Name: use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00
Duration: 19 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Эта работа была частично поддерживается GINOP-2.3.2-15-2016-00044 «PHARMPROT объединение» проекта и, Кроме того, финансируется институционального опыта программы высшего образования Министерства человеческого потенциала в Венгрии, в рамках Тематическая программа биотехнологии Университета Дебрецена. Авторы благодарны за членов лаборатории биохимии антиретровирусного лечения для их научной помощи в ходе анализа разработки, а также за их терпение во время съемок assay (особенно для Норберт Kassay, Кристина Joóné Matúz и Ванда Toldi, которые появляются на фоне видео). Авторы хотели бы также сказать отдельное спасибо Гедеон Рихтер Plc., особенно доктор Золтан Urbányi для позволяя Beáta Бозоки работы Кафедра биохимии и молекулярной биологии как гостевой исследователь. Авторы также хотели бы выразить свою признательность Дьёрдь Zsadányi, Балаж Tőgyi, Балаж Pöstényi и Золтан Кирали из мультимедиа и E-learning технический центр Университета Дебрецена за профессиональную помощь в аудио и видео производство.

<ol>
	<li>Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+Combinatorial+Assays+for+the+Determination+of+Protease+Activity+and+Inhibition.">Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition.</a> Molecular Informatics. 24 (10), 1141-1148 (2005).</li><li>Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biotechnological+aspects+of+microbial+proteases.">Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3), 597-635 (1998).</li><li>Zhang, G., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+assays.">Protease assays.</a> The Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Woelcke, J., Hassiepen, U., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+biochemical+assay+formats.">Fluorescence-based biochemical assay formats.</a> A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. , (2010).</li><li>Richardson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determination+and+use+of+optimized+protease+substrates+in+drug+discovery+and+development.">The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development.</a> Current Pharmaceutical Design. 8 (28), 2559-2581 (2002).</li><li>Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mapping+protease+specificity.">Methods for mapping protease specificity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 46-51 (2007).</li><li>Schilling, O., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-derived,+database-searchable+peptide+libraries+for+identifying+protease+cleavage+sites.">Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites.</a> Nature Biotechnology. 26 (6), 685-694 (2008).</li><li>Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+protease+activity+assay+using+heat-sensitive+Tus-GFP+fusion+protein+substrates.">Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates.</a> Analytical Biochemistry. 415 (2), 126-133 (2011).</li><li>Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP+based+assay+for+the+determination+of+hydrolytic+activity+and+substrate+specificity+of+subtilisins+under+washing+conditions.">A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions.</a> Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).</li><li>Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+for+site-specific+proteases+using+bead-attached+GFP+substrate.">In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate.</a> Biotechniques. 31 (5), 1194-1198 (2001).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+bioluminescence+resonance+energy+transfer-fluorescence+resonance+energy+transfer-based+ratiometric+protease+assays+with+fusion+proteins+of+firefly+luciferase+and+red+fluorescent+protein.">Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 239-245 (2011).</li><li>Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fusion+protein+platform+for+quantitatively+measuring+activity+of+multiple+proteases.">A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases.</a> Microbial Cell Factories. 13 (1), 44 (2014).</li><li>Fox, J. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maltose-binding+protein+as+a+solubility+enhancer.">Maltose-binding protein as a solubility enhancer.</a> Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).</li><li>Boz&#243;ki, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+fusion+protein-based,+fluorescent+protease+assay+for+high+throughput-compatible+substrate+screening.">A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening.</a> Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).</li><li>M&#243;ty&#225;n, J. A., Miczi, M., Boz&#243;ki, B., T&#246;zs&#233;r, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+supporting+Ni-NTA+magnetic+bead-based+fluorescent+protease+assay+using+recombinant+fusion+protein+substrates.">Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates.