Name: mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת Yeditepe. כל הנתונים ודמויות להשתמש במאמר זה היו שפורסמו בעבר34.

בכתב הסכמה מדעת של המטופלים היה המתקבלים לאחר האישור ועדת אתיקה מוסדית.
1. DPSC בידוד ותרבות
<ol><li>להעביר את שיני הבינה המתקבל צעירים בגילאי 17 עד 20-15 מ"ל צינורות המכיל של Dulbecco מלאה ששינה נשר בינוני (DMEM) [נמוך הגלוקוז DMEM מדיה, בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין / ...

<ol>
	<li>Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Demirci, S., Do&#287;an, A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dental Stem Cells. , 109-124 (2016).</li><li>Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+into+the+understanding+of+mesenchymal+stem+cell+trafficking.">Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking.</a> British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).</li><li>Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mesenchymal+stem+cells+in+cancer+progression+and+metastases.">Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases.</a> Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).</li><li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors:+wounds+that+do+not+heal.">Tumors: wounds that do not heal.</a> New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).</li><li>Lu, Y. -. r., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+inhibitory+effect+of+mesenchymal+stem+cells+on+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo.</a> Cancer biology &amp; therapy. 7 (2), 245-251 (2008).</li><li>Secchiero, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+display+anti-cancer+activity+in+SCID+mice+bearing+disseminated+non-Hodgkin's+lymphoma+xenografts.">Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts.</a> PloS one. 5 (6), e11140 (2010).</li><li>Hong, I. -. S., Lee, H. -. Y., Kang, K. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+and+cancer:+friends+or+enemies?.">Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies?.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).</li><li>Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Mesenchymal+Stem+Cells+(MSCs)+at+sites+of+human+prostate+cancer.">Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer.</a> Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).</li><li>Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+dissecting+a+discrepancy+in+the+literature:+do+mesenchymal+stem+cells+support+or+suppress+tumor+growth.">Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth.</a> Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).</li><li>Albini, A., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+microenvironment+as+a+target+for+chemoprevention.">The tumour microenvironment as a target for chemoprevention.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth.">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).</li><li>Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+human+dental+pulp+stem+cells+(DPSCs)+in+vitro+and+in+vivo.">Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).</li><li>Mori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+pulp+stem+cells:+osteogenic+differentiation+and+gene+expression.">Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression.</a> Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).</li><li>Mori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells.">Osteogenic properties of human dental pulp stem cells.</a> Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).</li><li>Kerkis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+population+of+immature+dental+pulp+stem+cells+expressing+OCT-4+and+other+embryonic+stem+cell+markers.">Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers.</a> Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).</li><li>Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dental+pulp+stem+cells:+applications+in+future+regenerative+medicine.">Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine.</a> World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).</li><li>Ahmed, N. E. -. M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+dental+pulp+stem+cell+secretome+for+Alzheimer's+disease+treatment:+an+in+vitro+study.">Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study.</a> Stem cells international. 2016, (2016).</li><li>Gorin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+dental+pulp+stem+cells+with+fibroblast+growth+factor-2+increases+angiogenesis+of+implanted+tissue-engineered+constructs+through+hepatocyte+growth+factor+and+vascular+endothelial+growth+factor+secretion.">Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion.</a> Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).</li><li>Wakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+secreted+from+dental+pulp+stem+cells+show+multifaceted+benefits+for+treating+acute+lung+injury+in+mice.">Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice.</a> Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).</li><li>Do&#287;an, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+stem+cells+is+promoted+by+amphiphilic+pluronic+block+copolymers.">Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).</li><li>Ta&#351;l&#305;, P. N., Do&#287;an, A., Demirci, S., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boron+enhances+odontogenic+and+osteogenic+differentiation+of+human+tooth+germ+stem+cells+(hTGSCs)+in+vitro.">Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro.</a> Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).</li><li>Yalvac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+stem+cells+derived+from+human+third+molar+tooth+germs+of+young+adults:+implications+in+neo-vascularization,+osteo-,+adipo-and+neurogenesis.">Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis.</a> The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).</li><li>Do&#287;an, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+pentaborate+pentahydrate+and+pluronic+containing+hydrogel+increases+cutaneous+wound+healing+in+vitro+and+in+vivo.">Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo.</a> Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).</li><li>Do&#287;an, A., Yalva&#231;, M. E., Y&#305;lmaz, A., Rizvanov, A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+F68+on+cryopreservation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+tooth+germ.">Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ.</a> Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).</li><li>Rizvanov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+and+self-organization+of+human+mesenchymal+stem+cells+and+neuro-blastoma+SH-SY5Y+cells+under+co-culture+conditions:+A+novel+system+for+modeling+cancer+cell+micro-environment.">Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).</li><li>Troiano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+cells+with+different+mitochondrial+membrane+potential+during+apoptosis+by+polychromatic+flow+cytometry.">Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry.</a> Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).</li><li>Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+niche+models+and+contribution+by+mesenchymal+stroma/stem+cells.">Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells.</a> Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).</li><li>Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cell/mesenchymal+stem+cell+interaction+in+co-culture+and+its+implications+in+angiogenesis.">Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis.</a> Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomimetics and Stem Cells. , 29-36 (2013).</li><li>Plotnikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture.">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Brunetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+TRAIL+by+osteoblastic+differentiated+dental+pulp+stem+cells+affects+myeloma+cell+viability.">High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability.</a> Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).</li><li>Do&#287;an, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+pulp+stem+cells+(DPSCs)+increase+prostate+cancer+cell+proliferation+and+migration+under+in+vitro+conditions.">Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions.</a> Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).</li></ol>

