Name: use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00
Duration: 19 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Detta arbete var stöds delvis av projektet ”PHARMPROT teaming” GINOP-2.3.2-15-2016-00044 och dessutom finansieras av högre utbildning institutionella Excellence programmet av ministeriet för mänskliga kapacitet i Ungern, inom ramen för den Bioteknik tematiska program av den Debrecens universitet. Författarna är tacksamma för medlemmarna i laboratorium av retrovirala biokemi för deras vetenskapliga hjälp under assay utvecklingen och även för deras tålamod under inspelningen analysen (särskilt till Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz och Vanda Toldi, som dyker upp i bakgrunden i videon). Författarna vill även säga speciellt tack vare Gedeon Richter Plc., särskilt till Dr Zoltán Urbányi för att tillåta Beáta Bozókis arbete i Institutionen för biokemi och molekylärbiologi som gästforskare. Författarna vill också utöka sin tacksamhet till György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi och Zoltán Király från Multimedia och E-learning Technical Center av den Debrecens universitet för den professionella hjälpen som ljud och video produktion.

<ol>
	<li>Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+Combinatorial+Assays+for+the+Determination+of+Protease+Activity+and+Inhibition.">Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition.</a> Molecular Informatics. 24 (10), 1141-1148 (2005).</li><li>Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biotechnological+aspects+of+microbial+proteases.">Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3), 597-635 (1998).</li><li>Zhang, G., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+assays.">Protease assays.</a> The Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Woelcke, J., Hassiepen, U., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+biochemical+assay+formats.">Fluorescence-based biochemical assay formats.</a> A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. , (2010).</li><li>Richardson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determination+and+use+of+optimized+protease+substrates+in+drug+discovery+and+development.">The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development.</a> Current Pharmaceutical Design. 8 (28), 2559-2581 (2002).</li><li>Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mapping+protease+specificity.">Methods for mapping protease specificity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 46-51 (2007).</li><li>Schilling, O., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-derived,+database-searchable+peptide+libraries+for+identifying+protease+cleavage+sites.">Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites.</a> Nature Biotechnology. 26 (6), 685-694 (2008).</li><li>Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+protease+activity+assay+using+heat-sensitive+Tus-GFP+fusion+protein+substrates.">Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates.</a> Analytical Biochemistry. 415 (2), 126-133 (2011).</li><li>Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP+based+assay+for+the+determination+of+hydrolytic+activity+and+substrate+specificity+of+subtilisins+under+washing+conditions.">A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions.</a> Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).</li><li>Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+for+site-specific+proteases+using+bead-attached+GFP+substrate.">In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate.</a> Biotechniques. 31 (5), 1194-1198 (2001).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+bioluminescence+resonance+energy+transfer-fluorescence+resonance+energy+transfer-based+ratiometric+protease+assays+with+fusion+proteins+of+firefly+luciferase+and+red+fluorescent+protein.">Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 239-245 (2011).</li><li>Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fusion+protein+platform+for+quantitatively+measuring+activity+of+multiple+proteases.">A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases.</a> Microbial Cell Factories. 13 (1), 44 (2014).</li><li>Fox, J. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maltose-binding+protein+as+a+solubility+enhancer.">Maltose-binding protein as a solubility enhancer.</a> Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).</li><li>Boz&#243;ki, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+fusion+protein-based,+fluorescent+protease+assay+for+high+throughput-compatible+substrate+screening.">A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening.</a> Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).</li><li>M&#243;ty&#225;n, J. A., Miczi, M., Boz&#243;ki, B., T&#246;zs&#233;r, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+supporting+Ni-NTA+magnetic+bead-based+fluorescent+protease+assay+using+recombinant+fusion+protein+substrates.">Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates.</a> Data in Brief. 18, 203-208 (2018).</li><li>Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+characterization+of+maturation+time+of+fluorescent+proteins+in+living+cells.">Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells.</a> Nature Methods. 15, 47-51 (2018).</li><li>Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+variation+of+fluorescence+protein+maturation+times+in+closely+related+Escherichia+coli+strains.">High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains.</a> PLoS One. 8, e75991 (2013).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

På grund av de intensiva industri- och akademiska utredningarna av proteolytiska enzymer och ständig efterfrågan på snabba och prisvärda HTS-kompatibel proteas assay plattformar med detta, har vi utvecklat ett magnetisk-pärla-baserade fluorescerande proteas assay. Analysen är baserad på användning av rekombinanta fusionsproteinerna som kan vara nya alternativ till de allmänt utnyttjad syntetisk peptid substratesna.
I formatet utvecklade analysen, är de fusion protein substratesna orörlig till ytbehandlar av Ni-kelat-coated magnetiska agaros pärlor. Substratet bilagan tillhandahålls av den N-terminalen hans6 affinitet tag av proteinet fusion, som smälts samman direkt på en MBP-tagg för att underlätta vikningen och förbättra vattenlösligheten av substrat13. MBP följs av klyvning platser av TEV PR och ett proteas sevärdheter. Den förstnämnda kan tjäna som en kontroll klyvning plats i analysen, medan den senare kan bearbetas av proteashämmaren för utredas. Webbplatsen för klyvning är utbytbara; en kort dsDNA sekvensen kodar för webbplatsen klyvning av intresse kan infogas i den flexibla 'kloning kassetten' av uttrycket plasmiden av ligering. Rekombinant fusionsproteinerna innehåller en mycket stabil, monomer fluorescerande protein tagg på C-terminalen, som möjliggör endpoint detektion av enzym-befriade, fluorescerande C-terminal sönderdelningsprodukterna släppt på proteolytisk klyvning ( Figur 1A). De renade fluorescerande intakt substrat löst i olika buffertar används också för kalibrering för att bedöma molara koncentrationerna av substrat och klyvningsprodukter. Dessutom, efter fluorimetry, kan assay komponenterna analyseras av SDS-PAGE, liksom. Både enhetliga (nondenatured) och denaturerat fluorescerande proteiner kan visualiseras i gel, omedelbart efter elektrofores eller efterföljande i-gel utvinningsarbete, respektive. Denna ytterligare förfarande-i kombination med en konventionell Coomassie Brilliant Blue färgning-kan användas effektivt för verifiering av assay resultaten (figur 1B).
