセイの後、試料上清中の非変性蛍光タンパク質をUV照明によってゲル内でも検出することができます。対照的に、サンプル調製中に変性条件が適用される場合、変性タンパク質はSDS PAGEの直後にゲル内で検出することはできません。しかし、変性蛍光タンパク質は、ゲルからSDSを除去することによって部分的に再自然化され、検出可能になる。したがって、SDS PAGEは、インゲルリナーテーション手順が続きます。蛍光タンパク質のレナージション能力は、蛍光だけでなく、その分子量に基づいて同定可能になります。ここでは、最近開発された磁気ビーズベースの蛍光プロテアーゼアッセイプラットフォームの使用プロトコルを実証しました。我々は、HIV-1プロテアーゼに関する酵素動態研究の例にこのシステムの使用を実証した。プロテアーゼの切断部位配列を含む組換えアッセイ基質のmTurquoiseとmApple融合形態を用いた。蛍光分析以外にも、アッセイサンプルはSDS PAGEによっても分析された。変性蛍光タンパク質は、基質とタンパク質分解フラグメントの蛍光および分子量の両方を同定するSDS PAGE後のゲル中で部分的に再自然化できることを実証しました。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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