Name: use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00
Duration: 19 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Bu eser kısmen GINOP-2.3.2-15-2016-00044 "PHARMPROT ekip" projesi tarafından desteklenen ve, Ayrıca, çerçevesinde Yükseköğretim kurumsal mükemmellik programı, Bakanlığı insan kapasiteleri Macaristan, tarafından finanse Debrecen Üniversitesi biyoteknoloji tematik program. Yazarlar laboratuvar Retroviral Biyokimya bilimsel yardımlarına tahlil geliştirme sırasında hem de (özellikle için Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz ve Vanda Toldi, tahlil çekimleri sırasında sabırları için üyeleri için minnettarız kim video arka planda görünmüyor). Yazarlar ayrıca özel sayesinde Gedeon Richter Plc., özellikle Beáta Bozóki'nın iş bölümü Biyokimya ve moleküler biyoloji misafir araştırmacı olarak izin vermek için Dr Zoltán Urbányi söylemek istiyorum. Yazarlar ayrıca ses ve video profesyonel yardım Multimedya ve E-öğrenme Teknik merkezi Debrecen Üniversitesi György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi ve Zoltán Király için onların Şükran diyoruz. üretim.

<ol>
	<li>Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+Combinatorial+Assays+for+the+Determination+of+Protease+Activity+and+Inhibition.">Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition.</a> Molecular Informatics. 24 (10), 1141-1148 (2005).</li><li>Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biotechnological+aspects+of+microbial+proteases.">Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3), 597-635 (1998).</li><li>Zhang, G., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+assays.">Protease assays.</a> The Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Woelcke, J., Hassiepen, U., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+biochemical+assay+formats.">Fluorescence-based biochemical assay formats.</a> A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. , (2010).</li><li>Richardson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determination+and+use+of+optimized+protease+substrates+in+drug+discovery+and+development.">The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development.</a> Current Pharmaceutical Design. 8 (28), 2559-2581 (2002).</li><li>Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mapping+protease+specificity.">Methods for mapping protease specificity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 46-51 (2007).</li><li>Schilling, O., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-derived,+database-searchable+peptide+libraries+for+identifying+protease+cleavage+sites.">Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites.</a> Nature Biotechnology. 26 (6), 685-694 (2008).</li><li>Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+protease+activity+assay+using+heat-sensitive+Tus-GFP+fusion+protein+substrates.">Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates.</a> Analytical Biochemistry. 415 (2), 126-133 (2011).</li><li>Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP+based+assay+for+the+determination+of+hydrolytic+activity+and+substrate+specificity+of+subtilisins+under+washing+conditions.">A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions.</a> Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).</li><li>Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+for+site-specific+proteases+using+bead-attached+GFP+substrate.">In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate.</a> Biotechniques. 31 (5), 1194-1198 (2001).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+bioluminescence+resonance+energy+transfer-fluorescence+resonance+energy+transfer-based+ratiometric+protease+assays+with+fusion+proteins+of+firefly+luciferase+and+red+fluorescent+protein.">Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 239-245 (2011).</li><li>Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fusion+protein+platform+for+quantitatively+measuring+activity+of+multiple+proteases.">A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases.</a> Microbial Cell Factories. 13 (1), 44 (2014).</li><li>Fox, J. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maltose-binding+protein+as+a+solubility+enhancer.">Maltose-binding protein as a solubility enhancer.</a> Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).</li><li>Boz&#243;ki, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+fusion+protein-based,+fluorescent+protease+assay+for+high+throughput-compatible+substrate+screening.">A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening.</a> Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).</li><li>M&#243;ty&#225;n, J. A., Miczi, M., Boz&#243;ki, B., T&#246;zs&#233;r, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+supporting+Ni-NTA+magnetic+bead-based+fluorescent+protease+assay+using+recombinant+fusion+protein+substrates.">Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates.</a> Data in Brief. 18, 203-208 (2018).</li><li>Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+characterization+of+maturation+time+of+fluorescent+proteins+in+living+cells.">Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells.</a> Nature Methods. 15, 47-51 (2018).</li><li>Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+variation+of+fluorescence+protein+maturation+times+in+closely+related+Escherichia+coli+strains.">High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains.</a> PLoS One. 8, e75991 (2013).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Proteolitik enzim yoğun endüstriyel ve akademik araştırmalar ve ivedi ve uygun fiyatlı HTS-uyumlu proteaz tahlil platformlar için sürekli talep nedeniyle buna göre manyetik-boncuk-based floresan proteaz geliştirdiğimiz tahlil. Tahlil için yaygın olarak kullanılan sentetik peptid yüzeylerde yeni alternatifler olabilir rekombinant füzyon protein kullanımı temel alır.
Gelişmiş tahlil biçiminde füzyon protein yüzeyler manyetik özel Ni şelat kaplı boncuk yüzeyler için immobilize. Substrat eki onun6 benzeşme etiket doğrudan katlanır kolaylaştırmak ve substrat13su çözünürlük geliştirmek üzere bir MBP etiketi eritilmiş olan füzyon proteinin N-terminal tarafından sağlanır. MBP TEV PR sitelerin bölünme ve bir proteaz ilgi takip eder. Proteaz tarafından araştırılması için ikinci işlenebilir ise eski denetim bölünme site tahlil olarak hizmet verebilir. Göğüs arası değiştirilebilir sitesidir; bir kısa dsDNA sıra ilgi bölünme sitesi için kodlama esnek 'klonlama 've kaset ifade plazmid tüp ligasyonu tarafından eklenebilir. Rekombinant füzyon protein C-Terminal, proteolitik bölünme ( serbest enzim kurtarılmış, floresan C-terminal bölünme ürünleri son nokta tespiti sağlar son derece kararlı, monomeric floresan protein etiketi Şekil 1A). Farklı arabellekleri çözüldü arıtılmış floresan olduğu gibi yüzeylerde de kalibrasyon için yüzeyler ve bölünme ürünleri, molar konsantrasyonlarının değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca, fluorimetry sonra tahlil bileşenleri SDS-PAGE tarafından de analiz edilebilir. Her iki yerli (nondenatured) ve denatüre floresan proteinler görselleştirildiği jel elektroforez hemen sonra veya sonraki jel renaturation sonra sırasıyla. Bu ek prosedür-in ile birlikte bir geleneksel Coomassie parlak mavi boyama-Mayıs verimli bir şekilde tahlil sonuçları (Şekil 1B) doğrulaması için kullanılması.