Analysförfarandet består av enkla, lätt-att-utföra steg i en låg volym-format som kan vara fullt anpassade till en hög genomströmning automatisk miljö. Dock anses självständigt utföra analysen antingen manuellt eller med ett automationssystem, följande delar av analysen vara avgörande och behöver särskild uppmärksamhet medan du utför proceduren. (i) homogenitet av magnetiska pärla lösningen. En homogen magnetiska pärla lösning måste användas under hela analysen, både i rening och tvätt steg. Särskilt, beror tillförlitligheten av proteashämmare analyser starkt på korrekt alikvotering substrat-anslutna magnetiska pärla (SAMB) lager lösningarna. För att öka effektiviteten av indragning och spridning, är det rekommenderat att ställa pärla koncentrationen mellan 2% och 10% (v/v). Under provberedning, användning av buffertar kompletteras med Nonjonaktivt rengöringsmedel (t.ex. Triton x-100 eller Tween 20) upp till 2% kan också minska efterlevnaden av magnetiska pärlor plastytor. Efterlevnaden av pärlor till väggarna i ampuller prov kan undvikas om pärla upphängningarna tillämpas noggrant på bottnarna i injektionsflaskorna i stället för på väggarna i provrör. Homogenitet av magnetiska pärlor under den enzymatiska reaktionen är också kritiska och kan säkerställas genom kontinuerligt skakar proverna vid 600 rpm under inkubation. Pärlor är ordentligt dispergerade i rundade eller flatbottnade plast varor, medan användningen av V-botten injektionsflaskor inte rekommenderas. Ett suboptimala resultat som orsakats av felaktig pärla homogenisering är representerade i figur 4B. (II) upphörande av reaktion prover.  En annan fördel med metoden är att den enzymatiska reaktionen kan sägas utan användning av denaturering värmebehandling eller någon potentiellt interfererande kemiska agenser15. Uppsägning kan utföras helt enkelt genom att separera de magnetiska pärlorna från reaktionsblandningen, använda en konventionell magnetiska partikel koncentrator. Medan den borttagna reaktion-bufferten innehåller aktiva enzymet och genererade C-terminala fluorescerande sönderdelningsprodukterna, kvar på uncleaved substrat till pärlorna. Tack vare förekomsten av aktiva enzymet i reaktion bufferten behöver avskiljandetillvägagångssättet utföras noggrant för tillförlitlig slutpunktsidentifiering. Innan placera provet injektionsflaskorna i anrikningsverket, rekommenderas det att tillämpa en kort spin centrifugering. Efter att placera rören i anrikningsverket, tillhandahålla minst 15 s för pärlorna ska samlas in. Liten rörelse av separatorn och tillbaka kan underlätta insamling av pärlorna. Överväg att uppsägning under en manuellt utförd separation, oftast tar längre tid än inledandet av reaktionerna. Därför rekommenderas en cirka 2 min registrerade fördröjning mellan initiationerna om samma inkubationstiden måste tillämpas på alla prover.
Principen beskrivs proteolytiska analysens är relativt enkel; men garanteras mångsidigheten hos systemet av flexibelt och stabilt substrat struktur. Enskilda optimering av analysen kan begränsas endast av affinitet pärlorna förenlighet med de tillämpade villkor, reagenser och tillsatser. I samförstånd med tillverkarens protokollet fann vi också att affinitet bindningen av substrat till Ni-NTA pärla ytbehandlar väsentligen försvagar vid pH ≤ 6,515. Därför rekommenderas att tillämpa substrat tom prover parallellt med reaktion proverna, och frekvensen av spontana substrat dissociation måste beaktas vid utvärderingen av resultaten.
I de fall, där magnetiska-pärla-baserade analyser inte kan utföras på grund av användning av pärla-inkompatibla komponenter eller lågt pH, kan i-lösning rötning av de renade rekombinant substratesna tillämpas också. I dessa fall reaktion blandningarna kan analyseras genom elektrofores, och proteinerna kan visualiseras i gel baserat på protokollet beskrivs. För att undersöka proteolytiska aktivitet, kanske också alternativa verktyg för fluorimetry i i-lösning matsmältningen och i-gel påvisande av proteiner. En nyhet i systemet utformat substrat är tillämpningen av en i-gel utvinningsarbete steg efter denaturering SDS-PAGE. Medan infödda (nondenatured) fluorescerande proteiner behåller sin fluorescens under elektrofores, avskaffas egenskapen fluorescerande vid denaturering (figur 7B). Dock kan fluorescensen av denaturerad proteiner återvinnas delvis genom avlägsnandet av SDS från gelen. Således gör en separation av reaktion komponenter med denatureringen villkor inte bara den fluorescens-baserade men molekylär-vikt-baserade identifiering möjligt. En annan fördel med fluorescerande i-gel upptäckt jämfört med analysen av en Coomassie-färgade gel är att de (native eller renatured) fluorescerande proteinerna lätt kan identifieras i gel baserat på deras fluorescens (se figur 7). Detta kan vara viktigt om klyvning reaktioner utförs på prover som innehåller nonfluorescent föroreningar eller proteiner som mycket liknar molekylvikt av varandra.
Proteas analyser använder Likaså utformade substrat har redan tidigare publicerade8,9,10, och även om webbplatsen klyvning av intresse i de fall var också ligger mellan en affinitet-tagg och en fluorescerande protein, assay systemet presenteras här upprepar inte endast de beskrivna idéerna men kombinerar olika fördelarna med tidigare plattformar och också kompletterar dem med ytterligare förbättringar: i) utnyttjandet av en MBP fusion partner, ii) de förekomsten av en TEV PR kontroll klyvning webbplats, iii) användningen av nyutvecklade monomer FPs, och iv) tillämpningen av en unik substrat kalibreringen. Analysen själv var särskilt utformad för att vara användbar för enzym specificitet och kinetiska studier i en säker, tids - och kostnadseffektiva sätt, utan behov av dyra instrumentering. Metoden syftar till att vara en lämplig och prisvärd verktyg för både industriell och akademisk forskning. På grund av flexibiliteten i 'kloning kassett' av uttrycket plasmiden, kan systemet vara lämpliga för snabb och billig generering av rekombinant substrat bibliotek. Häri beskrivna analysen är ett möjligt verktyg för genomförandet av substrat specificitet, enzym mutagenes, och hämning studier och även ge ett alternativt verktyg för att utföra enzymkinetik. Assay plattformen (från bakteriell cell störningar vid fastställandet av de kinetiska parametrarna) kan anpassas till en HTS - och automation-baserad miljö och, eventuellt, kan tillämpas i industriella proteas hämmare screening eller antivirala läkemedel utveckling. Anpassning av analysen för konkurrenskraftiga proteolys är dessutom även i framtiden omfattningen av vårt laboratorium. I en sådan konkurrenskraftiga analys, två olika substrat-varje innehållande en olika klyvning webbplats smält till en olika C-terminala fluorescerande tagg-är avsedda att användas samtidigt i samma klyvning reaktion för att undersöka preferensen av den studerade enzymet för givet mål sekvenser. Dessutom är användningen av en 96-well plate-anpassade assay form (figur 8) också att vara optimerad för mutation screening med hjälp av en rad substrat med modifierade klyvning webbplats sekvenser vid cysteinproteaser.

