Name: mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Questo studio è stato supportato da Yeditepe University. Tutti i dati e i dati utilizzati in questo articolo sono stati precedentemente pubblicati34.

Consenso informato dei pazienti è stata ottenuta dopo l'approvazione del Comitato di etica istituzionale.
1. DPSC isolamento e coltura
<ol><li>Trasferire i denti del giudizio ottenuti da giovani adulti di età compresa tra 17 e 20 a 15 mL tubi contenenti per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco completa) [bassa media DMEM glucosio, completato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina / amfotericina (PSA) soluzione], entro 8 h dopo resezione. Mantenere il tessuto ma...

<ol>
	<li>Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Demirci, S., Do&#287;an, A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dental Stem Cells. , 109-124 (2016).</li><li>Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+into+the+understanding+of+mesenchymal+stem+cell+trafficking.">Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking.</a> British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).</li><li>Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mesenchymal+stem+cells+in+cancer+progression+and+metastases.">Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases.</a> Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).</li><li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors:+wounds+that+do+not+heal.">Tumors: wounds that do not heal.</a> New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).</li><li>Lu, Y. -. r., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+inhibitory+effect+of+mesenchymal+stem+cells+on+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo.</a> Cancer biology &amp; therapy. 7 (2), 245-251 (2008).</li><li>Secchiero, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+display+anti-cancer+activity+in+SCID+mice+bearing+disseminated+non-Hodgkin's+lymphoma+xenografts.">Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts.</a> PloS one. 5 (6), e11140 (2010).</li><li>Hong, I. -. S., Lee, H. -. Y., Kang, K. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+and+cancer:+friends+or+enemies?.">Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies?.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).</li><li>Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Mesenchymal+Stem+Cells+(MSCs)+at+sites+of+human+prostate+cancer.">Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer.</a> Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).</li><li>Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+dissecting+a+discrepancy+in+the+literature:+do+mesenchymal+stem+cells+support+or+suppress+tumor+growth.">Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth.</a> Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).</li><li>Albini, A., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+microenvironment+as+a+target+for+chemoprevention.">The tumour microenvironment as a target for chemoprevention.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth.">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).</li><li>Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+human+dental+pulp+stem+cells+(DPSCs)+in+vitro+and+in+vivo.">Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).</li><li>Mori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+pulp+stem+cells:+osteogenic+differentiation+and+gene+expression.">Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression.</a> Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).</li><li>Mori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells.">Osteogenic properties of human dental pulp stem cells.</a> Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).</li><li>Kerkis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+population+of+immature+dental+pulp+stem+cells+expressing+OCT-4+and+other+embryonic+stem+cell+markers.">Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers.</a> Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).</li><li>Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dental+pulp+stem+cells:+applications+in+future+regenerative+medicine.">Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine.</a> World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).</li><li>Ahmed, N. E. -. M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+dental+pulp+stem+cell+secretome+for+Alzheimer's+disease+treatment:+an+in+vitro+study.">Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study.</a> Stem cells international. 2016, (2016).</li><li>Gorin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+dental+pulp+stem+cells+with+fibroblast+growth+factor-2+increases+angiogenesis+of+implanted+tissue-engineered+constructs+through+hepatocyte+growth+factor+and+vascular+endothelial+growth+factor+secretion.">Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion.</a> Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).</li><li>Wakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+secreted+from+dental+pulp+stem+cells+show+multifaceted+benefits+for+treating+acute+lung+injury+in+mice.">Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice.</a> Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).</li><li>Do&#287;an, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+stem+cells+is+promoted+by+amphiphilic+pluronic+block+copolymers.">Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).