</a> Data in Brief. 18, 203-208 (2018).</li><li>Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+characterization+of+maturation+time+of+fluorescent+proteins+in+living+cells.">Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells.</a> Nature Methods. 15, 47-51 (2018).</li><li>Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+variation+of+fluorescence+protein+maturation+times+in+closely+related+Escherichia+coli+strains.">High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains.</a> PLoS One. 8, e75991 (2013).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Из-за интенсивных промышленных и научных исследований протеолитических ферментов и постоянный спрос на оперативное и доступное HTS-совместимых протеазы пробирного платформ соответственно, мы разработали магнитный шарик на основе-флуоресцентные протеазы анализа. Проба основана на использовании рекомбинантных синтез белков, которые могут быть новые альтернативы широко используются синтетические пептидные субстратов.
В развитых пробирного формате синтеза белка субстратов иммобилизованных на поверхности Ni хелат покрытием агарозы магнитные бусы. Субстрат вложений обеспечивается N-терминальный его6 близости тег синтез белка, который непосредственно сливается с MBP тег для облегчения складывания и повышение растворимости в воде субстрат13. MBP следуют расщепления сайты ТэВ PR и протеазы интерес. Бывший может служить расщепления сайта управления в assay, в то время как последний может быть обработан протеазы должны расследоваться. На сайте расщепления взаимозаменяемы; короткий dsDNA последовательности кодирования для расщепления сайта интересов могут вставляться в гибких клонирования кассеты плазмидной выражение на перевязки. Рекомбинантных синтез протеины содержат тег высокостабильных, мономерных флуоресцентный белок на C-терминала, который позволяет конечной точки обнаружения фермента освобождены, флуоресцентный продукты расщепления C-терминала, освобожден после протеолитического расщепления ( Рисунок 1A). Очищенный флуоресцентные нетронутыми субстратов, решена в различные буферы используются также для калибровки для оценки молярной концентрации субстратов и продукты расщепления. Кроме того после флуориметрия, пробирного компоненты могут быть проанализированы на SDS-PAGE, а также. Как родной (nondenatured) и денатурированные флуоресцентные белки могут быть визуализированы в геле, сразу же после электрофореза или последующих-гель ренатурация, соответственно. Это дополнительные процедуры в сочетании с обычных Кумасси синим окрашивание май быть эффективно использовать для проверки результатов анализа (рис. 1B).
Пробирного процедура состоит из простых, легко выполнить шаги в формате низким объемом, который может быть полностью адаптирована к среде автоматической высокой пропускной способности. Однако независимо от выполнения анализа, либо вручную, либо с системой автоматизации, считаются следующие части assay решающее значение и требуют особого внимания при выполнении процедуры. i) однородность раствора магнитный шарик. Раствором однородной магнитный шарик должен использоваться на протяжении всего assay, очистки и промывки шаги. Особенно надежность протеазы анализов сильно зависит от правильно aliquoting субстрат придает магнитный шарик (Самба) акций решения. В целях повышения эффективности подвески и дисперсия, рекомендуется задать бусина концентрации от 2% до 10% (v/v). Во время подготовки проб, использование буферов, дополненные неионогенных моющего средства (например, «Тритон» X-100 или анимации 20) до 2% может также уменьшить соблюдение магнитные бусы из пластиковых поверхностей. Приверженность бисера стены образца флаконов можно избежать, если шарик суспензий тщательно применяются к днища флаконов вместо на стенах пробоотборные трубки. Однородность магнитные бусы при ферментативной реакции также имеет решающее значение и может быть обеспечена, постоянно встряхивая образцы на 600 об/мин во время инкубации. Бусины должным образом разметаны в округлые или плоскодонной пластиковые изделия, в то время как не рекомендуется использовать флаконы V-снизу. Неоптимальный результат, вызванные неправильным шарик гомогенизации представлена в рисунке 4В. II) прекращение реакции образцов.  Еще одним преимуществом метода является, что ферментативной реакции может быть прекращено без использования тепловой денатурации лечения или любой потенциально мешая химических агентов15. Окончания может осуществляться просто разделив магнитные бусы из реакционной смеси, используя концентратор обычных магнитных частиц. В то время как удаленные реакции буфер содержит активный фермент и сгенерированный флуоресцентные расщепления продуктов C-терминала, uncleaved субстратов остаются присоединенными к бисер. Благодаря наличию активного фермента в буфере реакции разделение процедуры необходимо выполнить тщательно для надежной конечной точки обнаружения. Перед укладкой образца флаконов в концентратор, рекомендуется применять короткий спин центрифугирования. После размещения труб в концентратор, обеспечивают по крайней мере 15 s для бусины должны быть собраны. Незначительное движение разделителя туда и обратно может облегчить коллекции из бисера. Учтите, что во время вручную осуществляется разделение, прекращение обычно занимает больше времени, чем начало реакций. Таким образом примерно 2 мин зарегистрирована задержка рекомендуется между посвящений если то же самое время инкубации необходимо применить для всех образцов.