Proteolytiska enzymer tillhör de mest intensivt undersökta enzym grupperna på grund av sin betydelse i metaboliska vägar och i industriella applikationer, liksom. Deras nyckelroll för virussjukdomar, reglering av blodets levringsförmåga, cancer och hjärt- och neurodegenerativa sjukdomar gör proteaser framträdande mål inom läkemedelsutveckling. Därför detaljerad karakterisering av substrat specificitet och hämmare profilering av proteashämmare (PR) av intresse är avgörande och utförs företrädesvis av snabba, kostnadseffektiva och robust biokemiska analyser1,2, 3.
Numera de allra flesta av in vitro-proteas analyser tillämpas inom läkemedelsutveckling för sammansatta profilering är homogen, fluorescerande peptid-baserad, och high-throughput screening (HTS)-kompatibla plattformar4. Dessutom märkt peptider är inte bara lämplig för bibliotek screening, men de erbjuder också bra verktyg för bestämning av enzymet kinetiska parametrar på de valda substratesna. I andra fall, om märkning av substratet inte är möjligt, kan separation-baserade analyser ge en möjlig lösning för att bedöma proteolytiska reaktioner3kinetiska egenskaper.
Allmänhet, in vitro-proteas analyser baseras på användningen av två typer av substrat: kort peptider eller hela proteiner. I de fall, där klyvning av kort peptid sekvenser återspeglar egenskaperna klyvning tillräckligt, de följande standardmetoder är tillämpliga: (i) att undersöka standard protein substrat såsom oxiderat insulin B-kedjan, (ii) testning kommersiellt tillgängligt substrat för andra proteaser, (iii) screening syntetiska och fluorescently märkt peptid-bibliotek som skapats av kombinatorisk kemi, eller (iv) med hjälp av genetiska metoder, exempelvis biologiska Visa teknik5, 6. Förutom konventionella klassificering, andra roman plattformar finns också för generering av substrat (t.ex. bildandet av proteom-derived peptid bibliotek7 eller särskilda subtyper av genetiska metoder, som den rekombinanta fusionen protein-baserade substrat8,9,10,11,12).
Alla ovannämnda substrat typer och analyser har sina egna fördelar och begränsningar, och utvecklingen av assay format att kombinera och/eller förbättra fördelarna med de kända plattformarna är fortfarande i efterfrågan. Här beskriver vi ett protokoll för en separation-baserade fluorescerande proteas analys, som använder rekombinant substrat. Dessa fusionsproteinerna består av hans6 och MBP Taggar smält till en kontroll klyvning platsen för TEV PR, som följs av substrat sekvens av intresse som är direkt ansluten till en C-terminala fluorescerande protein (FP) (figur 1A). Kloning av en DNA-sekvens som kodar för en klyvning platsen av intresse i 'kloning kassetten' kan utföras av en enda ligering reaktion till uttryck plasmiden, som har varit linearized tidigare av begränsning endonucleases.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> Figur 1: Princip fluorescerande proteas analysens. (A) schematisk representation av en fluorescerande substrat och dess klyvning av humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) proteas visas. Pilen visar klyvning position inom matrix/kapsid klyvning webbplats sekvensen i HIV-1 proteas (VSQNY * PIVQ). (B) fluorescerande substrat kan användas för att analysera enzymreaktioner av Ni-NTA magnetiska-pärla-baserade analysen och polyakrylamid gelelektrofores, samt, som visas i diagrammet arbetsflöde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Även om proteolytiska analyser använder liknande rekombinant protein substrat som innehåller en affinitet-tagg, en proteolytisk klyvning webbplats och en fluorescerande protein-har redan beskrivits8,9,10, systemet presenteras här avser att integrera och förbättra fördelarna med dessa metoder. En viktig skillnad är att de fusion protein substratesna i denna analys plattform är utrustade med MBP att förbättra protein löslighet13 och innehåller en kontroll klyvning webbplats för TEV PRs. Dessutom innehåller substratesna ny generation fluorescerande proteiner, som är mycket stabil och har en monomer form att förhindra substrat aggregering. Förutom tidigare publicerade tillämpningen av mTurquoise2 - och mApple-smält former14visar här också vi resultaten ges genom användning av ett rekombinant substrat som innehåller en monomer enhanced gul fluorescerande protein (mEYFP) fluorescerande tagg. Härmed vi demonstrera systemet förenlighet med andra fluorescerande proteiner och representerar vissa allmänna typer av resultat som kan förvärvas av proteashämmare analysen.
Rekombinant fusionsproteinerna uttrycks i E. coli BL21(DE3) celler och används som underlag för analysen i ett nickel-nitrilotriacetic syra (Ni-NTA)-belagda magnetiska-agaros-pärla-anslutna form. C-terminal sönderdelningsprodukterna är befriade från pärla ytan i supernatanten vid klyvning av proteasen sevärdheter. Efter avskiljandet av supernatanten (som innehåller enzymet och sönderdelningsprodukterna) från de magnetiska pärlorna, kan fluorescensen mätas för att bestämma egenskaperna klyvning av enzymet. I motsats till de tidigare beskrivna metoderna, kvantifieras i systemet presenteras här, mängden substrat och C-terminal klyvningsprodukter unikt utifrån en detaljerad substrat kalibreringen. Assay systemet kan stödjas av en SDS-PAGE analys av assay proverna; en efterföljande fluorescerande i-gel visualisering kan tillämpas omedelbart efter elektrofores eller efter den i-gel utvinningsarbete nondenatured och denaturerat fluorescerande komponenter, respektive14.
Flexibiliteten och struktur av 'kloning kassetten' tillåta en tids - och kostnadseffektiva isättning av en mängd olika sekvenser i konstruktionen och främjar därmed, generering av substrat bibliotek. Eftersom alla analysstegen är automation - och HTS-kompatibla, kan systemet vara särskilt attraktiv för, till exempel proteas specificitet mätningar och mutagenes studier, eller det kan också utnyttjas effektivt för industriella proteas hämmare screening och/eller utveckling av antivirala läkemedel, liksom.