</li><li>Ta&#351;l&#305;, P. N., Do&#287;an, A., Demirci, S., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boron+enhances+odontogenic+and+osteogenic+differentiation+of+human+tooth+germ+stem+cells+(hTGSCs)+in+vitro.">Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro.</a> Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).</li><li>Yalvac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+stem+cells+derived+from+human+third+molar+tooth+germs+of+young+adults:+implications+in+neo-vascularization,+osteo-,+adipo-and+neurogenesis.">Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis.</a> The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).</li><li>Do&#287;an, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+pentaborate+pentahydrate+and+pluronic+containing+hydrogel+increases+cutaneous+wound+healing+in+vitro+and+in+vivo.">Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo.</a> Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).</li><li>Do&#287;an, A., Yalva&#231;, M. E., Y&#305;lmaz, A., Rizvanov, A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+F68+on+cryopreservation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+tooth+germ.">Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ.</a> Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).</li><li>Rizvanov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+and+self-organization+of+human+mesenchymal+stem+cells+and+neuro-blastoma+SH-SY5Y+cells+under+co-culture+conditions:+A+novel+system+for+modeling+cancer+cell+micro-environment.">Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).</li><li>Troiano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+cells+with+different+mitochondrial+membrane+potential+during+apoptosis+by+polychromatic+flow+cytometry.">Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry.</a> Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).</li><li>Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+niche+models+and+contribution+by+mesenchymal+stroma/stem+cells.">Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells.</a> Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).</li><li>Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cell/mesenchymal+stem+cell+interaction+in+co-culture+and+its+implications+in+angiogenesis.">Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis.</a> Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomimetics and Stem Cells. , 29-36 (2013).</li><li>Plotnikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture.">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Brunetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+TRAIL+by+osteoblastic+differentiated+dental+pulp+stem+cells+affects+myeloma+cell+viability.">High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability.</a> Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).</li><li>Do&#287;an, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+pulp+stem+cells+(DPSCs)+increase+prostate+cancer+cell+proliferation+and+migration+under+in+vitro+conditions.">Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions.</a> Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).</li></ol>

Contributo di MSCs per ambiente tumorale è regolata da numerose interazioni tra cui ibrido cellulare generazione tramite cella fusioni, Citoplasto o citochine e chemochine attività tra cellule staminali e cancro cellule28. Organizzazione strutturale, interazioni cellula-cellula e fattori secreti determinano il comportamento delle cellule di cancro in termini di promozione del tumore, la progressione e la metastasi al tessuto circostante. Corretto ex vivo sistemi modello per stu...

Cellule staminali mesenchimali (MSCs), con la capacità di differenziazione e contributo alla rigenerazione dei tessuti mesenchimali quali l'osso, cartilagine, muscolo, legamento, tendine e adiposo, sono state isolate da quasi tutti i tessuti nel corpo adulto1 , 2. diversi dalla fornitura dell'omeostasi tissutale producendo cellule residenti in caso di infiammazione cronica o una ferita, che producono vitale citochine e fattori di crescita per orchestrare l'angiogenesi, sistema immunitario ed il tessuto che ritocca3. L'interazione di MSCs con tessuto del cancro non è ben compreso, ma raccogliendo la prova suggerisce che MSCs potrebbe promuovere di iniziazione, la progressione e la metastasi del tumore4.
La capacità di homing delle MSC nell'area lesa o cronicamente inflamed li rende un valido candidato per terapie basate sulle cellule staminali. Tuttavia, nei tessuti tumorali, "mai guarigione delle ferite", anche rilascio di citochine infiammatorie, molecole pro-angiogenici e fattori di crescita vitale, che attraggono MSCs al cancerogene zona5. Mentre ci sono limitati rapporti che mostrano gli effetti inibitori di MSCs su cancro crescita6,7, loro progressione tumorale e metastasi promuovere effetti sono stati ampiamente riportati8. MSCs direttamente o indirettamente influenzare la carcinogenesi in modi diversi, inclusa l'eliminazione di cellule immunitarie, che secernono le citochine/fattori di crescita che supportano la proliferazione della cellula tumorale e migrazione, migliorando l'attività angiogenica e regolazione transizione epiteliale-mesenchimale (EMT)9,10. Ambiente tumorale è costituito da diversi tipi cellulari fibroblasti cancro-collegati (CAFs) e/o miofibroblasti, cellule endoteliali, adipociti e cellule immuni11. Di quelli, CAFs sono il tipo più abbondante di cellule nella zona del tumore che secernono diverse chemochine, promuovere la crescita e la metastasi di cancro8. È stato dimostrato che MSCs derivate da midollo osseo possono differenziare in CAFs nel tumore dello stroma12.