Basit, kolay yürütme adımları tam olarak bir yüksek-den geçerek otomatik ortamına adapte olabilir bir düşük hacimli biçimde tahlil özetlenebilir. Ancak, bağımsız olarak el ile veya bir otomasyon sistemi ile tahlil gerçekleştirmesini, tahlil aşağıdaki bölümlerini çok önemli ve özel ilgi yordamı gerçekleştirmeniz gerekir kabul edilir. i) manyetik boncuk çözüm polimerlerin. Homojen manyetik boncuk çözüm yöntemi, arıtma ve adımları yıkama hem de boyunca kullanılmalıdır. Özellikle, proteaz deneyleri güvenilirliğini güçlü manyetik boncuk (SAMB) substrat iliştirilmiş stok çözümleri üzerinde düzgün aliquoting bağlıdır. Süspansiyon ve dağılım etkinliğini artırmak için bu boncuk konsantrasyonu % 2 ve % 10 (v/v) arasında ayarlamak için tavsiye edilir. Numune hazırlama, kullanım sırasında arabellek (Triton X-100 veya ara 20 gibi) Noniyonik deterjan ile ilâ takıma % 2'de plastik yüzeyler manyetik boncuklar bağlılığı düşebilir. Boncuk süspansiyonlar dikkatle yerine şişeleri örnek tüplerinin duvarlar üzerine dipleri uygulanır eğer boncuklar bağlılığı örnek şişeleri duvarlarının önlenebilir. Enzimatik reaksiyon sırasında manyetik boncuklar polimerlerin da kritik ve sürekli kuluçka sırasında örnekleri 600 devir / dakikada sallayarak sağlanmış olur. V-alt tüpleri kullanımı tavsiye edilmez ise boncuk düzgün yuvarlak veya düz oturaklı plastik mallar içinde dağılmış. Uygunsuz boncuk homojenizasyon tarafından neden olduğu bir suboptimal sonuçlar Şekil 4B' temsil edilir. II) tepki örnekleri sona ermesi.  Başka bir yöntem enzimatik reaksiyon ısıl denatürasyon veya herhangi bir potansiyel olarak müdahale kimyasal maddeler15kullanımı olmadan sonlandırılabilir avantajdır. Fesih geleneksel manyetik parçacık yoğunlaştırıcı kullanarak tepki karışım, manyetik boncuklar ayırarak yürütülen olabilir. Kaldırılan tepki arabellek etkin enzim ve oluşturulan C-terminal floresan bölünme ürünleri içerirken, uncleaved yüzeylerde boncuk için bağlı kalır. Etkin enzim reaksiyon arabellekte varlığı nedeniyle, ayrılık yordamı güvenilir bitiş noktası algılama için dikkatle yapılması gerekiyor. Örnek şişeleri yoğunlaştırıcı yerleştirmeden önce bu bir kısa spin Santrifüjü uygulamak için tavsiye edilir. Tüpler yoğunlaştırıcı koyduktan sonra en az 15 sağlamak için toplanacak boncuk s. Geri ve ileri ayırıcının solunda hafif hareket boncuk topluluğu kolaylaştırabilir. El ile gerçekleştirilen bir ayırma sırasında fesih genellikle tepkiler inisiyasyon daha fazla zaman alır, göz önünde bulundurun. Bu nedenle, aynı kuluçka süresi için tüm örneklerini uygulanması gerekiyorsa bir yaklaşık 2 dk kayıtlı gecikme arasında girişimlerine önerilir.
Açıklanan proteolitik tahlil nispeten basit bir kuraldır; Ancak, sistem çok yönlülük esnek ve sağlam alt yapısı tarafından garanti edilir. Testin bireysel optimizasyonu yalnızca tarafından benzeşme boncuk uyumluluk uygulanan koşullar, reaktifler ve katkı maddeleri ile sınırlı olabilir. Üreticinin protokolü ile anlaşma yüzeylerde Ni-NTA boncuk yüzeyler için benzeşme bağlama 6.515önemli ölçüde pH ≤ zayıflatır de bulduk. Bu nedenle, bu substrat boş örnekleri tepki örnekleri için paralel uygulamak için tavsiye edilir ve spontan substrat ayrılma oranını sonuçlarının değerlendirilmesi sırasında dikkate alınması gerekiyor.
Nerede manyetik boncuk-tabanlı deneyleri boncuk-uyumsuz bileşenleri veya düşük pH kullanımı nedeniyle gerçekleştirilemiyor, bu gibi durumlarda, çözüm hazım saflaştırılmış rekombinant yüzeylerde de uygulanabilir. Bu gibi durumlarda, reaksiyon karışımları Elektroforez tarafından analiz edilebilir ve proteinler açıklanan protokolüne dayanan jel içinde görüntülenir. Proteolitik aktivite araştırmak için çözüm sindirim ve jel algılama proteinlerin fluorimetry alternatif araçları de kullanabilirsiniz. Bir yenilik tasarlanmış substrat sisteminin SDS-sayfa denaturing sonra bir jel renaturation adım uygulamadır. Yerel (nondenatured) Floresan proteinlerinin Elektroforez sırasında onların floresans korumak iken, floresan özelliği denatürasyon (Şekil 7B) kaldırıldı. Ancak, floresans denatüre protein kısmen SDS kaldırılması jel tarafından elde edilebilir. Böylece, denaturing koşul kullanma tepki bileşenlerinin ayrılması sadece floresan tabanlı ama moleküler ağırlık-tabanlı kimlik sağlar. Başka bir Coomassie lekeli jel analizine göre floresan jel algılama (yerel ya da renatured) Floresan proteinler kolayca onların floresans dayalı jel olarak tanımlanabilir avantajdır (bkz. Şekil 7). Bu bölünme tepkiler nonfluorescent kirletici maddeleri içeren örneklerinde gerçekleştirilmesi durumunda veya yüksek moleküler ağırlıkları birbirine benzeyen proteinler önemli olabilir.
Proteaz deneyleri benzer şekilde tasarlanmış yüzeylerde kullanma-si olmak zaten be8,9,10, daha önce yayınlanan ve bu durumlarda ilgi bölünme sitesi da bir benzeşme etiketi arasında yer alan olmasına rağmen ve bir Floresan protein, sunulan tahlil sistemi burada sadece açıklanan fikirler tekrarlar ama önceki platformlar farklı avantajlarını birleştirir ve aynı zamanda onları daha fazla iyileştirmeler ile tamamlar: i) bir MBP füzyon ortak kullanımı II) Denetim bölünme bir TEV PR site III varlığı) yeni mühendislik monomeric FPs ve IV) benzersiz substrat kalibrasyon prosedürü uygulanması. Tahlil kendisi özellikle enzim özgüllük ve güvenli, pahalı araçları gerek kalmadan zaman ve maliyet-etkin şekilde kinetik çalışmalar için yararlı olacak şekilde tasarlanmıştır. Yönteminin uygun ve ekonomik araç her iki endüstriyel ve akademik araştırma amaçlı olması hedefleniyor. İfade plazmid ve 'klonlama kaset' esneklik nedeniyle sistem rekombinant substrat kütüphaneler hızlı ve ucuz üretimi için uygun olabilir. Burada açıklanan tahlil substrat özgüllüğü, enzim mutagenesis, uygulanması için uygun bir araçtır ve inhibisyon çalışmalar ve ayrıca, enzim kinetiği gerçekleştirmek için alternatif bir araç sağlar. Tahlil platformdan (kinetik parametrelerin belirlenmesi için bakteri hücre bozulması) HTS ve otomasyon dayalı bir ortama adapte edilebilir ve büyük olasılıkla, endüstriyel proteaz inhibitörü tarama ve/veya antiviral ilaç uygulanabilir geliştirme. Buna ek olarak, tahlil için rekabetçi proteolizis uyarlaması da gelecekte bizim laboratuvar kapsamıdır. Böyle rekabetçi bir tahlil, iki farklı yüzeylerde her içeren farklı bölünme site bir farklı C-terminal floresan etiket-aynı anda aynı bölünme tepki olarak okudu tercihi araştırmak için kullanılmak amacıyla are için erimiş verilen hedef sıralarının bir enzim. Ayrıca, bir 96-şey plaka adapte tahlil form (Şekil 8) kullanımını da mutasyonu tarama için değiştirilmiş bölünme sitesi serileri sistein proteaz durumunda ile yüzeylerde bir dizi kullanarak iyileştiriliyor.