התרומה של MSCs לסביבת הגידול מוסדר על ידי אינטראקציות מספר כולל היברידית תא דור דרך התא fusions, entosis או ציטוקינים ופעילויות כימוקין בין תאי גזע תאים סרטן28. מבנה הארגון, תא-תא אינטראקציות וגורמים המופרש לקבוע בהתנהגות התא סרטן מבחינת קידום הגידול, התקדמות, גרורות לרקמות. נאות <e...

גזע mesenchymal (MSCs), עם היכולת של בידול ותרומה רגנרציה של רקמות mesenchymal כגון עצמות, סחוס, שריר, רצועה, גיד שומן, היה מבודד כמעט לכל רקמות הגוף למבוגרים1 , 2. מלבד מתן הומאוסטזיס רקמות על ידי ייצור תאים תושב במקרה של דלקת כרונית או פציעה, הם לייצר ציטוקינים חיוני, גורמי גדילה שננהל אנגיוגנזה, המערכת החיסונית, רקמות שיפוץ3. האינטראקציה של MSCs עם סרטן רקמות לא מובנות, אך ראיות המצטבר מרמז כי MSCs עשוי לקדם את החניכה, התקדמות, גרורות הגידול4.
יכולת ביות של MSCs האזור הפצוע או דלקתי כרוני גורם להם מועמד בעל ערך עבור טיפולים מבוססי תאי גזע. עם זאת, סרטן רקמות, "מעולם לא ריפוי הפצעים", שחרר גם ציטוקינים דלקתיים מולקולות פרו-אנגיוגנזה, גורמי גדילה חיוני, אשר מושכים MSCs אזור cancerogenous5. יש אמנם מוגבל דוחות מציג מעכבות ההשפעות של MSCs על סרטן הצמיחה6,7, שלהם התקדמות סרטן, גרורות קידום אפקטים כבר נרחב דיווח8. MSCs במישרין או בעקיפין להשפיע carcinogenesis בדרכים שונות, כולל דיכוי תאים חיסוניים, מפריש גורמי גדילה/ציטוקינים התומכים התפשטות תאים סרטן של הגירה, שיפור פעילות האנגיוגנזה, וויסות 9,mesenchymal-אפיתל המעבר (החובשים)10. סביבת הגידול מורכב של מספר סוגי תאים כולל סרטן הקשורים fibroblasts (CAFs) ו/או myofibroblasts, תאי אנדותל, adipocytes של תאים חיסוניים11. מאלה, CAFs הם סוג התא הנפוץ ביותר באזור הגידול להפריש נוגדנים שונים לקידום וצמיחה של גרורות סרטן8. הוכח כי MSCs הנגזרות מח עצם יכולים להתמיין CAFs משתית הגידול12.
תאי גזע זולה שיניים (DPSCs), המאופיינת כמו MSCs הראשון נגזר רקמות שיניים. Gronthos et al. 13 בשנת 2000 ואז נרחב נחקר על-ידי אחרים14,15, אקספרס סמנים pluripotency כגון Oct4, Sox2ו- Nanog16 , יכולים להתמיין תא שונים linages17. ניתוח ביטוי גנים וחלבונים הוכיח כי DPSCs לייצר רמות דומות של גורמי גדילה/ציטוקינים עם אחרים MSCs כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF), angiogenin, פיברובלסט גורם גידול 2 (FGF2), אינטרלויקין-4 (IL-4), IL-6, IL-10, תא גזע פקטור (SCF), כמו גם fms דמוי טירוזין קינאז-3 ליגנד (Flt - 3L) זה עשוי לקדם אנגיוגנזה, לווסת את תאי המערכת החיסונית ולתמוך סרטן התא התפשטות והעברה18,19,20 . בעוד האינטראקציות של MSCs לסביבת סרטן כבר מתועד בספרות, היחס בין DPSCs, תאים סרטניים לא הוערך עדיין. במחקר הנוכחי, הקמנו תרבות משותפת, מצב בינוני טיפול אסטרטגיות עבור קו תא סרטן הערמונית גרורתי מאוד, PC-3 ו- DPSCs להציע פוטנציאל הפעולה של המנגנון של MSCs שיניים התקדמות סרטן, גרורות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11885084</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745E</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>For cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10010023</td>
			<td>For washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Component of differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Component of osteogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS &#8722;G)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Component of chondrogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SRP3171</td>
			<td>Component of chondrogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Component of adipogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7018</td>
			<td>Component of adipogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Component of adipogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>Cell viability analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL Assay</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td>Apoptotic analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3396</td>
			<td>For trans-well migration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PKH67GL</td>
			<td>For co-culture cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td>For co-culture cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>For cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Kossa Kit</td>
			<td>BioOptica</td>
			<td>04-170801.A</td>
			<td>For cell staining (differentiation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2899</td>
			<td>For cell staining (differentiation)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions

סרטן כמו תהליך רב-שלבי המחלה מורכב לא רק מוסדר על ידי התפשטות תאים בודדים וצמיחה אלא גם נשלט על ידי אינטראקציות וסביבה תא-תא הגידול. זיהוי של סרטן ואינטראקציות תאי גזע, לרבות שינויים בסביבה חוץ-תאית, האינטראקציות פיזי וגורמים מופרשים, עשוי לאפשר הגילוי של אפשרויות טיפול חדשות. אנו משלבים תרבות משותפת מוכרת טכניקות ליצירת מערכת מודל עבור גזע mesenchymal (MSCs) וסרטן תא אינטראקציות. במחקר הנוכחי, תאי גזע זולה שיניים (DPSCs) ואינטראקציות התא סרטן הערמונית PC-3 נבדקו על-ידי טכניקות תרבות שיתוף ישיר ועקיף. מצב בינוני (ס מ) המתקבל DPSCs, 0.4 מיקרומטר נקבוביות בגודל הטרנס-ובכן ממברנות שימשו כדי ללמוד paracrine פעילות. תרבות משותפת של סוגי התאים יחד בוצעה ללמוד אינטראקציה ישירה תאים תאים. התוצאות חשף כי ס מ גדל התפשטות תאים, ירד אפופטוזיס תרביות תאים סרטן הערמונית. ס מ ומערכת הטרנס-ובכן גדל תא קיבולת העברה של PC-3 תאים. תאים צבעונית עם צבעי ממברנה שונים היו נזרע לתוך תרבות אותם כלי-דם, והשתתף DPSCs מבנה מאורגן עצמית עם PC-3 תאים תחת תנאי זה תרבות שיתוף ישיר. בסך הכל, התוצאות הראו, כי שיטות חקלאות משותף יכול להיות שימושי עבור סרטן ואינטראקציות MSC כמערכת מודל.

איור 1 מציג MSC מאפייניה של DPSCs בתנאים תרבות. DPSCs מפעילים תאי פיברובלסט דמוי מורפולוגיה לאחר ציפוי (איור 1B). MSC אנטיגנים פני השטח (CD29, CD73, CD90, CD105 ו CD166) מבוטאים מאוד בזמן סמנים hematopoietic (CD34, CD45 ו CD14) הם שליליים (איור 1C). שינויים ברמה המ...

Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions at JoVE.com

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

אנו מספקים פרוטוקולים להערכה של גזע mesenchymal מבודד מן עיסת שיניים ואינטראקציות התא סרטן הערמונית המבוסס על שיטות תרבות שיתוף ישיר ועקיף. מצב בינוני וממברנות הטרנס-ובכן מתאימים לניתוח פעילות paracrine עקיף. זריעה באופן שונה מוכתמת. בתאים ביחד הוא מודל המתאים לאינטראקציה תא ישירה-cell.

בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע על תפקידם של תאי גזע בוגרים בוויסות התנהגות תאים סרטניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה של אינטראקציות תאים סרטניים ותאי גזע במבחנה ללא שימוש באורגניזמים חיים. טכניקה זו יש פוטנציאל גרורות סרטן כפי שהוא מודלים את התפקיד המקדם של תאי גזע בוגרים גרורות סרטן לרקמות קשות כגון עצם.הדגמה של ההליך תבוצע על ידי חוסיין אפיק, פוסט-דוקטורט במעבדה שלי. התחל באמצעות מדפים מיצוי סטרילי כדי להסיר את רקמת עיסת ממרכז שיני בינה המתקבלים מבוגרים צעירים בגילאי 17 עד 20 שנים. מניחים את הרקמה ב- DMEM שלם קר במנות תרבות רקמה של 10 ס"מ ולהשתמש באזמל כדי לטחון את הדגימות לרסיסים של שניים עד שלושה מילימטרים.מעבירים את החלקים מכל מנה לתוך בארות בודדות של תרבות רקמות שטופלו צלחת שש בארות לכסות את הרקמות בכל באר עם 200 microliters של DMEM מלא. אפשרו לרקמות להיצמד לתחתית הבאר עם דגירה של שעתיים לפחות באינקובטור לח, 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. בסוף הדגירה, להאכיל את הרקמות עם שניים עד 2.5 מיליליטר של מדיום שלם טרי ותרבות התאים במשך שמונה עד תשעה ימים נוספים.כאשר התרבות הגיעה 80%confluency, לשטוף כל טוב עם שני מיליליטר של PBS ואחריו ניתוק של התאים עם שני מיליליטר של טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר שתי דקות, לעצור את התגובה עם שני מיליליטר של DMEM מלא לגם ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, תן שימוש חוזר כדורי ב 15 מיליליטר של מדיום שלם טרי לכל שתי בארות של תאים ולהפוך את התאים לתוך flasks T75 לתרבות הבאה שלהם.לאחר שמונה קטעים לפחות, לדמיין את התאים על ידי מיקרוסקופ אור. תאי גזע עיסת שיניים צריך להיות מחובר מנות התרבות צריך להציג מורפולוגיה תא דמוי ציר. לניתוח סמן פני השטח, לאחר הוכחת טריפסיניזציה, תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בצינורות 1.5 מיליליטר ואחריו שלוש שטיפות ב 500 microliters של PBS לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, סמן את התאים עם הנוגדנים המתאימים של עניין 100 microliters של PBS לצינור במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים PBS כפי שהודגם ולתייג את התאים עם נוגדנים משניים המתאימים 100 microliters של PBS לצינור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף את הדגימות שלוש פעמים PBS ולנתח את התאים על ידי ציטומטריה זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.עבור ההידול של תאי גזע עיסת שיניים, זרע פעם אחת 10 לארבעת התאים לתוך בארות בודדות של 24 בארות צלחות ב 500 microliters של DMEM מלא עבור דגירה 24 שעות ביממה באינקובטור תרבות התא. למחרת, להחליף את המדיום בכל באר עם מדיום ההידול המתאים ולהחזיר את התאים לאנקובטור, לרענן את המדיום פעמיים בשבוע במשך שבועיים. בידול יכול להיות מאושר על ידי פון קוסה וכתמים כחולים אלסיים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.לאחר שניים עד ארבעה קטעים, לאסוף את supernatants בינוני מותנה מן תאי גזע עיסת שיניים מתורבתים כאשר התרבויות להגיע 80% confluency. לאחר מכן, צנטריפוגה המדיום שנאסף כדי להסיר כל חומר רקמת פסולת ופסולת תא ולאחסן את המדיום ב 20 מעלות צלזיוס שלילי עד השימוש. לטיפול בתאי סרטן, זרע אחד פעמים 10 לחמשת תאי הגידול לתוך בארות בודדות של צלחת 12 באר עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5%CO2.למחרת בבוקר, השתמשו בקצה סטרילי של 200 מיקרוליטר כדי לגרום לפגיעה בשריטה בכל באר ולהחליף מיד את העל-טבעי בכל באר במדיום טרי המכיל ריכוזים שונים של מדיום מותנה. לאחר מכן, מיד להתבונן שריטות תחת מיקרוסקופ הפוך ולקבל תמונות של תרבויות פצועים במרווחי זמן קבועים. בסוף הניתוח, למדוד את סגירת השריטה לאורך זמן ב ImageJ.כדי להעריך את נדידת תאי גזע עיסת שיניים, הזרע הראשון שלוש פעמים 10 לארבעה תאי גזע עיסת שיניים על צלחת בודדת 24 באר מכניס עם 0.4 נקבוביות מיקרון ב 250 microliters של DMEM ו דגירה מוסיף לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, זרע חמש פעמים 10 ארבעת תאי הגידול לתוך בארות בודדות של צלחת 24 באר ב 500 microliters של DMEM עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לגרד את התאים הגידוליים כפי שהודגם.