Cellule staminali della polpa dentale (DPSCs), caratterizzate come il primo MSCs dentale di tessuto-derivato da Gronthos et al. 13 nel 2000 e quindi ampiamente studiato da altri14,15, esprimono marcatori di pluripotenza come Oct4, Sox2, Nanoge16 e possono differenziarsi in varie cellule linages17. Analisi di espressione genica e proteica ha dimostrato che DPSCs produrre livelli comparabili di fattori di crescita/citochine con altri MSCs come fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), angiogenina, fattore di crescita del fibroblasto 2 (FGF2), interleuchina-4 (IL-4), IL-6, IL-10, e fattore di cellula formativa (SCF), così come ligando di chinasi-3 fms-come tirosina (Flt - 3L) che potrebbe promuovere l'angiogenesi, modulano le cellule immuni e sostenere il cancro delle cellule di proliferazione e migrazione18,19,20 . Mentre le interazioni di MSCs con ambiente di cancro sono state ben documentate nella letteratura, il rapporto tra DPSCs e le cellule tumorali non è stato valutato ancora. Nello studio presente, abbiamo stabilito le strategie di trattamento medio di co-cultura e condizione per una linea cellulare altamente metastatica del carcinoma della prostata, PC-3 e DPSCs a proporre azione potenziale del meccanismo di MSCs dentale nella progressione del cancro e metastasi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11885084</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745E</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>For cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10010023</td>
			<td>For washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Component of differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Component of osteogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS &#8722;G)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Component of chondrogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SRP3171</td>
			<td>Component of chondrogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Component of adipogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7018</td>
			<td>Component of adipogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Component of adipogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>Cell viability analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL Assay</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td>Apoptotic analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3396</td>
			<td>For trans-well migration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PKH67GL</td>
			<td>For co-culture cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td>For co-culture cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>For cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Kossa Kit</td>
			<td>BioOptica</td>
			<td>04-170801.A</td>
			<td>For cell staining (differentiation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2899</td>
			<td>For cell staining (differentiation)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions

Il cancro come un processo multistep e malattia complicata è non solo regolato da crescita e proliferazione delle cellule individuali ma anche controllato da interazioni cellula-cellula e ambiente del tumore. Identificazione del cancro e cellule staminali interazioni, compresi i cambiamenti nell'ambiente extracellulare, interazioni fisiche e fattori secreti, potrebbe consentire la scoperta di nuove opzioni di terapia. Uniamo le tecniche di co-cultura conosciuta per creare un sistema modello per cancro e cellule staminali mesenchimali (MSCs) interazioni cellula. Nello studio corrente, le cellule staminali della polpa dentale (DPSCs) e interazioni cellula di PC-3 del carcinoma della prostata sono stati esaminati mediante tecniche dirette e indirette di co-coltura. Medio di condizione (CM) ottenuti da DPSCs e 0,4 µm poro dimensioni trans-pozzo membrane sono state usate per studiare l'attività paracrina. Co-coltura di diversi tipi di cellule insieme è stata effettuata per studiare l'interazione diretto cellula-cellula. I risultati hanno rivelato che CM aumentata proliferazione delle cellule ed in diminuzione di apoptosi nelle colture cellulari del carcinoma della prostata. Sia CM e trans-pozzo sistema aumentata capacità di migrazione delle cellule delle cellule PC-3. Le cellule colorate con membrana diversi coloranti erano teste di serie le stesse navi di cultura, e DPSCs ha partecipato a una struttura auto-organizzata con cellule PC-3 in questa condizione di co-coltura diretta. Nel complesso, i risultati hanno indicato che le tecniche di co-coltura potrebbero essere utile per cancro e interazioni di MSC come sistema modello.

Figura 1 illustra le caratteristiche generali di MSC di DPSCs in condizioni di coltura. DPSCs esercitare morfologia fibroblasto-come delle cellule dopo il placcaggio (Figura 1B). Antigeni di superficie MSC (CD29, CD73, CD90, CD105 e CD166) sono altamente espressi mentre marcatori ematopoietici (CD34, CD45 e CD14) sono negativi (Figura 1). Modifiche a livello morfologico e molecolare relativo a osteo-...

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Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Forniamo i protocolli per la valutazione delle cellule staminali mesenchimali isolate da polpa dentale e interazioni delle cellule di carcinoma della prostata basati su metodi diretti e indiretti di co-coltura. Mezzo di condizione e trans-pozzo membrane sono adatte per analizzare attività paracrina indiretta. Seeding differenzialmente macchiato le cellule insieme è un modello appropriato per interazione diretto cellula-cellula.