Enzymet kinetiska parametrar (kkatt, Km) kan bestämmas av den utvecklade Separationsbaserade analysen; Därför kan det vara lämpligt att utföra enskilda enzym kinetiska mätningar, såsom tid-kursen, substrat-beroende och hämning studierna. Detta bevisar att de rekombinanta fusion protein substratesna ger bra alternativ för de ofta utnyttjad syntetiska oligopeptide substratesna, och på grund av deras höga likhet de polyprotein substratesna, de representerar den naturligt förekommande enzym-substrat interaktioner mer exakt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10K Amicon tubes</td>
			<td style="width:269px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC501096</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">M6250</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;">1610148</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">100063</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Agarose</td>
			<td style="width:269px;">SERVA</td>
			<td style="width:137px;">11404.04</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Alpha Imager HP gel documentation system</td>
			<td style="width:269px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A3678</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A9518</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">392185</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Black half-area plates</td>
			<td style="width:269px;">Greiner bio-One</td>
			<td style="width:137px;">675086</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">B0126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">CutSmart buffer (10x)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7204S</td>
			<td style="width:191px;">For plasmid linearization (step 1.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:269px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:137px;">DR-45M</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">M0303L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dynamag-2&#160;magnetic particle&#160;concentrator</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12321D</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Escherichia coli BL21(DE3) competent cells&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">C600003</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethanol</td>
			<td style="width:269px;">Merc-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">100983</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">798681</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7024S</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycerol</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">356350</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">G7126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">High-Speed Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:269px;">GeneAid</td>
			<td style="width:137px;">PD300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Imidazole</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">56750</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">AM9464</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Jouan CR 412 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Jouan</td>
			<td style="width:137px;">CR412</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Labinco LD-76 Rotator&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Labinco</td>
			<td style="width:137px;">7600</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L3022</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Lysozyme&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L6876</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:269px;">Scharlau</td>
			<td style="width:137px;">MA0036</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MERCK eurolab ultrasonic bath</td>
			<td style="width:269px;">MERCK</td>
			<td style="width:137px;">USR54H</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Millifuge Eppendorf spin centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">CT10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T9281</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NheI-HF restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R3131L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nickel(II) sulfate (NiSO4)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">656895</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ni-NTA magnetic agarose beads&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">36113</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">OS-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PacI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R0547L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PageBlue Protein Staining Solution&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">24620</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P7626</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Protein Lobind Micro-centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">22431102</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:269px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Snijders Press-to-Mix shaker&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Gemini</td>
			<td style="width:137px;">34524</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-acetate trihydrate</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S7670</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-chloride</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S9888</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S5881</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">S7563</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:269px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M180A</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Thermo shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">TS-100</td>
			<td style="width:191px;">with SC-24 accessory block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tris</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T1503</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tween 20</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P2287</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter</td>
			<td style="width:269px;">Wallac Oy, Turku, Finland</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation

Proteaser är intensivt studerade enzymer på grund av deras viktiga roller i flera biologiska spridningsvägar av levande organismer och i patogenesen; Därför är de viktiga målmolekyler. Vi har utvecklat en magnetisk-agaros-pärla-baserade test plattform för utredning av proteolytiska verksamhet, som bygger på användning av rekombinanta fusion protein substrat. För att demonstrera användningen av detta test system, presenteras ett protokoll på exemplet med humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) proteashämmare. Introducerade assay plattformen kan utnyttjas effektivt i biokemisk karakterisering av proteaser, inklusive enzym Aktivitetsmätningar i mutagenes, kinetic, hämning eller specificitet studier, och det kan vara lämplig för hög genomströmning substratet screening eller kan anpassas till andra proteolytiska enzymer.
I detta test system, de tillämpa substratesna innehåller N-terminala hexahistidine (hans6) och maltos-bindande protein (MBP) Taggar, klyvning platser för tobak etch virus (TEV) och HIV-1 proteaser och en C-terminala fluorescerande protein. Substratesna kan vara effektivt produceras i Escherichia coli -celler och renat enkelt med nickel (Ni) - kelat - belagda pärlor. Under analysen leder proteolytisk klyvning av pärla-knutna substrat till utsläpp av fluorescerande klyvning fragment, som kan mätas med fluorimetry. Klyvning reaktioner kan dessutom analyseras av sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE). Ett protokoll för den i-gel utvinningsarbete assay komponenter beskrivs också, som delvis återställande av fluorescerande proteiner gör deras påvisande baserat på molekylvikt och fluorescens.

Figur 1A visar den schematiskt strukturen av en representativ fluorescerande rekombinant protein substrat som kan bearbetas av HIV-1 PR på dess specifika klyvning webbplats sekvens. Figur 1B representerar substrat produktion och deras möjliga tillämpningar i proteas-analyser, inklusive Ni-NTA magnetiska-pärla-baserade assay eller sida.
För att få tillförlitliga data genom fluorimetry, krävs en kalibrering, för att fastställa kvantiteterna fluorescerande substrat och klyvningsprodukter. För detta, fluorescens intensitetsvärden för de olika substratesna i de olika buffer villkor behöver mätas och behöver vara korrelerade med deras koncentrationer i analyseras koncentrationer (figur 3). Kalibreringskurvornas lutning värden kan tillämpas för att avgöra mängden substrat och klyvningsprodukter i assay proven. Backarna kalibreringskurvornas är oberoende av klyvning webbplats sekvenser infogas i substratesna (tabell 11) och potentiellt kan användas för en rad substrat smält till samma typ av fluorescerande protein. Zooma in grafer visas för alla Linjära regressioner, att förstora lägre koncentration spänner också (figur 3). Det är viktigt att notera att kalibreringen behöver utföras noggrant eftersom en korrekt fördelning av datapunkter krävs för en pålitlig kalibrering. Av denna anledning används tvåfaldiga seriella utspädning för att bereda proverna för kalibrering, eftersom R2 värdet anger en god korrelation mellan koncentrationen av fluorescerande protein och fluorescens endast om tillräckligt antal datapunkter har använts för att täcka det hela koncentrationsintervallet. Dessutom kan experimentella fel starkt påverka precisionen i kalibrering; Således, en grafisk utvärdering av raderna regression kan behövas också.
En mängd enzymatisk mätningar kan utföras av proteashämmare analysen, inklusive en granskning av effekten av substrat koncentrationen på reaktion hastighet (figur 4A). Av icke-linjär regression, kan data användas för att bestämma enzym kinetiska parametrar (t.ex. vmax och Km). En otillräcklig pärla suspension och spridning och en felaktig reaktion uppsägning kan orsaka suboptimala resultat (figur 4B), som inte är lämpliga för beräkning av pålitligt enzym kinetiska värden.
Ett beroende av produkt bildandet i tid kan bestämmas genom analysen (figur 5A) (t.ex. under optimering av parametrarna klyvning reaktion). Enzymaktivitet i närvaro av en hämmare kan också undersökas (figur 5B) för bestämning av aktiva enzym koncentration och hämmande konstant. Använder samma metod, kan andra hämmares effekter också kontrolleras med analysen.