Proteolitik enzimler metabolik yollar ve endüstriyel uygulamalar, de önemleri nedeniyle en yoğun olarak incelenen enzim grubuna da ait. Onların rol viral hastalıklarda, kan pıhtılaşma, kanser, düzenlenmesi ve kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalıklar uyuşturucu keşif alanında önemli hedefleri proteaz yapar. Bu nedenle, substrat özgüllüğü detaylı karakterizasyonu ve inhibitörü faiz proteaz (PR) profil oluşturma çok önemli ve tercihen hızlı, maliyet-etkin ve güçlü biyokimyasal deneyleri1,2tarafındangerçekleştirilir, 3.
Günümüzde, homojen, floresan peptid tabanlı ve yüksek işlem hacmi tarama (HTS) bileşik profil oluşturma için ilaç keşif alanında uygulanan tüp bebek proteaz deneyleri büyük çoğunluğu vardır-uyumlu platformlar4. Ayrıca, etiketli peptidler sadece Kütüphane tarama için uygun değildir, ama aynı zamanda seçilen yüzeyler üzerinde kinetik parametrelerin enzim tayini için harika araçlar sunuyoruz. Nereye belgili tanımlık substrate etiketleme mümkün değil, diğer durumlarda, ayrılık tabanlı deneyleri proteolitik reaksiyonlar3kinetik özelliklerini değerlendirmek için olası bir çözüm sağlayabilir.
Genel olarak, tüp bebek proteaz deneyleri substrat iki tür kullanımını temel alan: kısa peptidler veya tüm proteinler. Nerede bölünme kısa peptid sıralarının yeterince bölünme özelliklerini yansıtmak, bu gibi durumlarda, aşağıdaki standart yaklaşımları tabidir: (i) oksitlenmiş insülin B-zinciri, (ii) gibi standart protein yüzeylerde test İnceleme Kombinatorik Kimya veya (iv) tarafından oluşturulan sentetik ve fluorescently etiketli Peptid kitaplıklarının eleme piyasada bulunan yüzeyler diğer proteaz, (III), genetik yöntemler kullanarak, örneğin, biyolojik görüntüleme teknolojileri5, 6. Yanı sıra geleneksel sınıflandırma, roman diğer platformlar da substrat üretimi için kullanılabilir (örneğin, oluşumu Proteom kaynaklı peptid kütüphaneler7 veya özel alt türlerinden rekombinant füzyon gibi genetik Yöntemler protein bazlı yüzeylerde8,9,10,11,12).
Tüm yukarıda belirtilen substrat türleri ve deneyleri kendi avantaj ve sınırlamalar vardır ve birleştirme ve/veya bilinen platformları avantajları iyileştirilmesi tahlil biçimleri geliştirilmesi hala rağbet görmektedir. Burada bir protokol rekombinant yüzeylerde kullanır bir floresan proteaz ayrılık tabanlı tahlil için açıklamak. 6 ve TEV PR, C-terminal floresan protein (FP) (Şekil 1A) için doğrudan bağlı faiz substrat dizisi tarafından izlenen bir denetim bölünme siteye erimiş MBP Etiketler Bu füzyon proteinler oluşur. Bir DNA dizisi için ilgi bir bölünme sitesi 'klonlama kaset' kodlama klonlama bir tek tüp ligasyonu tepki içine daha önce restriksiyon tarafından Doğrusallaştırılmış hangi ifade plazmid tarafından gerçekleştirilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> Şekil 1: Floresan proteaz tahlil prensibi. (A) şematik temsili bir floresan substrat ve onun bölünme tarafından insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) proteaz gösterilir. Oku HIV-1 proteaz matris/kapsid bölünme sitesi dizisi içinde bölünme konumunu gösterir (VSQNY * PIVQ). (B) Floresan yüzeylerde enzim reaksiyonları manyetik boncuk-tabanlı Ni-NTA tahlil ve polyacrylamide Jel Elektroforez, de, iş akışı diyagramda gösterildiği gibi analiz etmek için kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Proteolitik deneyleri benzer Rekombinant protein yüzeylerde içeren-bir benzeşme etiketi, proteolitik bölünme site ve floresan protein-si olmak zaten kullanarak tarif edilmiştir, ancak8,9,10, sistem sunulan burada bütünleştirmek ve bu yöntemlerin avantajları geliştirmek niyetinde. Önemli bir fark olan füzyon protein yüzeylerde bu tahlil platform MBP protein çözünürlük13 geliştirmek ve TEV PRs için bir denetim bölünme sitede bulunması ile donatılmıştır. Ayrıca, yüzeylerde son derece istikrarlı ve substrat toplama önlemek için monomeric bir forma sahip yeni nesil floresan proteinleri içerir. Yanı sıra daha önce yayımlanmış uygulama formları14mTurquoise2 ve mApple erimiş işte ayrıca Sarı floresan protein (mEYFP) Floresan etiketi bir monomeric içeren rekombinant bir substrat tarafından verilen sonuçları gelişmiş göstermektedir. Bu vesile ile sistem uyumluluğunu floresan diğer proteinler ile göstermek ve proteaz tahlil tarafından elde edilebilir sonuçlar genel bazı türleri temsil eder.
Rekombinant füzyon protein E. coli BL21(DE3) hücrelerde ifade edilir ve yüzeyler tahlil bir nikel-nitrilotriacetic asit (Ni-NTA) için kullanılır-kaplı manyetik-özel-boncuk-ekli formu. C-terminal bölünme ürünleri içine süpernatant bölünme üzerine boncuk yüzeyinden faiz proteaz tarafından kurtulmuş olan. Ayrılması (enzim ve bölünme ürünleri içeren) Süpernatant sonra gelen manyetik boncuklar, floresans enzim bölünme özelliklerini belirlemek için ölçülebilir. Aksine önceden açıklanan yöntemleri, burada anlatılan sisteminde substrat ve C-terminal bölünme ürünleri miktarda benzersiz olarak bir detaylı substrat kalibrasyon prosedürü dayalı sayısal. Tahlil sistem bir SDS-sayfa analiz tahlil örnekleri tarafından desteklenebilir; bir sonraki floresan jel görselleştirme Elektroforez hemen sonra veya jel renaturation nondenatured ve denatüre floresan bileşenleri, sırasıyla14sonra uygulanabilir.
Esneklik ve 'klonlama kaset' yapısını dizileri yapı içine çeşitli zaman ve maliyet-etkin bir ekleme izin ve böylece, substrat kütüphanelerin üretimi teşvik etmektedir. Tüm tahlil adımları Otomasyon ve HTS uyumlu, olduğundan sistem Örneğin, proteaz özgüllük ölçümleri ve mutagenesis çalışmaları ya da aynı zamanda etkin bir şekilde endüstriyel proteaz inhibitörü tarama için kullanılmak için özellikle çekici olabilir ve/veya antiviral ilaç geliştirme, de.