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali sul ruolo delle cellule staminali adulte nella regolazione del comportamento delle cellule tumorali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la valutazione delle interazioni delle cellule tumorali e delle cellule staminali in vitro senza l'uso di organismi viventi. Questa tecnica ha un potenziale per la metastasi tumorale in quanto modella il ruolo di promozione delle cellule staminali adulte nella metastasi tumorale ai tessuti duri come l'osso.La dimostrazione della procedura sarà effettuata da Huseyin Apdik, un post-dottorato nel mio laboratorio. Inizia usando forcelle di estrazione sterili per rimuovere il tessuto della polpa dal centro dei denti del giudizio ottenuti da giovani adulti di età compresa tra 17 e 20 anni. Posizionare il tessuto in DMEM completo a freddo in piatti di coltura tissutale di 10 centimetri e utilizzare un bisturi per tritare i campioni in frammenti da due a tre millimetri.Trasferire i pezzi da ogni piatto in singoli pozzi di una piastra di sei pozzetti trattata con coltura tissutale e coprire i tessuti in ogni pozzo con 200 microlitri di DMEM completo. Lasciare che i tessuti si attaccano ai fondi del pozzo con un'incubazione di almeno due ore in un incubatore di coltura cellulare umidificato di 37 gradi Celsius e 5%CO2. Alla fine dell'incubazione, nutrire i tessuti con da due a 2,5 millilitri di mezzo fresco completo e colturare le cellule per altri otto o nove giorni.Quando la coltura ha raggiunto l'80% di confluenza, lavare ogni bene con due millilitri di PBS seguiti dal distacco delle cellule con due millilitri di tripside a 37 gradi Celsius. Dopo due minuti, interrompere la reazione con due millilitri di DMEM completo per pozzo e raccogliere le cellule per centrifugazione. Quindi, resostigliere i pellet in 15 millilitri di mezzo fresco completo per due pozzi di cellule e passare le cellule in mastri T75 per la loro successiva coltura.Dopo almeno otto passaggi, visualizzare le cellule mediante microscopia ottica. Le cellule staminali della polpa dentale dovrebbero essere attaccate ai piatti di coltura e dovrebbero mostrare una morfologia cellulare simile a un mandrino. Per l'analisi del marcatore di superficie, dopo aver dimostrato la trippsinizzazione, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente in tubi da 1,5 millilitri seguiti da tre lavaggi in 500 microlitri di PBS per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le cellule con gli anticorpi appropriati di interesse in 100 microlitri di PBS per tubo per un'ora a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte in PBS come dimostrato ed etichettare le cellule con gli anticorpi secondari appropriati in 100 microlitri di PBS per tubo per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi lavare i campioni tre volte in PBS e analizzare le cellule per citometria di flusso secondo protocolli standard.Per la differenziazione delle cellule staminali della polpa dentale, seminare una volta 10 alle quattro cellule in singoli pozzi di piastre da 24 porri in 500 microlitri di DMEM completo per un'incubazione 24 ore su 24 nell'incubatore di coltura cellulare. Il giorno successivo, sostituire il mezzo in ogni pozzo con l'appropriato mezzo di differenziazione e riportare le cellule all'incubatrice, rinfrescando il mezzo due volte a settimana per due settimane. La differenziazione può essere confermata dalla colorazione blu di von Kossa e Alcian secondo protocolli standard.Dopo due o quattro passaggi, raccogliere i supernaganti medi condizionati dalle cellule staminali della polpa dentale coltivate quando le colture raggiungono l'80% di confluenza. Quindi, centrifugare il mezzo raccolto per rimuovere qualsiasi materiale di tessuto di scarto e detriti cellulari e conservare il mezzo a -20 gradi Celsius fino all'uso. Per il trattamento delle cellule tumorali, seminare una volta 10 alle cinque cellule tumorali in singoli pozzi di una piastra da 12 po 'per l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 5%CO2.La mattina successiva, utilizzare una punta sterile da 200 microliter per fare una lesione da graffio in ogni pozzo e sostituire immediatamente il supernatante in ogni pozzo con mezzo fresco contenente varie concentrazioni di mezzo condizionato. Quindi, osservare immediatamente i graffi al microscopio invertito e ottenere immagini delle colture ferite a intervalli di tempo regolari. Al termine dell'analisi, misurare la chiusura dei graffi nel tempo in ImageJ.Per valutare