Proteas analysen är användbar när du undersöker effekterna av pH på enzymaktivitet, liksom. Figur 6A representerar beroendet av enzymaktivitet på pH vid exemplet av TEV PR, som har en bred optimala pH-intervall (pH 6-9). Om pH beroendet av enzymaktivitet studeras (eller enzymer med en sura pH optimal behöver mätas), är det nödvändigt att överväga att affinitet bindningen av rekombinant substrat till pärlorna kan vara begränsad på något surt pH. En förhöjd dissociation av substratesna från pärlorna (figur 6B) kan orsaka en snedvridning av analysens resultat. För att överväga spontana substrat dissociationen från pärlor, behöver de värden som uppmätts för reaktion prover korrigeras med dem i B prover.
Figur 7 visar att de nondenatured fluorescerande proteinerna kan göras åtskillnad mellan i gel baserat på deras färger, med blå ljus genomlysning (figur 7A). Om bestämning av molekylvikt av substrat/klyvning fragment är nödvändigt, kan denaturering villkor också användas för provberedning, eftersom fluorescerande proteiner kan vara delvis renatured i gel, och kan upptäckas av UV belysning (Figur 7B) eller genom Coomassie färgning (figur 7 c). Om R proverna analyseras, är endast C-terminal sönderdelningsprodukterna synlig (figur 7 c), medan N-terminala klyvning fragment och de uncleaved substratesna sitta kvar till pärlorna. Ibland, proteiner kan denatureras delvis trots användande nondenaturing förhållanden (figur 7 c), och medan de nondenatured proteinerna är mer riklig, denaturerad former är också påvisas i provet. Detta fenomen påverkar inte detektion av proteolytisk klyvning men måste beaktas när det gäller kvantitativa densitometry nondenatured prover.
Trots den detaljerade beskrivningen visas endast för en 2 mL-tube-baserad analys, kan analysen anpassas för ett 96 brunnar plattan-baserade system (figur 8), som har redan testats framgångsrikt i vårt laboratorium (visas inte). 96-väl plattan-anpassade formatet är helt kompatibel med de fluorimetriskt och elektroforetiska analyser, liksom, och de erhållna uppgifterna kan också utvärderas baserat på de metoder som beskrivs i detta dokument.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> Figur 3 : Kalibreringskurvor. Representativa substrat kalibreringskurvorna demonstreras med exemplet av två rekombinant substrat smält till olika C-terminala fluorescerande Taggar: (A och B) hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 (C och D ) Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zooma in siffror visas också att representera en linjär regressionslinje för datapunkterna i den 0-0,005 mM substrat koncentrationsintervall. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> Figur 4 : Bestämning av enzymet kinetiska parametrar. Substrat-beroende kinetiska mätningar utfördes av HIV-1 PR (på aktiv koncentration på 41,2 nM). De inledande hastighet värdena var plottas mot substrat koncentrationen och Michaelis-Menten icke-linjär regressionsanalys utfördes. Felstaplar representera SD (n = 2). (A) A representativa optimalt resultat visas med exemplet av hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple fusion protein substrat. (B) en representativa suboptimala resultat visas också för hans6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 substrat, där inställningen av ordentlig substrat koncentrationer var problematiskt på grund av en otillräcklig homogenisering SAMB stamlösning , medan relativt höga fel orsakades av felaktig reaktion uppsägning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> Figur 5 : Tid-kurs och hämmande studie. (A) Hans 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP rekombinant fusion protein substrat (med en slutlig koncentration på 0.00326 mM) var klyvs av HIV-1 PR (på aktiv koncentration på 41,2 nM), och frisläppandet av fluorescerande PIVQ-mEYFP proteolytiska fragment mättes till utföra en tid-kursen analys. Mätningarna utfördes vid fem olika tidpunkter. Felstaplar representera SD (n = 2). (B), hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP användes som substrat (vid 0,0015 mM) för att bestämma vilken amprenavir hämmande effekt på aktiviteten av HIV-1 PR (vid en total koncentration på 163,8 nM). Av Rita data, den halv maximal hämmande koncentrationen (IC50) kunde bedömas och aktiva enzym koncentration (aktiv koncentration på 41,2 nM) av tillämpad HIV-1 PR kan också beräknas baserat på hämning kurvan. Felstaplar representera SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> Figur 6 : Studera beroendet av enzymaktivitet och spontana substrat dissociation på pH. (A) den hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (i 0.033 mM) användes för att mäta enzymaktiviteten av TEV PR (med en slutlig total koncentration på 91.42 nM) i klyvning buffert anges till en olika pH, mellan utbudet av 6,5-8,5. Felstaplar representera SD (n = 2). Plottade data har gått tidigare publicerade14. (B) baserat på de relativa fluorescerande intensitetsvärdena av substrat tom proverna, spontana dissociationen av hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (0.033 mM) från de magnetiska pärlorna studerades med hjälp av klyvning buffert med olika pH, mellan 6.0-8,5. Plottade data har gått tidigare publicerade14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> Figur 7 : Påvisande av proteiner i gelen genom olika metoder. (A) Uncleaved och HIV-1 PR-rötas fusion protein substrat efter nondenaturing provberedning var visualiserat av blå ljus genomlysning efter SDS-PAGE. Klyvning reaktionen utfördes av i-lösning matsmältning. (B) omedelbart efter sidan, endast nondenatured proteiner kunde detekteras i gel av UV belysning, medan efter avlägsnande av SDS, de tidigare denaturerat fluorescerande proteinerna blev delvis renatured och detekterbar. Proverna var beredda från supernatanterna Ni-NTA magnetiska-pärla-baserade analysens. (C) Coomassie färgning kan också användas för protein detektering, efter den i-gel utvinningsarbete. SDS-gåvan i gel-maj orsaka den partiell denaturering av proteinet infödda, men i native prover, de nondenatured formerna är rikligare. Proverna var beredda från supernatanterna Ni-NTA magnetiska-pärla-baserade analysens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> Figur 8 : 96-well plate-baserade anpassning av assay plattformen. (A) analysen kan utföras inte bara i 2 mL rör men i brunnarna av en plattan med 96 brunnar, samt. Här visar vi schematiska för tillämpningen av analysen att studera ett fiktivt proteas specificitet med hjälp av en serie av fluorescerande substrat, som kan innehålla vildtyp (wt) eller muterade (mut-1 till mut-4) klyvning webbplats sekvenser. För hantering av de magnetiska pärlorna, är en 96-väl kompatibel magnetiska partikel koncentrator (MPC) att användas i experiment. Alla de angivna volymerna är relaterade till en enda brunn. För att jämföra klyvning effektiviteten i de olika substratesna, kan substrat konvertering bedömas utifrån andelen substrat-blank-korrigerade RFU värden av reaktion proverna, med tanke på substrat-blank-korrigerade RFU värdena av de relaterade substratet kontrollprover som 100. (B) efter fluorimetry, separerade supernatanterna analysens prover kan också analyseras genom sida och de fluorescerande protein-komponenterna kan analyseras direkt eller efter i-gel utvinningsarbete vid nondenaturing och denatureringen prov förberedelse, respektive. De tre olika assay provtyper illustreras också i varje figur: C = substrat kontroll, B = substrat tomt och R = reaktion. Substratet kontrollprover i eluering buffert, medan substratet tomt och reaktion proverna är klyvning buffert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Buffert</td>