Enzim kinetik parametrelerin (kkedi, Km) tarafından geliştirilen ayırma tabanlı tahlil belirlenebilir; Bu nedenle, o zaman tabii ki substrat-bağımlı ve inhibisyon çalışmaları gibi bireysel enzim kinetik ölçümleri gerçekleştirmek uygun olabilir. Bu rekombinant füzyon protein yüzeylerde iyi alternatifler için sık kullanılan sentetik chowing yüzeylerde sağlamak ve polyprotein yüzeylerde onların yüksek benzerliği nedeniyle, temsil ettikleri doğal olarak meydana gelen kanıtlıyor enzim-substrat etkileşimleri daha doğru.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10K Amicon tubes</td>
			<td style="width:269px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC501096</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">M6250</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;">1610148</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Acetic acid&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">100063</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Agarose</td>
			<td style="width:269px;">SERVA</td>
			<td style="width:137px;">11404.04</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Alpha Imager HP gel documentation system</td>
			<td style="width:269px;">ProteinSimple</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A3678</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A9518</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">392185</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Black half-area plates</td>
			<td style="width:269px;">Greiner bio-One</td>
			<td style="width:137px;">675086</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">B0126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">CutSmart buffer (10x)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7204S</td>
			<td style="width:191px;">For plasmid linearization (step 1.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:269px;">Clare Chemical Research</td>
			<td style="width:137px;">DR-45M</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">M0303L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dynamag-2&#160;magnetic particle&#160;concentrator</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12321D</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Escherichia coli BL21(DE3) competent cells&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">C600003</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethanol</td>
			<td style="width:269px;">Merc-Millipore</td>
			<td style="width:137px;">100983</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160; (EDTA)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">798681</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">B7024S</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycerol</td>
			<td style="width:269px;">Merck</td>
			<td style="width:137px;">356350</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Glycine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">G7126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">High-Speed Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:269px;">GeneAid</td>
			<td style="width:137px;">PD300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Imidazole</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">56750</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:137px;">AM9464</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Jouan CR 412 centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Jouan</td>
			<td style="width:137px;">CR412</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Labinco LD-76 Rotator&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Labinco</td>
			<td style="width:137px;">7600</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L3022</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Lysozyme&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">L6876</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:269px;">Scharlau</td>
			<td style="width:137px;">MA0036</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MERCK eurolab ultrasonic bath</td>
			<td style="width:269px;">MERCK</td>
			<td style="width:137px;">USR54H</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Millifuge Eppendorf spin centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">CT10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell</td>
			<td style="width:269px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T9281</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">NheI-HF restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R3131L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nickel(II) sulfate (NiSO4)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">656895</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Ni-NTA magnetic agarose beads&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">36113</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">OS-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PacI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:269px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">R0547L</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PageBlue Protein Staining Solution&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">24620</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P7626</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Protein Lobind Micro-centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">22431102</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:269px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Snijders Press-to-Mix shaker&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Gemini</td>
			<td style="width:137px;">34524</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-acetate trihydrate</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S7670</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-chloride</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S9888</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sodium-hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S5881</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:137px;">S7563</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:269px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M180A</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Thermo shaker</td>
			<td style="width:269px;">Biosan</td>
			<td style="width:137px;">TS-100</td>
			<td style="width:191px;">with SC-24 accessory block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tris</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T1503</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tween 20</td>
			<td style="width:269px;">Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">P2287</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter</td>
			<td style="width:269px;">Wallac Oy, Turku, Finland</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of recombinant fusion proteins in a fluorescent protease assay platform and their in-gel renaturation

Proteaz canlıların çeşitli biyolojik yollar ve patogenezinde önemli rolleri nedeniyle çalışılmış enzimlerdir; Bu nedenle, onlar önemli uyuşturucu hedefleridir. Rekombinant füzyon protein yüzeylerde kullan seçeneğine göre proteolitik aktivite incelenmesi için bir tahlil manyetik özel-boncuk-tabanlı platform geliştirdik. Bu tahlil sistem kullanımını göstermek için bir protokol 1 (HIV-1) proteaz tipi virüs, insan immün yetmezlik örneği sunulmaktadır. Proteaz, mutagenesis, kinetik, inhibisyon veya özgüllük çalışmaları, enzim aktivitesi ölçümleri gibi biyokimyasal karakterizasyonu tanıtılan tahlil platformu verimli bir şekilde kullanılabilir ve yüksek-üretim için uygun olabilir substrat tarama veya diğer proteolitik enzimler için adapte.
Bu tahlil sistemde virüs (TEV) ve HIV-1 proteaz ve C-terminal floresan protein bölünme siteler için tütün etch, N-terminal hexahistidine (onun6) ve maltoz bağlayıcı protein (MBP) Etiketler uygulanan yüzeylerde içerir. Yüzeylerde Escherichia coli hücrelerinde etkin bir şekilde üretilebilir ve nikel (Ni) - chelate - boyalı boncuk kullanarak kolayca saf. Tahlil sırasında fluorimetry tarafından ölçülebilir floresan bölünme parçaları sürümü boncuk bağlı yüzeylerde proteolitik bölünme yol açar. Ayrıca, bölünme reaksiyonlar Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) tarafından çözümlenebilir. Kısmi renaturation floresan Proteinlerin moleküler ağırlık ve floresan dayalı algılama sağlar gibi jel renaturation tahlil bileşenleri için bir iletişim kuralı da tanımlanmıştır.

Şekil 1A , belirli bölünme sitesi sıra HIV-1 PR tarafından işlenebilir bir temsilcisi floresan Rekombinant protein substrat şematik yapısı gösterilmektedir. Şekil 1B substrat üretim ve proteaz deneyleri, Ni-NTA manyetik boncuk-tabanlı tahlil ve/veya sayfa dahil olası uygulamaları temsil eder.
Fluorimetry tarafından güvenilir veri elde etmek için bir kalibrasyon prosedürü, floresan yüzeylerde ve bölünme ürünleri miktarlarını belirlemek için gereklidir. Bunun için floresans yoğunluk değerleri farklı tampon koşullarında farklı yüzeylerde, ölçülen gerekir ve onların konsantrasyonları (Şekil 3) bölümü konsantrasyon aralığındaki ilişkili olması gerekir. Eğim değerleri kalibrasyon eğrilerinin yüzeylerde ve tahlil örnekleri ürünlerinde bölünme miktarlarını belirlemek için uygulanır. Kalibrasyon eğrileri yamaçları yüzeylerde (Tablo 11) eklenen bölünme sitesi sıralarının bağımsızdır ve floresan protein aynı tür erimiş yüzeylerde bir dizi için kullanılabilir. Zum grafikler daha düşük konsantrasyon aralıkları de büyütmek için tüm doğrusal regresyon için (Şekil 3) gösterilir. Kalibrasyon veri noktalarının uygun bir dağıtım için güvenilir bir kalibrasyon gerekli olduğundan dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmamak gerekir. R2 değeri floresan protein konsantrasyonu ve floresan Eğer yeterli sayıda veri noktası arasında iyi bir korelasyon gösterir çünkü, bu nedenle, iki kat seri seyreltme örnekleri için kalibrasyon, hazırlamak için uygulanır tüm konsantrasyon aralığı kapsayacak şekilde kullanılmıştır. Ayrıca, deneysel hataları son derece kalibrasyon doğruluğunu etkileyebilir; Bu nedenle, regresyon çizgi grafik değerlendirilmesi de gerekli olabilir.
Enzimatik ölçümler çeşitli incelenmesi substrat konsantrasyonu reaksiyon hızı (Şekil 4A) üzerinde etkisi de dahil olmak üzere proteaz tahlil tarafından gerçekleştirilebilir. Doğrusal olmayan regresyon tarafından verileri enzim kinetik parametreleri (örneğin, vmax ve Km) belirlemek için kullanılabilir. Bir yetersiz boncuk süspansiyon ve dağılım ve bir yanlış tepki fesih güvenilir enzim kinetik değerleri hesaplamak için uygun değildir suboptimal sonuçlar (Şekil 4B) neden olabilir.