Принцип описанных протеолитических assay является относительно простой; Тем не менее универсальность системы гарантируется структуре гибких и стабильного субстрата. Индивидуальной оптимизации assay может быть ограничена только совместимость шарики сходства с прикладной условий, реагенты и добавки. По согласованию с производителем протокол мы также обнаружили, что сродство привязки субстратов на поверхности шарик Ni-НТА существенно ослабляет при рН ≤ 6,515. Таким образом рекомендуется применять субстрата пустой образцов параллельно образцы реакции, и темпы спонтанного субстрата диссоциации необходимо учитывать при оценке результатов.
В тех случаях, где магнитные шарик-на основе анализов не может быть выполнена из-за использования шарик несовместимых компонентов или низкий рН, пищеварение в раствор очищенной рекомбинантных субстратов могут применяться также. В этих случаях реакция смеси могут быть проанализированы электрофорезом, и белки могут быть визуализированы в геле, основанный на протоколе описаны. Исследовать протеолитической активности, в решение пищеварение и обнаружения в гель белков могут быть также альтернативные инструменты флуориметрия. Новинка разработана субстрата системы является применение в гель выемка шаг после денатурации SDS-PAGE. В то время как родной (nondenatured) флуоресцентных белков сохраняют свои флуоресценции во время электрофореза, флуоресцентные свойства отменяется при денатурации (рис. 7B). Однако флуоресценции денатурированные белки могут быть частично восстановлены путем удаления из геля SDS. Таким образом разделение реакции компонентов с помощью денатурируя условия позволяет не только на основе флуоресценции но идентификации на основе молекулярного веса. Еще одним преимуществом флуоресцентные обнаружения в гель, по сравнению с анализа Кумасси окрашенных гель является что (родной или renatured) флуоресцентные белки могут быть легко идентифицированы в геле, основанный на их флюоресценция (см. Рисунок 7). Это может быть важно, если реакции расщепления выполняются в образцы, содержащие nonfluorescent загрязнений или белки, весьма напоминающие молекулярным весом друг от друга.
Протеазы анализов, аналогичным образом с использованием разработанных субстратов уже были ранее опубликованы8,9,10, и хотя на сайте расщепления интерес в тех случаях, также расположен между тег сходства и флуоресцентный белок, пробирного системы представлены здесь не только повторяет описанные идеи но сочетает в себе различные преимущества предыдущих платформ и также завершает их с дальнейшие улучшения: i использование MBP фьюжн партнера, ii) наличие сайта управления расщепления ТэВ PR, iii) использование новых инженерных мономерных FPs и iv) применение процедуры калибровки уникальный субстрата. Assay сам особенно была разработана чтобы быть полезным для фермента специфичность и кинетические исследования в надежном, время - и экономически эффективным образом, без необходимости в дорогостоящих приборов. Этот метод предназначен для быть подходящим и доступным инструментом для промышленных и научных исследований. Благодаря гибкости «клонирование кассеты» выражение плазмида система может быть подходящим для быстрой и недорогой поколения рекомбинатных субстрата библиотек. Здесь описаны assay является осуществимым инструментом для осуществления субстратная специфичность, фермент мутагенеза, и ингибирование исследования и, Кроме того, предоставить альтернативный инструмент для выполнения Ферментативная кинетика. Пробирного платформа (от разрушения бактериальных клеток для определения кинетических параметров) может быть адаптирована к среде на базе HTS и автоматизации и, потенциально, может применяться в скрининг ингибитор протеазы промышленных и/или противовирусного препарата развития. Кроме того адаптация assay для конкурентных протеолиза является также в будущем сфера нашей лаборатории. В такой конкурентной assay два различных субстратах каждый содержащий разные расщепления сайт сливается с другой C-терминал флуоресцентные тег являются использоваться одновременно в том же реакции расщепления расследовать предпочтение изучал фермент для заданного целевого объекта последовательности. Кроме того использование 96-луночных пластины адаптированы пробирного формы (рис. 8) также будучи оптимизирована для мутации скрининга с помощью серии субстратов с последовательностями сайта модифицированных расщепления в случае хвоща протеаз.