			<td>Fluorescerande protein</td>
			<td>CV % pister (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluering</td>
			<td rowspan="2">mTurquoise2</td>
			<td>6,04</td>
		</tr>
<tr>
<td>Klyvning</td>
			<td>9.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluering</td>
			<td rowspan="2">mApple</td>
			<td>10,92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Klyvning</td>
			<td>12,68</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 11: koefficient av variansen (CV %)-värden av backarna i substrat kalibreringskurvorna. För att testa om fluorescensen av de rekombinanta protein substratesna är beroende av webbplatsen infogade klyvning, utfördes kalibreringar av serien av mApple - och mTurquoise2-smält substrat (sex varianter för varje, innehållande olika klyvning webbplats sekvenser av HIV-1 proteas), både i eluering och klyvning buffertar. Vi fann att CV % värden i backarna under 15% i alla fall, vilket innebär att en enda underlag kalibrering kan utnyttjas för utvärdering av de olika mått som utförs av substrat varianter innehållande samma fluorescerande tagg.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Användning av rekombinanta fusionsproteinerna i en fluorescerande proteas Assay plattform och deras i-gel utvinningsarbete

Här presenterar vi de detaljerade anvisningar av en nyligen utvecklad proteas assay plattform använder N-terminala hexahistidine/maltos-bindande protein och fluorescerande protein-smält rekombinant substrat kopplad till ytan av nickel-nitrilotriacetic sura magnetiska agaros pärlor. Efterföljande i-gel analys av assay proverna åtskilda av sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores presenteras också.

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Proteaser är en av de mest undersökta grupperna av biomolekylära stöd inom akademisk och industriell forskning. Deras kraftfulla roll i flera fysiologiska och patologiska processer gör dem till ett framträdande mål inom området läkemedelsupptäckt också. När det gäller deras intensiva forskning finns det en stor och kontinuerlig efterfrågan på utveckling av tid-och kostnadsbesparande hög genomströmning screening-kompatibla fluorescens proteas assay plattformar.Här vill vi införa ett protokoll för tillämpning av en separationsbaserad höggenomströmning screening-kompatibel fluorescens analysplattform med både mTurquoise2-och mApple-smält rekombinanta fusion proteas substrat. Dessutom vill vi visa en metod för i-gel renaturation av substrat och klyvning fragment av analysen prover efter denaturering SDS-PAGE också. Alla experimenten utförs på exemplet med HIV-1-virusproteas.Uttrycket plasmid bär kodning sekvensen av en hexa histadin affinitet tag och en maltose bindande fusionsprotein följt av en kontroll klyvning plats av tobak etch virus proteas, en kloning kassett, och en C-terminal fluorescerande protein. Linjärisera uttrycket plasmid av PacI och NheI begränsning endonucéer. Utför glödgningen av Escherichia coli-kodon optimerade framåt och omvända oligonukleotidprimrar som kodar för substratsekvensen av intresse och flank av PacI och NheI sammanhållna ändar.Utför insättning av de glödgade primersna i det linjäriserade uttrycket plasmid genom ligering. För proteinuttryck, omvandla BL21(DE3)kompetenta celler genom ligerblandningen. De fluorescerande proteiner kommer att vara i samma öppna läsramen med N-terminalen fusion taggar först efter en lyckad ligatur.Några dagar efter omvandlingen, kolonierna som innehåller uttrycket plasmid kodning den insatta klyvning plats av intresse kommer att visa synlig fluorescens med eller ens utan att använda en Dark Reader blå transilluminator. Tillsätt 10 mikroliters glycerollager av BL21(DE3)cellerna som bär uttrycket plasmid kodning för klyvningsställets sekvens av intresse till fem milliliter LB-medium som innehåller 100 mikrogram per milliliter ampicillin i ett 50 milliliter centrifugub. Inkubera suspensionen i 37 grader i 15 timmar medan du hela tiden skakar.Överför fem milliliter bakteriekultur till 50 milliliter färskt LB-medium som innehåller 100 mikrogram per milliliter ampicillin. Odla cellerna i 37 grader till en absorbans på 0,6 till 0,8 vid 600 nanometervåglängder. Vid denna punkt, inducera protein uttryck genom tillsats av IPTG.Inkubera kulturen i tre timmar vid 37 grader medan den kontinuerligt skakar. Efter inkubationen överför du 25 milliliter av odlingen till rena 50 milliliter centrifugrör, och skörda cellerna genom centrifugering. Kassera supernatanten och förvara bakteriecellpelletsen på minus 70 grader i minst en timme.Cellpellets som innehåller de framgångsrikt uttryckta fluorescerande proteinerna visar tydligt en fluorescens med eller till och med utan att använda en Dark Reader blå transilluminator. Placera den frusna cellpelleten på is och låt den tina i 15 minuter. Tillsätt två milliliterlysbuffert till pelleten och dra upp cellerna.Lägg härefter proteashämmare, befria suspensionen genom lyzozyme och DNase, suspendera cellerna och inkubera suspensionen på is i 15 minuter. Överför två gånger en milliliter suspensioner i 1,5 milliliter microcentrfuge rör och sonikera suspensioner i tre minuter i omgångar av 10 sekunder av ultraljudsbehandling och fem sekunder paus. Centrifugera rören vid 10, 000 g i 20 minuter vid rumstemperatur.Rensade bakteriecellslytes som innehåller det fluorescerande substratet av intresse visar synlig fluorescens med eller till och med utan att använda en Dark Reader blå transilluminator. Förfarandet för den utvecklade proteasanalysen börjar med beredningen av analysproverna. För det första inkuberas de rekombinanta substraten med affinitetsmagnetiska pärlor, och de substratfästa magnetiska