Bir bağımlılık zamanında ürün oluşumu tahlil (Şekil 5A) tarafından (örneğin, optimizasyon bölünme tepki parametrelerin sırasında) belirlenebilir. Enzim aktivite varlığında bir inhibitörü de olabilir (Şekil 5B) etkin enzim konsantrasyon ve inhibitör sabit belirlenmesi için soruşturma. Aynı yöntemi kullanarak, diğer inhibitörlerinin etkileri de tahlil tarafından ekranlı.
Proteaz tahlil pH enzim aktivite üzerindeki etkilerini araştıran yararlı olacaktır. Şekil 6A enzim aktivitesi bağımlılığını pH TEV PR, geniş optimum pH aralığı (pH 6-9) olan örneği tarafından temsil eder. Eğer pH bağımlılığı enzim aktivitesinin okudu (ya da ölçülecek enzimler Asidik pH en uygun olması gerekir), boncuk için rekombinant yüzeylerde benzeşme bağlama hafif Asidik pH sınırlı olabilir düşünün gereklidir. Boncuk (Şekil 6B) üzerinden yüzeylerde yükseltilmiş bir ayrılma bir bozulma tahlil sonuçlarının neden olabilir. Boncuk gelen spontan substrat ayrılma düşünün için tepki örnekleri için ölçülen değerleri bu B örnekleri göre düzeltilmesi gerekir.
Şekil 7 nondenatured floresan proteinler kendi renklerini, temel jel içinde farklılaşmış mavi ışık transillumination (7A rakam) kullanarak gösterir. Moleküler Ağırlık yüzeylerde/bölünme parçalarının belirlenmesi gerekli ise, floresan proteinler kısmen renatured jel içinde olabilir ve UV aydınlatma tarafından tespit edilebilir çünkü koşulları denaturing de numune hazırlama için kullanılabilir (Şekil 7B) veya Coomassie (Şekil 7C) boyama. R örnekleri analiz edilir, N-terminal bölünme parçaları ve uncleaved yüzeylerde boncuk için bağlı kalır görünür (Şekil 7C), sadece C-terminal bölünme ürünleri vardır. Zaman zaman, proteinler kısmen nondenaturing koşulları (Şekil 7C) kullanarak rağmen denatüre ve nondenatured proteinler daha bol olsa da, denatüre formları da örnek tespit vardır. Bu olay algılama proteolitik dekolte etkilemez ama nondenatured örnekleri nicel Dansitometresi durumunda dikkate alınması gerekiyor.
Ayrıntılı açıklama sadece bir 2 mL tüp dayalı tahlil için gösterilmiş olsa da, tahlil için hangi zaten başarıyla (gösterilmez) bizim laboratuvar test edilmiş bir 96-şey plaka-esaslı (Şekil 8), adapte edilebilir. 96-şey plaka uyarlanmış biçimi fluorimetric ve de, elektroforetik analizleri ile tam olarak uyumludur ve bu makalede açıklanan yöntemleri temel alan elde edilen veri ayrıca değerlendirilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> Şekil 3 : Kalibrasyon eğrileri. Temsilcisi substrat kalibrasyon eğrileri farklı C-terminal floresan Etiketler için erimiş iki rekombinant yüzeylerde örneği ile gösterdi: (A ve B) onun6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 ve (C ve D ) Onun6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Yakınlaştırma rakamları da 0-0.005 veri noktalarının doğrusal regresyon temsil etmek için gösterilen mM substrat konsantrasyonu aralığı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> Şekil 4 : Enzim kinetik parametrelerin belirlenmesi. Substrat-bağımlı kinetik ölçümleri HIV-1 PR tarafından gerçekleştirilen (41,2 son etkin yoğunluğuna, nM). İlk hız değerleri karşı substrat konsantrasyonu çizildi ve Michaelis-Menten doğrusal olmayan regresyon çözümlemesi gerçekleştirildi. Hata çubukları SD temsil (n = 2). (A) A temsilcisi en iyi sonucu onun6- MBP-VSQNY örnekle gösterildiği * PIVQ-mApple füzyon protein substrat. (B) A temsilcisi suboptimal sonucu da gösterdiği için onun6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 substrat, nerede uygun substrat konsantrasyonu ayarını SAMB hisse senedi çözüm yetersiz bir homojenizasyon nedeniyle sorunlu , süre nispeten yüksek hataları yanlış tepki fesih tarafından neden oldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> Şekil 5 : Zaman-ders ve inhibitör çalışma. (A) Onun 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP rekombinant füzyon protein substrat (0.00326 mM son bir konsantrasyon), HIV-1 PR tarafından i ciddi (41,2 son etkin yoğunluğuna, nM), ve belgili tanımlık serbest bırakmak, floresan PIVQ-mEYFP proteolitik parçacıkları için ölçüldü bir zaman ders çözümlemesi gerçekleştirin. Ölçümler beş farklı zaman noktadan gerçekleştirildi. Hata çubukları SD temsil (n = 2). (B) onun6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP substrat (0.0015 mM) de olarak amprenavir inhibitör etkisi HIV-1 PR etkinliği belirlemek için kullanılan (163.8 Toplam bir konsantrasyon, nM). Veri, yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC50) değerlendirildi komplo ve etkin enzim konsantrasyon tarafından (41,2 son etkin yoğunluğuna nM) uygulanan HIV-1 PR ayrıca inhibisyon eğri üzerinde temel alınarak hesaplanmasını. Hata çubukları SD temsil (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> Şekil 6 : Bağımlılık enzim aktivitesi ve spontan substrat ayrılma üzerinde doktora eğitimi (A)onun6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (içinde 0,033 mM) TEV PR enzim aktivitesini ölçmek için kullanılan (91.42 bir son toplam konsantrasyon, nM) içinde bölünme tampon farklı bir pH 6,5-8,5 Aralık için ayarlayın. Hata çubukları SD temsil (n = 2). Çizilen veri oldu daha önce14yayınlandı. (B) substrat boş örnekleri, onun spontan ayrılma göreli floresan yoğunluğu değerlerine göre6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (0,033 mM) manyetik boncuklar üzerinden okudu bölünme arabellek kullanarak farklı pH ile 6.0-8.5 arasında. Çizilen veri oldu daha önce14yayınlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> Şekil 7 : Protein jel içinde farklı yöntemlerle tespit. (A)Uncleaved ve HIV-1 PR sindirilmiş füzyon protein yüzeylerde nondenaturing numune hazırlama sonra SDS-sayfa sonra mavi ışık transillumination tarafından görüntülenmiştir. Bölünme tepki çözüm sindirim tarafından gerçekleştirildi. (B) sayfa hemen sonra sadece nondenatured proteinler tespit jel içinde iken SDS, çıkarıldıktan sonra UV aydınlatma tarafından daha önce denatüre floresan proteinler oldu kısmen renatured ve algılanabilir. Örnekleri Ni-NTA manyetik boncuk-tabanlı tahlil supernatants hazırlanmıştır. (C) Coomassie boyama da kullanılabilir jel renaturation sonra protein algılama için. SDS-günümüz jel-Mayıs ayında neden yerli protein kısmi denatürasyon, ancak yerel örnekleri, nondenatured formları daha boldur. Örnekleri Ni-NTA manyetik boncuk-tabanlı tahlil supernatants hazırlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> Şekil 8 : 96-şey plaka tabanlı uyarlaması