la migrazione delle cellule staminali della polpa dentale, primo seme tre volte 10 alle quattro cellule staminali della polpa dentale su singoli inserti di piastre da 24 pozzetti con pori da 0,4 micron in 250 microlitri di DMEM e incubare gli inserti durante la notte a 37 gradi Celsius. Successivamente, semina cinque volte 10 le quattro cellule tumorali in singoli pozzi di una piastra da 24 porri in 500 microlitri di DMEM per l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius. La mattina dopo, graffiare le cellule tumorali come dimostrato.Sostituire i supernatinanti con 500 microlitri di DMEM fresco e posizionare un inserto seminato di cellule staminali di polpa dentale in ogni bene alimentato con mezzo fresco. Quindi osservare immediatamente le cellule su un microscopio invertito e immagini le cellule a intervalli regolari per valutare la migrazione delle cellule staminali della polpa dentale. Per valutare le interazioni dirette delle cellule staminali della polpa dentale con le cellule tumorali, tripinare ogni coltura etichettata per ottenere sospensioni a una cellula e raccogliere le cellule dissociate per centrifugazione.Resuspend i pellet in distinte soluzioni di colorante del linker cellulare preparate in tampone C diluito, fornite secondo le istruzioni del produttore, e incubare le cellule sono a temperatura ambiente per 10 minuti. Terminare la reazione di colorazione con 100 microlitri di siero bovino fetale e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Quindi centrifugare le cellule con un mezzo di crescita completo prima di placcare cinque volte 10 alle quattro cellule staminali della polpa dentale e alle cellule tumorali per pozzo in una piastra da sei po 'a un rapporto uno a uno in due millilitri di mezzo completo.Raccogliere le cellule dopo 24 o 48 ore di incubazione per centrifugazione seguita da un lavaggio in PBS. Quindi, risospese le cellule in 300 microlitri di tampone di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza in tubi di citometria a flusso tondo-fondo da cinque millilitri e vortice per disperdere eventuali aggregati cellulari prima di analizzare le cellule secondo protocolli di analisi citometrica a flusso standard. Le cellule staminali della polpa dentale mostrano una morfologia cellulare simile a un fibroblasto dopo la placcatura ed esprimono antigeni superficiali delle cellule staminali mesenchimali ma non marcatori cellulari ematopoietici.Cambiamenti a livello morfologico e molecolare legati alla differenziazione osteo, condro e adipogenica si osservano anche nelle colture di cellule staminali della polpa dentale a seguito dell'appropriata applicazione del cocktail di differenziazione. Il trattamento delle colture cellulari tumorali ferite da graffi con concentrazioni del 10 e 20% di mezzo condizionato aumenta significativamente la chiusura dei graffi rispetto alle colture cellulari tumorali di controllo-medio trattato. Le molecole secrete delle cellule staminali della polpa dentale inseriscono co-colture hanno anche aumentato la chiusura dei graffi nelle cellule tumorali ferite rispetto alle co-colture cellulari di controllo.L'analisi al microscopio a fluorescenza delle interazioni tra lo stelo della polpa dentale e la cellula tumorale all'interno di una coltura cellulare in vitro rivela la creazione di una struttura ben organizzata all'interno della quale le cellule tumorali proliferano rapidamente dopo 48 ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di tenere due campioni di tessuto in mezzo freddo e trasportare immediatamente campioni in laboratorio per ridurre al minimo la morte cellulare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nei campi delle cellule staminali nell'esplorazione delle interazioni del cancro delle cellule staminali adulte negli esseri umani.Seguendo questa procedura, altri metodi come il tracciamento delle cellule immunitarie per le cellule differenziali etichettate di vari tipi di cellule staminali e cancro possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande su come le cellule staminali adulte interagiscono con le cellule tumorali e controllano la metastasi tumorale. Non dimenticare che lavorare con i campioni umani può essere pericoloso e che precauzioni come l'analisi dei campioni di pazienti per malattie infettive e l'ottenimento del consenso scritto del paziente dovrebbero sempre essere implementate quando si esegue questa procedura.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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