pärlorna, förkortade som SAMBs, bildas.SAMBs tvättas flera gånger, och slutligen SAMB stamlösningen framställs av aliquoting av vilka analysprover skapas. Reaktionerna initieras genom tillsats av proteaslösningen. Vid klyvning av proteasen släpps de proteolytiska fragmenten ut i supernatanten.Reaktionen avslutas genom att de magnetiska pärlorna separeras från reaktionsbufferten som innehåller de fluorescerande klyvningsprodukterna och enzymet. Supernatanterna appliceras på brunnarna i en mikrotiterplatta och fluorescensen bestäms av fluorimetry. Kalibreringskurvor genereras med hjälp av renat fluorescerande substrat som lösts i varje analysbuffertar.Koncentrationen av C-terminalen fluorescerande klyvningsprodukter och även den av det applicerade substratet i analysproverna bestäms utifrån lutningen på kalibreringskurvorna. Placera röret som innehåller nya eller återvunna nickel-NPA magnetiska agarospärlor i en magnetisk partikelkoncentrator. Pärlor kan fastna på väggen och/eller i locket på mikrocentrifugröret.Vänd därför koncentratorn upp och ner i alla riktningar för att se till att alla pärlor samlas in. Ta bort supernatanten och kassera den. Tillsätt 1,8 milliliters lysbuffert till pärlorna och ta bort de slutna rören från koncentratorn.Dra upp pärlorna i röret genom att skaka och/eller vrida röret upp och ner tills pärlorna är helt homogena. Placera rören tillbaka i koncentratorn och vänd den upp och ner i alla riktningar för att se till att alla pärlor samlas. Öppna röret och kassera supernatanten.Tillsätt rensad bakteriesteril lysate som innehåller substratet av intresse och avlägsna det slutna röret från koncentratorn. Vänd rören upp och ner tills pärlorna är helt homogena och rotera rören med rotator, långsamt, vid rumstemperatur i 30 minuter. SAMBs visar synlig fluorescens med eller ens utan att använda en Dark Reader blå transilluminator.Tvätta SAMB:erna tre gånger med 1,8 milliliter 1%Tween 20, tvättbuffert och klyvningsbuffert. Lägg till klyvningsbuffert till de tvättade SAMB:erna för att skapa en SAMB-stamlösning. Om två milliliter protein-lågbindande mikrocentrifugrör används, är volymen för den applicerade klyvningsbufferten upp till 1,9 milliliter.Efter det att bufferten tillsats inte ska skakas eller vänds röret upp och ned. Stäng röret och ta bort det från koncentratorn. Förbered två-milliliter protein-låg-bindande mikrocentrifugrör för analysproverna.Suspendera SAMB-stamlösningen tills den är helt homogen och mät den mängd substrat som ska analyseras i reaktionerna genom att omedelbart överföra SAMB-stamlösningen i provflaskan. Volymen av SAMB stamlösning som ska överföras rekommenderas att vara 25 till 300 mikroliter, men det ska ställas in enligt den enskilda experimentella designen. Placera provrören som innehåller de alikvoterade SAMB-suspensionerna i koncentratorn.Ta försiktigt bort supernatanten från SAMB:erna och kassera den. Ta bort rören från koncentratorn och tillsätt försiktigt reaktionsbufferten till SAMB:erna. Volymen av den tillagda reaktionsbufferten ska beräknas enligt den individuella experimentella konstruktionen, men det rekommenderas att den slutliga volymen av reaktionsblandningen ställs in mellan 50 och 150 mikroliter om två milliliterrör används.Stäng rörens lock. Nu är proverna redo för att initieras. Tillsätt enzymlösningen till reaktionsproverna.Rör upp pärlorna försiktigt genom att försiktigt flytta rören och placera rören omedelbart i den redan skakande termoshaken. När det gäller substratprover och substratkontrollprover, tillsätt klyvningsbuffert respektive elueringsbuffert. Trettio sekunder före inkubationens, ta ut provet från termoshakaren och snurra det snabbt.Placera röret på koncentratorn och låt röret stå i 15 sekunder. Samb-ernas insamling kan underlättas genom att koncentratorn flyttas något fram och tillbaka. Öppna locket och överför supernatanten försiktigt i en platta eller ett nytt rör.Vidrör inte de koncentrerade pärlorna vid pipettens spets. Den insamlade supernatanten för substratets kontrollprover och reaktionsproverna med hög klyvningsgrad kan visa synlig fluorescens med eller till och med utan att använda en Mörkläsare blå transilluminator. Överför två gånger 30 mikroliter av de separerade provet supernatanter till en svart mikroplatta för halva området.Mät fluorescensen med fluorimeter med hjälp av lämpliga filter enligt det påsedd fluorescerande proteinet. För rening av de fluorescerande substraten, preparera samma lösning som beskrivits tidigare, och kassera supernatanten. Tillsätt 400 till 600 mikroliters elueringsbuffert till SAMB:erna och rotera rören med rotator långsamt i rumstemperatur i fem minuter.Överför eluatet till nya protein-lågbindande mikrocentrifugrör. Den visar tydligt synlig fluorescens med eller utan att använda en Dark Reader blå transilluminator. Efter rening, buffertutbyte, och mätning av proteininnehållet, bereda en tvåfaldig serieutspädning i minst åtta steg, både från elueringsbuffert-och de klyvnings-buffertlösa substratlösningarna, med hjälp av ellutions- respektive klyvningsbuffert för utspädning.Överför 30 mikroliter av varje utspädningspunkt till en svart mikroplatta för halva området. Mät fluorescensen med fluorimeter med hjälp av samma inställningar som tillämpades vid mätningen av assayprovet supernatanter. Som ett exempel för databehandling utfördes de substratberoende kinetiska mätningarna av HIV- 1-proteas på en mTurquoise2-smält form av det rekombinanta substrat som kodade klyvningsstället mellan matrisen och de kapsidproteiner i det naturliga gapic proteinet precursor.Plotta de korrigerade relativa fluorescensintensitetsvärdena mot de renade substratens molkoncentration, lösa antingen klyvnings- eller elueringsbufferten och utföra linjär regression. Beräkna C-terminalens molkoncentration i reaktionsproverna med hjälp av lutningen på den klyvningsbuffertbaserade kalibreringskurvan. Beräkna även den tillämpade substratkoncentrationen i reaktionsproverna baserat på det eluterade substratets molkoncentration i underlagets kontrollprover med hjälp av lutningen på den elutionsbuffertbaserade kalibreringskurvan.Värden för ursprunglig hastighet beräknades från mängden av de C-terminala klyvningsfragmenten och ritades sedan mot den tillämpade substratkoncentrationen. Också kinetic parametrar var beslutsamt vid Michaelis-Menten non-linear regressionsanalys. Efter att ha utfört nickel-NTA magnetiska pärla-baserade analysen, analysen supernatanter kan analyseras av polyakrylamid gel elektrofores också.Men, bredvid analysen av analysproverna, är det också möjligt att analysera de renade lysrörssubstraten och/eller klyvningsfragmenten efter i-lösningsuppsytning. För