tahlil platformu. (A) tahlil sadece 2 mL tüpler ama Wells bir 96-şey plaka, de yapılabilir. Burada hayali bir proteaz özgüllük vahşi-türü (wt) veya mutasyona uğramış (mut-1-mut-4) içerebilir floresan yüzeylerde bir dizi kullanarak eğitim tahlil uygulanması için şematik gösterim göstermek bölünme sitesi dizileri. Manyetik boncuk işleme için deneylerde kullanılmak üzere bir 96-şey uyumlu Manyetik parçacık yoğunlaştırıcı (MPC) olduğunu. Belirtilen birimlerin tümü için tek bir iyi ilişkilidir. Farklı yüzeylerde bölünme verimliliğini karşılaştırmak için substrat dönüşüm substrat-boş-düzeltilir RFU değerleri substrat-boş-düzeltilir RFU değerleri ilgili göz önüne alındığında tepki örnekleri arasında yüzde tespit edilebilir substrat kontrol örnekleri 100. (Fluorimetry, tahlil örnekleri de analiz sayfası ve floresan protein bileşenleri tarafından ayrılmış supernatants doğrudan veya jel renaturation nondenaturing ve denaturing örnek durumunda sonra analiz edilebilir sonraB) hazırlık, anılan sıraya göre. Üç farklı tahlil örnek türü de her şekilde gösterildiği: C yüzey kontrol, B = substrat boş ve R = reaksiyon =. Substrat kontrol örnekleri içinde belgili tanımlık substrate boş süre elüsyon tampon ve bölünme arabellekte tepki örnekleri vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Arabellek</td>
			<td>Floresan protein</td>
			<td>MF % pistlerinin (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elüsyon</td>
			<td rowspan="2">mTurquoise2</td>
			<td>6.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>Göğüs arası</td>
			<td>9,11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elüsyon</td>
			<td rowspan="2">mApple</td>
			<td>10.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Göğüs arası</td>
			<td>12.68</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 11: Varyans (CV %) değerleri pistlerinin substrat kalibrasyon eğrilerinin katsayısı. Rekombinant protein yüzeylerde floresans eklenen bölünme sitede bağımlı olup olmadığını sınamak için Kalibrasyonlar mApple ve mTurquoise2 erimiş yüzeylerde (farklı bölünme site içeren altı çeşitleri, her biri için bir dizi tarafından gerçekleştirilmiştir dizileri HIV-1 proteaz), elüsyon ve bölünme arabellekleri her ikisi de. Biz CV % değerleri pistlerinin altında bir tek substrat kalibrasyon aynı floresan etiketi içeren substrat türevleri tarafından gerçekleştirilen farklı ölçümlerin değerlendirilmesi için yararlı olabilir ima %15 her durumda bulunur.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation at JoVE.com

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Burada, N-terminal hexahistidine/maltoz-bağlayıcı protein ve nikel-nitrilotriacetic yüzeye bağlı floresan protein erimiş rekombinant yüzeylerde kullanan bir son zamanlarda geliştirilen proteaz tahlil platform ayrıntılı yordam mevcut asit manyetik özel boncuk. Bir sonraki jel analiz Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez tarafından ayrılmış tahlil örnekleri de sunulmaktadır.

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Protetezler, akademik ve endüstriyel araştırmalarda en çok araştırılan biyomoleküler destek gruplarından biridir. Çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerdeki güçlü rolleri onları uyuşturucu keşfi alanında da önemli bir hedef haline getirmektedir. Onların yoğun araştırma ile ilgili olarak, zaman ve maliyet tasarrufu yüksek iş bölümü tarama uyumlu floresan proteaz araştırma platformlarının geliştirilmesi için büyük ve sürekli bir talep vardır.Burada, hem mTurquoise2 hem de mApple-erimiş rekombinant füzyon proteaz yüzeyleri kullanarak ayırma tabanlı yüksek iş letme tarama uyumlu floresan test platformunun uygulanması için bir protokol sunmak istiyoruz. Ayrıca, SDS-PAGE'i denadikten sonra substratların jel içi renatürasyonu ve test örneklerinin dekolte parçaları için bir yöntem göstermek istiyoruz. Tüm deneyler HIV-1 virüs proteaz örneği üzerinde yapılır.Plazmid ifadesi, heksa histedin afinite etiketi ve maltoz bağlayıcı füzyon proteininin kodlama sırasını ve ardından tütün etch virüs proteazı, klonlama kaseti ve C-terminal floresan proteinini kontrol eder. PacI ve NheI restriksiyon endonükleazları ile plazmid ifadesini doğrusallaştırın. Escherichia coli codon optimize ileri ve ters oligonükleotid astarlar bu ilgi ve pakt PacI ve NheI uyumlu biter tarafından alt tabaka dizisi için kod annealing gerçekleştirin.Ligasyon ile doğrusallaştırılmış ekspresyon plazmidiçine annealize astar ların eklenmesini gerçekleştirin. Protein ekspresyonu için BL21(DE3) çözünür hücreleri ligasyon karışımıile dönüştürün. Floresan proteinler n-terminal füzyon etiketleri ile aynı açık okuma çerçevesi içinde olacak sadece başarılı bir ligasyon sonra.Dönüşümden birkaç gün sonra, eklenen dekolte alanını kodlayan plazmid ifadesini içeren koloniler, Lacivert Transilluminator ile hatta görünür floresan gösterecektir. BL21 (DE3) hücrelerinin 10 mikrolitre gliserol stok ekleyin 50 mililitre centrifuge tüp mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren beş mililitre LB orta ilgi bölünme site dizisi için ifade plazmid kodlama taşıyan. Sürekli sallayarak 15 saat boyunca 37 derece süspansiyon kuluçka.Mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren 50 mililitre taze LB ortamına beş mililitre bakteri kültürü aktarın. Hücreleri 37 derecede, 600 nanometre dalga boyunda 0,6 ila 0,8'lik bir absorbansa kadar büyütün. Bu noktada, IPTG ilavesi ile protein ekspresyonunu indükleyin.Bundan sonra, sürekli sallayarak 37 derece üç saat boyunca kültür kuluçka. Kuluçkadan sonra, kültürün 25 mililitresini temiz 50 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın ve hücreleri santrifüj le hasat edin. Supernatant atın ve en az bir saat için eksi 70 derece bakteri hücre pelet saklayın.Başarılı bir şekilde ifade edilen floresan proteinleri içeren hücre peletleri, Koyu Okuyucu mavi transilluminator kullanmadan bile floresan olduğunu açıkça gösterir. Buz üzerinde dondurulmuş hücre pelet yerleştirin ve 15 dakika boyunca çözülmeye bırakın. Pelet iki mililitre lysis tampon ekleyin ve hücreleri askıya.Bundan sonra, proteaz inhibitörü ekleyin, lyzozyme ve DNase ile süspansiyon ücretsiz, hücreleri askıya, ve 15 dakika boyunca buz üzerinde süspansiyon kuluçka. 