החלף את supernatants עם 500 microliters של DMEM טרי וממקמים תא גזע עיסת שיניים אחד זרעים להוסיף לתוך כל מוזנים היטב עם מדיום טרי. ואז מיד להתבונן בתאים על מיקרוסקופ הפוך ותמונה התאים במרווחי זמן קבועים כדי להעריך נדידת תאי גזע עיסת שיניים. כדי להעריך את האינטראקציות הישירות של תאי גזע עיסת שיניים עם תאים סרטניים, trypsinize כל תרבות שכותרתו כדי להשיג השעיות תא יחיד ולאסוף את התאים ניתוק על ידי צנטריפוגה.תן את הכדורים בפתרונות צבע מקשר תאים שונים שהוכנו במאגר C diluent, המסופקים על פי הוראות היצרן, ודגירה התאים הם טמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לסיים את תגובת הכתמים עם 100 microliters של סרום חזיר עוברי ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. ואז צנטריפוגה התאים עם מדיום צמיחה מלא לפני ציפוי חמש פעמים 10 לארבעה תאי גזע עיסת שיניים ותאי גידול ל הבאר בצלחת שש באר ביחס של אחד לאחד בשני מיליליטר של מדיום שלם.לאסוף את התאים לאחר 24 או 48 שעות של דגירה על ידי צנטריפוגה ואחריו לשטוף PBS. לאחר מכן, בצע שימוש חוזר בתאים ב- 300 מיקרוליטרים של מאגר מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות בצינורות ציטומטריה של זרימה עגולה-תחתונה של חמישה מיליליטר ומערבולת כדי לפזר צבירות תאים לפני ניתוח התאים על פי פרוטוקולי ניתוח ציטומטרי זרימה סטנדרטיים. תאי גזע עיסת שיניים להפגין מורפולוגיה תא דמוי פיברובלסט לאחר ציפוי ולהביע אנטיגנים משטח תאי גזע mesenchymal אבל לא סמני תא hematopoietic.שינויים ברמה המורפולוגית והמולקולרית הקשורים אוסטאו, כונדרו, ובידול adipogenic נצפו גם בתרבויות תאי גזע עיסת שיניים בעקבות יישום קוקטייל הבידול המתאים. הטיפול בתרבויות תאים סרטניים שנפגעו מאפס עם ריכוזים של 10 ו -20% של מדיום ממוזג מגביר את סגירת השריטה באופן משמעותי בהשוואה לתרבויות תאי הגידול שטופלו בבקרה-בינונית. מולקולות מופרשות מתאי גזע עיסת שיניים להוסיף תרבויות שיתוף גם גדל סגירת שריטה בתאי גידול פצועים בהשוואה לתאי בקרה שיתוף תרבויות.ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי של האינטראקציות של גזע עיסת שיניים ותא גידול בתוך תרבות תאי במבחנה חושף את היצירה של מבנה מאורגן היטב שבו תאים סרטניים מתרבים במהירות לאחר 48 שעות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על שתי דגימות רקמה במדיום קר מיד להעביר דגימות למעבדה כדי למזער את המוות של התא. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בשדות תאי הגזע בחקירת אינטראקציות סרטן תאי גזע בוגרים בבני אדם.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מעקב אחר תאים חיסוניים עבור תאים דיפרנציאליים המסומן בתאי גזע וסרטן שונים כדי לענות על שאלה נוספת לגבי האופן שבו תאי גזע בוגרים מתקשרים עם תאים סרטניים ושולטים גרורות בסרטן. אל תשכח כי עבודה עם הדגימות האנושיות יכול להיות מסוכן, כי אמצעי זהירות כגון ניתוח דגימות החולה למחלות זיהומיות וקבלת הסכמת המטופל בכתב תמיד צריך להיות מיושם בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

בידוד פרוטוקול של העכבר נגזר מונוציט תאים דנדריטים והפעלה שלהם עוקבות במבחנה עם מכלולים חיסוניים הגידול

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

דור ובידוד של מחזור התא נעצר תאים עם Karyotypes מורכבים

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

קבלת סרטן גזע כדורים מגינקולוגית סרטן השד גידולים

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

בידוד של תאים כמו גזע מתרבויות תלת ממדיות ספרואיד

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

מודל ביומימטי לסרטן הכבד לחקר אינטראקציות גידול-סטרומה בסביבה תלת מימדית עם תכונות ביו-פיזיקליות מתכווננות

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Studying TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â² Signaling and TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...