in-solution digestion, alikvotera de renade fluorescerande substraten som ska smältas upplöst i klyvningsbuffert i 1,5 milliliter mikrocentrifugrör, och tillsätt enzymlösningen till proverna. Inkubera proverna enligt försöksdesignen och avsluta reaktionerna genom förfarandet för provberedningen för PAGE.För icke-antydd provpreparering, blanda de prover som ska analyseras med icke-denaturing provlastningsbuffert som inte innehåller några reduktionsmedel. Vid denaturerad provberedning, blanda de prover som ska analyseras med denaturing provlastningsbuffert och exponera proverna för värmebehandling vid 95 grader i 10 minuter. Applicera de icke-denaturerade och de denaturerade proverna i brunnarna i SDS-polyakrylamidgelen och utför elektrofores.Ta bort gelkassetten från löparmodulen. Icke-denaturerade prover är redan synliga i gelen även med blotta ögat eller med Dark Reader blå transilluminator. För att detektera de lysrörskomponenter som de denaturerade proverna på transilluminatorn ska kunna upptäckas, utför du omrenteringen i gel genom att tvätta SDS:en ur gelen.Tillsätt 100 milliliter destillerat vatten till gelen och skölj det åtminstone i 30 minuter. Visualisera de fluorescerande proteinerna genom att placera den obefläckade gelen på dark reader-transilluminatorn. De rekombinanta fluorescerande fusionsproteinerna konstruerades för att användas som substrat i proteolytiska analyser.Vid klyvning av proteasen vid det specifika klyvningsstället frigörs C-terminalt fluorescerande klyvningsfragment och dess fluorescens kan detekteras. Deras användning i nickel-NTA magnetiska pärla-baserade analys och fluorescerande upptäckt genom PAGE analys har optimerats med hjälp av HIV-1 proteas. Dock kan den utvecklade analysen plattform vara lämplig för andra proteaser också.Kalibreringskurvor av de renade substrat som lösts i klyvning eller ellutionsbuffert illustreras på exemplen både mTurquoise2- och mEYFP-smält form av det rekombinanta substrat som kodar klyvningssidan mellan matrisen och de kapsidproteiner som det naturliga hiv-anekotiska proteinet utgör. Den magnetiska pärlabaserad analys av nickel-NTA-baserade assayen är ett användbart verktyg för att undersöka substratkoncentrationens effekt på reaktionshastigheten och gör därigenom också bestämningen av de enzymkinetiska parametrarna såsom Vmax och Km möjlig. Diagram A visar ett optimalt resultat som erhålls efter en framgångsrikt utförd analys av substratberoende aktivitet på ett mApple-smält substrat.I kontrast, diagram B presenterar en sub-optimalt resultat där den otillräckliga homogenisering av SAMB stamlösningen orsakar problem i att ställa in rätt substrat koncentrationer medan felaktig uppsägning av reaktionsprover resulterar i relativt höga fel. Analysen ger också ett lämpligt verktyg för att utföra tid-kurs och hämmande studier samt. Diagram A visar tidsberoendet av proteolytisk klyvning av HIV- 1-proteas på ett mEYFP-smält substrat, medan diagram B representerar amprenavirs hämmande effekt på klyvningsreaktionen.Av de data som erhålls genom den hämmande studien kan både den aktiva enzymkoncentrationen och den hämmande konstanten bestämmas. Analysen kan också optimeras för att studera beroendet av enzymaktivitet på pH, eftersom den representeras av diagram A på exemplet med tobaks etch-virusproteas. Diagram B anger en begränsning av analysen med pH och visar att neutralt eller svagt alkaliskt pH-värde är helt kompatibelt med mätningarna, medan sura pH-värdet underlättar spontan dissociation av substraten från ytan av de magnetiska pärlorna.Den föreliggande figuren visar de renade intakta fluorescerande substraten, de fluorescerande C-terminala klyvningsfragmenten, genererade genom in-solution-matsmältning av HIV-1-proteas. De fluorescerande komponenterna kan detekteras i den SDS-innehållande polyakrylamidgelen genom blå ljusstransilmination direkt efter elektroforesen om icke-denatureringsförhållanden tillämpades vid provberedning. De olika fluorescerande proteinerna kan differentieras baserat på deras färg.Efter den magnetiska pärla-baserade analysen, de icke-denaturerade fluorescerande proteiner i provet supernatanter kan detekteras i gelen genom UV-belysning också. Om denatureringsförhållanden tillämpas vid provberedning kan däremot de denaturerade proteinerna inte detekteras i gelén omedelbart efter SDS PAGE. De denaturerade fluorescerande proteinerna kan dock delvis omreturerade genom borttagande av SDS från gelén och bli detekterbara.Därför följs SDS PAGE av förfarandet för avrentering av gel. De fluorescerande proteinens renaturationsförmåga gör deras identifiering möjlig inte bara utifrån deras fluorescens utan också utifrån deras molekylvikt. Här visade vi protokollet för användning av vår nyligen utvecklade magnetiska pärla-baserade fluorescerande proteas analys plattform.Vi har visat användningen av detta system på exemplet med enzymkinetiska studier på HIV-1 proteas. Vi använde mTurquoise-och mApple-smält former av rekombinant assay substrat, som innehöll klyvning plats sekvens av proteas. Förutom den fluoriska analysen analyserades analysproverna senare av SDS PAGE också.Vi har visat att de denaturerade fluorescerande proteinerna delvis kan renatureras i gelen efter SDS PAGE som ger både fluorescerande och molekylviktsbaserad identifiering av underlaget och de proteolytiska fragmenten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Mycket känslig och kvantitativa påvisande av proteiner och deras isoformer av kapillär isoelektrisk fokusering metod

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

En hög genomströmning luciferas analysen att utvärdera proteolys av enda-omsättning proteas PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologiskt aktiva Thylakoids och deras användning i energi-beroende Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hur att kvantifiera fraktionen av Photoactivated fluorescerande proteiner i Bulk och i levande celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerande silverfärgning av proteiner i polyakrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifierade proteiner med fluorescerande Sumo-fångst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Mätning av interaktioner mellan fluorescerande sonder och lignin i Plant sektioner av sFLIM baserat på ursprunglig Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakterisera cellulära proteiner med In-cell Snabb fotokemisk oxidation av proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Plattformsinkubator med rörlig XY-scen: En ny plattform för implementering av snabbfotokemisk oxidation av proteiner i celler

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...