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleriçine iki kez bir mililitre süspansiyon aktarın ve sonication 10 saniye ve beş saniye mola turlarında üç dakika boyunca süspansiyonlar sonicate. Tüpleri 10,000 g'de oda sıcaklığında 20 dakika santrifüj edin.Floresan substrat içeren temizlenmiş bakteri hücresi lizatesi, Koyu Okuyucu mavi transilluminator ile hatta görünür floresan gösterir. Geliştirilen proteaz test prosedürü, test numunelerinin hazırlanması ile başlar. İlk olarak, rekombinant substratlar yakınlık manyetik boncuklar ile kuluçkaya yatırılır ve samb solarak kısaltılmış substrat bağlı manyetik boncuklar oluşur.SAMB'ler birkaç kez yıkanır ve son olarak SAMB stok çözeltisi, test numunelerinin oluşturulduğu aliquoting tarafından hazırlanır. Reaksiyonlar proteaz çözeltisinin eklenmesiyle başlatEdilir. Proteaz tarafından dekolte üzerine, proteolitik parçalar supernatant içine serbest bırakılır.Reaksiyon, manyetik boncukların floresan dekolte ürünleri ve enzim içeren reaksiyon tamponundan ayrılması yla sonlandırılır. Süpernatanlar mikrotiter plakanın kuyularına uygulanır ve floresan florimetri ile belirlenir. Kalibrasyon eğrileri, her bir ispat arabelleklerinde çözülmüş saflaştırılmış floresan yüzeyler kullanılarak oluşturulur.C-terminal floresan dekolte ürünlerinin ve ayrıca test numunelerinde uygulanan substratın konsantrasyonu kalibrasyon eğrilerinin eğimine göre belirlenir. Yeni veya geri dönüştürülmüş nikel-NPA manyetik agarose boncukiçeren tüpü manyetik parçacık konsantratörüne yerleştirin. Boncuklar duvara ve/veya mikrosantrifüj tüpünün kapağına yapışabilir.Bu nedenle, tüm boncuklar toplanır emin olmak için her yönde konsantratörü ters çevirin. Supernatant çıkarın ve atın. Boncuklara 1,8 mililitre likis tampon u ekleyin ve kapalı tüpleri konsantratörüçıkarın.Boncuklar tamamen homojen olana kadar tüpü sallayarak ve/veya ters çevirerek tüpteki boncukları askıya alın. Tüpleri konsantratörün içine geri yerleştirin ve tüm boncukların toplandıklarından emin olmak için her yöne ters çevirin. Tüpü açın ve supernatant atın.İlgi nin alt tabakasını içeren temizlenmiş bakteri-steril lysate ekleyin ve kapalı tüpü konsantratörden çıkarın. Boncuklar tamamen homojen olana kadar tüpleri ters çevirin ve tüpleri 30 dakika oda sıcaklığında yavaşça rotator ile döndürün. SAMB'ler, Koyu Okuyucu mavi transilluminator ile görünür floresan gösterir.SAMB'leri üç kez 1,8 mililitre 1%20, yıkama tamponu ve dekolte tamponu ile yıkayın. SamB stok çözümü oluşturmak için yıkanmış SAMB'lere dekolte arabelleği ekleyin. İki mililitrelik protein-düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpler ikullanıyorsanız, uygulanan dekolte tamponhacmi kadar 1.9 mililitre.Tampon ilaveden sonra tüpü ters yüz etmeyin veya ters çevirmeyin. Tüpü kapatın ve konsantratöründen çıkarın. Test numuneleri için iki mililitrelik protein-düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın.TAMAMEN homojen olana kadar SAMB stok çözeltisini askıya alın ve SAMB stok çözeltisini numune şişelerine hemen aktararak reaksiyonlarda analiz edilecek substrat miktarını ölçün. Aktarılacak SAMB stok çözeltisinin hacminin 25 ila 300 mikrolitre olması tavsiye edilir, ancak bireysel deneysel tasarıma göre ayarlanmalıdır. Aliquoted SAMB süspansiyonları içeren örnek tüpleri konsantratöre yerleştirin.Supernatant'ı SAMB'lerden dikkatlice çıkarın ve atın. Tüpleri konsantratörü çıkarın ve sambs için reaksiyon tampon dikkatle ekleyin. Eklenen reaksiyon tamponhacmi bireysel deneysel tasarıma göre hesaplanacak, ancak iki mililitrelik tüpler kullanılırsa 50 ve 150 mikrolitre arasında reaksiyon karışımıson hacmi ayarlamak için tavsiye edilir.Tüplerin kapaklarını kapatın. Şimdi, örnekler baş harfe batılmaya hazır. Reaksiyon örneklerine enzim çözeltisi ekleyin.Tüpleri hafifçe hareket ettirerek boncukları dikkatlice karıştırın ve tüpleri hemen sallayarak zaten sallanan termshaker'a yerleştirin. Substrat boş örnekleri ve substrat kontrol örnekleri durumunda, sırasıyla dekolte tampon ve elüsyon tampon ekleyin. Kuluçka süresinin bitiminden 30 saniye önce, numuneyi termoshaker'dan alın ve hemen döndürün.Tüpü konsantratörün üzerine yerleştirin ve tüpün 15 saniye bekletin. SAMB'lerin toplanması, konsantratörü nitrecinin ileri geri hafifçe hareket ettirilmesiyle kolaylaştırılabilir. Kapağı açın ve supernatant dikkatle bir tabak veya yeni bir tüp içine aktarın.Konsantre boncuklar pipetin ucuna dokunmayın. Substrat kontrol örneklerinin toplanmış süpernatantı ve yüksek derecede dekolteye sahip reaksiyon örnekleri, Koyu Okuyucu mavi transilluminator ile veya hatta olmadan görünür floresan gösterebilir. Ayrılmış numune süpernatantlarının iki katı 30 mikrolitresini siyah yarım alanmikroplakasına aktarın.Uygulanan floresan proteine göre uygun filtreleri kullanarak floresanölçer ile ölçün. Floresan yüzeylerin arınması için, daha önce açıklandığı gibi aynı çözümü hazırlayın ve supernatant atın. SAMB'lere 400 ila 600 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve tüpleri oda sıcaklığında beş dakika döndürülerek yavaşça döndürün.Eluat yeni protein-düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpler içine transfer. Koyu Okuyucu mavi transilluminator ile veya kullanmadan açıkça görülebilir floresan gösterir. Arınma, tampon değişimi ve protein içeriğinin ölçümünden sonra, seyreltme için sırasıyla elüsyon veya dekolte tamponu kullanarak, hem elüsasyon-tampon-hem de dekolte-tampon-çözülmüş substrat çözeltilerinden olmak üzere en az sekiz adımda iki aşamalı seri seyreltme hazırlayın.Her seyreltme noktasının 30 mikrolitresini siyah bir yarım alan mikroplakasına aktarın. Test numunesi süpernatantlarının ölçümünde uygulanan ayarları kullanarak floresanölçerile ölçün. Veri işlemeye örnek olarak, HIV-1 proteazın substrat bağımlı kinetik ölçümleri, doğal boşluklu protein öncülündeki dekolte ve kapsid proteinleri arasındaki dekolte bölgesini kodlayan rekombinant substratın mTurquoise2-erimiş formunda gerçekleştirildi.Düzeltilmiş göreli floresan yoğunluk değerlerini saflaştırılmış yüzeylerin molar konsantrasyonuna göre çizin, bölünme veya elüsiyon tamponunu çözün ve doğrusal regresyon gerçekleştirin. Dekolte-tampon tabanlı kalibrasyon eğrisinin eğimini kullanarak reaksiyon numunelerinde C-terminal dekolte ürünlerinin molar konsantrasyonu hesaplayın. Ayrıca, elütion-tampon esaslı kalibrasyon eğrisinin eğimini kullanarak substrat kontrol numunelerinde eluted substrat molar konsantrasyonu dayalı reaksiyon örneklerinde uygulanan substrat konsantrasyonu hesaplamak.