Протеолитических ферментов принадлежат к группам наиболее интенсивно исследованных фермента ввиду их важности в метаболических и промышленного применения, а также. Их ключевой роли в вирусных заболеваний, регулирование свертывания крови, рак и сердечно-сосудистой и нейродегенеративные заболевания делает протеаз выдающихся показателей в области лекарственных препаратов. Таким образом подробная характеристика субстратная специфичность и профилирование ингибитор протеазы (PR) интерес стержневые и предпочтительно выполняется быстрое, экономически эффективных и надежных биохимических анализов на1,2, 3.
В настоящее время, подавляющее большинство анализов в пробирке протеазы применяются в области лекарств для составных профилирования являются однородной, флуоресцентный пептид основе и высок объём скрининг (HTS)-совместимые платформы4. Кроме того помечены пептиды подходят не только для библиотеки скрининга, но они также предлагают большие инструменты для определения фермента кинетических параметров выбранной подложки. В других случаях, где маркировка субстрата не возможно, на основе разделения анализов может обеспечить возможное решение для оценки кинетических свойств протеолитических реакций3.
Как правило, в пробирке протеазы анализы основаны на использовании двух типов субстрата: короткие пептиды или всего белки. В тех случаях, где расщепления последовательности коротких пептида недостаточно отражают свойства расщепления, применяются следующие стандартные подходы: i изучение стандартных белка субстратов например окисленных инсулина B-цепи, (ii) тестирование коммерчески доступные субстратов других протеаз, (iii) скрининг синтетических и дневно обозначенные пептид библиотеки, созданные Комбинаториальная химия, или (iv) использование генетических методов, например, биологических дисплей технологии5, 6. Помимо обычных классификации, другие Роман платформы также доступны для субстрата поколения (например, формирование протеома производные пептид библиотек7 или специальные подтипы генетических методов, как рекомбинантной фьюжн на основе белковых субстратов8,9,10,,1112).
Все типы вышеупомянутых субстрата и анализов имеют свои преимущества и ограничения, и в разработке форматов пробирного объединения и/или улучшения преимущества известных платформ до сих пор пользуется спросом. Здесь мы описываем протокол для assay на основе разделения флуоресцентные протеазы, который использует рекомбинантных субстратов. Эти протеины сплавливания состоят из его6 и MBP Теги сливается на сайт управления расщепления ТэВ PR, который сопровождается субстрат последовательность интереса, который непосредственно подключен к C-терминал флуоресцентный белок (FP) (рис. 1A). Клонирование последовательности ДНК кодирования для расщепления сайта интерес в «клонирование кассеты» может осуществляться одной лигирование реакции в плазмиду выражение, который был ранее линеаризованных с эндонуклеазами ограничения.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> Рисунок 1: Принцип люминесцентные протеазы assay. Показано протеазы (A) схематическое представление флуоресцентные субстрат и его расщепления от вируса иммунодефицита человека типа 1 (HIV-1). Стрелка указывает позицию расщепления в пределах последовательности сайте расщепления матрица/капсид протеаз ВИЧ-1 (VSQNY * PIVQ). (B) люминесцентная субстратов может использоваться для анализа ферментативных реакций, Ni-НТА магнитный шарик-на основе анализа и электрофорезом геля полиакриламида, а также, как показано на схеме рабочего процесса. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Хотя протеолитических анализов с использованием аналогичных рекомбинантных белков, субстраты содержащие тег сродство, сайт протеолитического расщепления и флуоресцентный белок иметь уже были описаны8,9,10, система представленные здесь намеревается интегрировать и совершенствовать на преимущества этих методов. Важным отличием является, что синтез белка субстратов в этой платформе пробирного оснащены ПМБ для повышения растворимости белка13 и содержат расщепления сайт элемента управления для TEV PRs. Кроме того субстраты содержат новое поколение флуоресцентных белков, которые очень стабильны и обладают односегментную форму для предотвращения агрегации субстрата. Помимо ранее опубликованного приложения mTurquoise2 и mApple наплавочные формы14здесь мы также покажем результаты, учитывая с использованием рекомбинантного субстрата, содержащего мономерных Улучшено тег Флуоресцентный желтый флуоресцентный белок (mEYFP). Настоящим мы продемонстрировать совместимость системы с другими флуоресцентных белков и представляют некоторые общие типы результатов, которые могут быть приобретены в assay протеазы.
Рекомбинантных синтез белков выражаются в клетках E. coli BL21(DE3) и используются в качестве подложки для assay в никель Нитрилотриуксусная кислота (Ni-НТА)-покрытием магнитные агарозы шарик придает форму. Продукты расщепления C-терминала будут освобождены от поверхности шарик в надосадке после расщепления протеазы интерес. После разделения супернатант (содержащие энзим и продукты расщепления) от магнитной бусины флюоресценция может быть измерена для определения свойства расщепления фермента. В отличие от ранее описанных методов в системе, представленные здесь, количество субстрата и C-терминала расщепления продуктов являются однозначно количественно основанные на процедуре калибровки подробный субстрата. Система анализа могут быть поддержаны SDS-PAGE анализ образцов; последующих флуоресцентные визуализации в гель может применяться сразу же после электрофореза или выемка в гель nondenatured и денатурированные флуоресцентные компонентов, соответственно14.
Гибкость и структура «клонирование кассеты» позволяют время и экономически эффективного вставки широкий спектр последовательности в конструкцию и, таким образом, способствует генерации субстрата библиотек. Поскольку все шаги пробирного автоматизации - и HTS-совместимые, система может быть особенно привлекательным для, например, протеазы специфика измерения и исследования мутагенеза или это могут быть эффективно использованы для скрининга ингибитор протеазы промышленных и/или разработки противовирусных препаратов, а также.
Кинетические параметры фермента (кошкаk, Km) может определяться развитых на основе разделения assay; Таким образом это может быть подходящим для выполнения отдельных фермента Кинетические измерения, таких как время курс, субстрат зависимых и ингибирование исследования. Это доказывает, что рекомбинантных фьюжн белковых субстратов обеспечивают хорошие альтернативы для часто используемых синтетических пальмитоила субстраты, и из-за их высокой сходство с polyprotein субстратов, они представляют собой естественные фермент субстрат взаимодействия более точно.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10K Amicon tubes</td>
			<td style="width:269px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC501096</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">M6250</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;">1610148</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">100063</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Agarose</td>
			<td style="width:269px;">SERVA</td>
			<td style="width:137px;">11404.04</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Alpha Imager HP gel documentation system</td>
			<td style="width:269px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A3678</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A9518</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">392185</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Black half-area plates</td>
			<td style="width:269px;">Greiner bio-One</td>
			<td style="width:137px;">675086</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">B0126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">CutSmart buffer (10x)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7204S</td>
			<td style="width:191px;">For plasmid linearization (step 1.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:269px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:137px;">DR-45M</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">M0303L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dynamag-2&#160;magnetic particle&#160;concentrator</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12321D</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Escherichia coli BL21(DE3) competent cells&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">C600003</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethanol</td>
			<td style="width:269px;">Merc-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">100983</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">798681</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7024S</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycerol</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">356350</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">G7126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">High-Speed Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:269px;">GeneAid</td>
			<td style="width:137px;">PD300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Imidazole</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">56750</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">AM9464</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Jouan CR 412 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Jouan</td>
			<td style="width:137px;">CR412</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Labinco LD-76 Rotator&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Labinco</td>
			<td style="width:137px;">7600</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L3022</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Lysozyme&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L6876</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:269px;">Scharlau</td>
			<td style="width:137px;">MA0036</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MERCK eurolab ultrasonic bath</td>
			<td style="width:269px;">MERCK</td>
			<td style="width:137px;">USR54H</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Millifuge Eppendorf spin centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">CT10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T9281</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NheI-HF restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R3131L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nickel(II) sulfate (NiSO4)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">656895</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ni-NTA magnetic agarose beads&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">36113</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">OS-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PacI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R0547L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PageBlue Protein Staining Solution&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">24620</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P7626</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Protein Lobind Micro-centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">22431102</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:269px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Snijders Press-to-Mix shaker&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Gemini</td>
			<td style="width:137px;">34524</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-acetate trihydrate</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S7670</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-chloride</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S9888</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S5881</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">S7563</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:269px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M180A</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Thermo shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">TS-100</td>
			<td style="width:191px;">with SC-24 accessory block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tris</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T1503</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tween 20</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P2287</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter</td>
			<td style="width:269px;">Wallac Oy, Turku, Finland</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation

Протеаз являются интенсивно изучали ферментов из-за их важную роль в нескольких биологические пути живых организмов и в патогенезе; Таким образом они являются важным лекарственных препаратов. Мы разработали платформу магнитные агарозы шарик-на основе анализа для расследования протеолитической активности, которая основана на использовании рекомбинантных синтеза белка субстратов. Чтобы продемонстрировать использование этой системы анализа, протокол представлен на примере тип вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-1)-протеазы. Введено Пробирная платформы могут быть использованы эффективно в биохимической характеристике протеаз, включая измерений активности фермента в мутагенеза, кинетические, ингибирование или специфика исследования, и это может быть подходящим для высокой пропускной способности Субстрат скрининга или могут быть адаптированы для других протеолитических ферментов.
В этой системе пробирного прикладной субстраты содержат N-терминала hexahistidine (его6) и мальтоза связывания белков (MBP) Теги, расщепление сайтов для табака etch вирус (TEV) и протеаз ВИЧ-1 и C-терминал флуоресцентный белок. Субстрата может производиться эффективно в клетках Escherichia coli и легко очищается с помощью никеля (Ni) - хелатной - покрытая бисером. В ходе анализа протеолитического расщепления шарик придает субстратов приводит к освобождению флуоресцентные расщепления фрагментов, которые могут быть измерены флуориметрия. Кроме того могут быть проанализированы реакции расщепления натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE). Протокол для в гель выемка пробирного компонентов также описано, как частичная выемка флуоресцентных белков позволяет их обнаружения на основе молекулярного веса и флуоресценции.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Использование рекомбинантных Fusion белков в платформу Assay флуоресцентные протеазы и их выемка в гель

Здесь мы представляем детальную процедуру использования N-терминальный hexahistidine/мальтоза связывающий белок и флуоресцентный белок кварцевое рекомбинантных субстратов, придает поверхности никель Нитрилотриуксусная платформы пробирного недавно разработанных протеазы бисер кислоты магнитные агарозы. Последующие-гель анализ образцов отделены электрофорезом геля натрия Додециловый сульфат полиакриламидных также представлен.

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Весьма деликатного и количественного обнаружения белков и их изоформы методом капиллярной изоэлектрической упором

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Высок объём Люцифераза Assay для оценки протеолиза PCSK9 сингл оборот протеазы

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Изоляция физиологически активных тилакоидов и их использования в энергии зависимых белков транспорт анализов

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Как определить долю флуоресцентных белков Photoactivated навалом и в живых клеток

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Люминесцентные серебряные пятная белков в полиакриламидных гелей

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Локализация сумо-модифицированных белков с использованием флуоресцентного сумо-улавливания белков

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Измерение взаимодействия между флуоресцентными зондами и лигнином в секциях растений sFLIM на основе автофлюоресценции коренных народов

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Характеристика клеточных белков с в-клеточной быстрой фотохимической окисления белков

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Платформа инкубатора с Movable XY этап: Новая платформа для реализации в ячейке быстрой фотохимической окисления белков

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...