İlk hız değerleri C-terminal bölünme parçalarının miktarından hesaplandı ktan sonra uygulanan substrat konsantrasyonuna karşı çizildi. Ayrıca kinetik parametreler Michaelis-Menten doğrusal olmayan regresyon analizi ile belirlendi. Nikel-NTA manyetik boncuk bazlı test yaptıktan sonra, test süpernatantları poliakrilamid jel elektroforez ilerler.Ancak, tahlil numunelerinin analizinin yanı sıra, çözelti içi sindirim sonrası saflaştırılmış floresan yüzeyleri ve/veya dekolte parçalarını analiz etmek de mümkündür. Çözelti içi sindirim için, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleriçine dekolte tamponunda çözünmüş olarak sindirilecek saflaştırılmış floresan yüzeyleri aliquote ve numunelere enzim çözeltisi ekleyin. Numuneleri deneysel tasarıma göre kuluçkaya yatırın ve PAGE için numune hazırlama prosedürü ile reaksiyonları sonlandırın.Nondenatured numune hazırlama için, hiçbir indirgeyici maddeler içeren nondenaturing numune yükleme tamponu ile analiz edilecek numuneleri karıştırın. Denatüre numune hazırlama durumunda, analiz edilecek numuneleri numune yükleme tamponu ile karıştırın ve numuneleri 10 dakika boyunca 95 derecede ısıl işlem le tarar. Denatüre olmayan ve denatüre edilmiş numuneleri SDS-poliakrilamid jelin kuyularına uygulayın ve elektroforez uygulayın.Jel kaseti çalışan modülden çıkarın. Denatüre olmayan örnekler jelde çıplak gözle veya Lacivert Transilluminator ile bile görülebilir. Transilluminator üzerinde denatüre numunelerin floresan bileşenlerini tespit etmek için, Jel'den SDS'yi yıkayarak jel içi renatürasyonu gerçekleştirin.Jel için 100 mililitre distile su ekleyin ve en az 30 dakika durulayın. Lekesiz jeli Lacivert Transilluminator'a yerleştirerek floresan proteinleri görselleştirin. Rekombinant floresan füzyon proteinleri proteolitik tahlillerde substrat olarak kullanılmak üzere tasarlandı.Spesifik dekolte yerindeki proteaz ile bölünme üzerine C-terminal floresan dekolte parçası serbest bırakılır ve floresan saptanır. Nikel-NTA manyetik boncuk bazlı tahlil ve PAGE analizi ile floresan tespiti kullanımı HIV-1 proteaz kullanılarak optimize edilmiştir. Ancak, gelişmiş asay platformu diğer proteteses için de uygun olabilir.Dekolte veya elüsyon tamponu nda çözülen saflaştırılmış substratların kalibrasyon eğrileri, doğal HIV anekoik proteininin kapsid proteinleri ile matriks arasındaki dekolte tarafını kodlayan rekombinant substratların hem mTurquoise2 hem de mEYFP-erimiş formu örneklerinde gösterilmiştir. Nikel-NTA manyetik boncuk bazlı test, substrat konsantrasyonunun reaksiyon hızı üzerindeki etkisini incelemek için yararlı bir araçtır ve bu nedenle Vmax ve Km gibi enzim kinetik parametrelerinin belirlenmesini mümkün kılar. Diyagram A, mApple'da erimiş bir substrat üzerinde substrata bağımlı etkinliğin başarıyla gerçekleştirildiği analizden sonra elde edilen en uygun sonucu gösterir.Buna karşılık, B diyagramı, SAMB stok çözeltisinin yetersiz homojenizasyonunun uygun substrat konsantrasyonlarının ayarlanmasında sorunlara yol açtığı, reaksiyon örneklerinin yanlış sonlandırılmasının ise nispeten yüksek hatalara yol açtığı bir alt-optimal sonuç sunar. Teşp aynı zamanda zaman-ders ve inhibitör çalışmalar yapmak için de uygun bir araç sağlar. Diyagram A, HIV-1 proteolitik dekoltesinin mEYFP-erimiş substrat üzerindeki zaman adabının zamana bağımlılığını gösterirken, B diyagramı amprenavir'in dekolte reaksiyonu üzerindeki inhibitör etkisini temsil eder.İnhibitör çalışması ile elde edilen verilerden hem aktif enzim konsantrasyonu hem de inhibitör sabiti belirlenebilir. Tütün etch virüs proteaz örneğinde diyagram A ile temsil edildiği gibi, tsay da pH enzim aktivitesinin bağımlılığı nı incelemek için optimize edilebilir. Diyagram B, pH ile yapılan bir töz sınırlamasını gösterir ve nötr veya hafif alkali pH'ın ölçümlerle tam uyumlu olduğunu gösterirken, asidik pH manyetik boncukların yüzeyinden substratların spontan ayrıştırılmasını kolaylaştırır.Bu rakam saflaşmış bozulmamış floresan yüzeyleri gösterir, floresan C-terminal bölünme parçaları, HIV-1 proteaz tarafından çözelti içinde sindirim tarafından oluşturulan. Floresan komponentler, numune hazırlama sırasında denatüre olmayan koşullar uygulandığı takdirde elektroforezden hemen sonra mavi ışık transillumination ile SDS içeren poliakrilamid jelde tespit edilebilir. Farklı floresan proteinler renklerine göre ayırt edilebilir.Manyetik boncuk bazlı testten sonra, örnek süpernatantlarda denatüre olmayan floresan proteinler uv aydınlatma sı tarafından jel de tespit edilebilir. Buna karşılık, numune hazırlama sırasında denatüre koşulları uygulanırsa, denatüre proteinler SDS PAGE'den hemen sonra jelde tespit edilemez. Ancak, denatüre floresan proteinler kısmen jel SDS kaldırılması ile renatured olabilir ve tespit edilebilir hale.Bu nedenle, SDS PAGE in-gel renaturation prosedürü tarafından takip edilir. Floresan proteinlerin renatürasyon yeteneği, sadece floresanlarına değil, aynı zamanda moleküler ağırlıklarına da bağlı olarak tanımlanmasını mümkün kılar. Burada, yakın zamanda geliştirilen manyetik boncuk bazlı floresan proteaz test platformunun kullanımına yönelik protokolü gösterdik.Bu sistemin HIV-1 proteaz enzim kinetik çalışmaları örneğinde kullanıldığını gösterdik. Biz proteaz dekolte site dizisi içeren rekombinant test substrat, mTurquoise ve mApple-erimiş formları kullanılır. Florimetrik analizin yanı sıra tahlil örnekleri daha sonra SDS PAGE tarafından da analiz edildi.Denatüre floresan proteinlerin, substrat ve proteolitik parçaların hem floresan hem de molekül ağırlıklı olarak tanımlanmasını sağlayan SDS PAGE'den sonra jelde kısmen yenilenebilen bir protein olduğunu gösterdik.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Nasıl Photoactivated floresan proteinler toplu olarak ve canlı hücrelerdeki kısmını ölçmek için

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Floresan Sumo-bindirme proteinleri kullanarak SUMO-modifiye proteinlerin lokalizasyonu

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Floresan Problar ve Lignin Bitki Kesitlerinde Doğal Otofloresan Dayalı SFLIM Ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyon ile Hücresel Proteinlerin Karakterizasyonu

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Hareketli XY Stage ile Platform İnkübatörü: Proteinlerin Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonunu Uygulamak İçin Yeni Bir Platform

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...