Name: mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions at JoVE.com

Denna studie stöddes av Yeditepe universitet. Alla uppgifter och siffror som används i den här artikeln var tidigare publicerade34.

Skriftligt informerat samtycke från patienterna erhölls efter godkännande från utskottet för institutionella etik.
1. DPSC isolering och kultur
<ol><li>Överföra visdomständer som erhållits från unga vuxna i åldern 17 – 20 till 15 mL rör som innehåller komplett Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) [låg glukos DMEM media, kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin / amfotericin (PSA) lösning], inom 8 h efter resektion. Hålla vävnad mat...

<ol>
	<li>Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Demirci, S., Do&#287;an, A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dental Stem Cells. , 109-124 (2016).</li><li>Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+into+the+understanding+of+mesenchymal+stem+cell+trafficking.">Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking.</a> British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).</li><li>Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mesenchymal+stem+cells+in+cancer+progression+and+metastases.">Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases.</a> Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).</li><li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors:+wounds+that+do+not+heal.">Tumors: wounds that do not heal.</a> New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).</li><li>Lu, Y. -. r., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+inhibitory+effect+of+mesenchymal+stem+cells+on+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo.</a> Cancer biology &amp; therapy. 7 (2), 245-251 (2008).</li><li>Secchiero, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+display+anti-cancer+activity+in+SCID+mice+bearing+disseminated+non-Hodgkin's+lymphoma+xenografts.">Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts.</a> PloS one. 5 (6), e11140 (2010).</li><li>Hong, I. -. S., Lee, H. -. Y., Kang, K. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+and+cancer:+friends+or+enemies?.">Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies?.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).</li><li>Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Mesenchymal+Stem+Cells+(MSCs)+at+sites+of+human+prostate+cancer.">Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer.</a> Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).</li><li>Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+dissecting+a+discrepancy+in+the+literature:+do+mesenchymal+stem+cells+support+or+suppress+tumor+growth.">Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth.</a> Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).</li><li>Albini, A., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+microenvironment+as+a+target+for+chemoprevention.">The tumour microenvironment as a target for chemoprevention.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth.">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).</li><li>Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+human+dental+pulp+stem+cells+(DPSCs)+in+vitro+and+in+vivo.">Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).</li><li>Mori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+pulp+stem+cells:+osteogenic+differentiation+and+gene+expression.">Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression.</a> Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).</li><li>Mori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells.">Osteogenic properties of human dental pulp stem cells.</a> Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).</li><li>Kerkis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+population+of+immature+dental+pulp+stem+cells+expressing+OCT-4+and+other+embryonic+stem+cell+markers.">Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers.</a> Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).</li><li>Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dental+pulp+stem+cells:+applications+in+future+regenerative+medicine.">Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine.</a> World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).</li><li>Ahmed, N. E. -. M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+dental+pulp+stem+cell+secretome+for+Alzheimer's+disease+treatment:+an+in+vitro+study.">Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study.</a> Stem cells international. 2016, (2016).</li><li>Gorin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+dental+pulp+stem+cells+with+fibroblast+growth+factor-2+increases+angiogenesis+of+implanted+tissue-engineered+constructs+through+hepatocyte+growth+factor+and+vascular+endothelial+growth+factor+secretion.">Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion.</a> Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).</li><li>Wakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+secreted+from+dental+pulp+stem+cells+show+multifaceted+benefits+for+treating+acute+lung+injury+in+mice.">Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice.</a> Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).</li><li>Do&#287;an, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+stem+cells+is+promoted+by+amphiphilic+pluronic+block+copolymers.">Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).</li><li>Ta&#351;l&#305;, P. N., Do&#287;an, A., Demirci, S., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boron+enhances+odontogenic+and+osteogenic+differentiation+of+human+tooth+germ+stem+cells+(hTGSCs)+in+vitro.">Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro.</a> Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).</li><li>Yalvac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+stem+cells+derived+from+human+third+molar+tooth+germs+of+young+adults:+implications+in+neo-vascularization,+osteo-,+adipo-and+neurogenesis.">Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis.</a> The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).</li><li>Do&#287;an, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+pentaborate+pentahydrate+and+pluronic+containing+hydrogel+increases+cutaneous+wound+healing+in+vitro+and+in+vivo.">Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo.</a> Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).</li><li>Do&#287;an, A., Yalva&#231;, M. E., Y&#305;lmaz, A., Rizvanov, A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+F68+on+cryopreservation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+tooth+germ.">Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ.</a> Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).</li><li>Rizvanov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+and+self-organization+of+human+mesenchymal+stem+cells+and+neuro-blastoma+SH-SY5Y+cells+under+co-culture+conditions:+A+novel+system+for+modeling+cancer+cell+micro-environment.">Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).</li><li>Troiano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+cells+with+different+mitochondrial+membrane+potential+during+apoptosis+by+polychromatic+flow+cytometry.">Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry.</a> Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).</li><li>Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+niche+models+and+contribution+by+mesenchymal+stroma/stem+cells.">Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells.</a> Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).</li><li>Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cell/mesenchymal+stem+cell+interaction+in+co-culture+and+its+implications+in+angiogenesis.">Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis.</a> Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomimetics and Stem Cells. , 29-36 (2013).</li><li>Plotnikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture.">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Brunetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+TRAIL+by+osteoblastic+differentiated+dental+pulp+stem+cells+affects+myeloma+cell+viability.">High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability.</a> Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).</li><li>Do&#287;an, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+pulp+stem+cells+(DPSCs)+increase+prostate+cancer+cell+proliferation+and+migration+under+in+vitro+conditions.">Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions.</a> Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).</li></ol>

Bidrag av MSCs till tumör miljö regleras av flera interaktioner inklusive hybrid cell generation via cell fusioner, entosis eller cytokin och chemokine aktiviteter mellan stamceller och cancer celler28. Strukturella organisationen, cell-cell interaktioner och utsöndrade faktorer avgör cancercellers beteende i form av tumör främjande, progression och metastaser till omgivande vävnad. Ordentlig ex vivo modellsystem att undersöka mekanismerna bakom växelverkan mellan bosatt...

Mesenkymala stamceller (MSC), med möjlighet till differentiering och bidrag till förnyelse av mesenkymala vävnader såsom ben, brosk, muskler, ligament, senor och adipose, har isolerats från nästan alla vävnader i den vuxna kropp1 , 2. än att tillhandahålla vävnad homeostas genom att producera bosatt celler vid kronisk inflammation eller en skada, de producerar livsviktiga cytokiner och tillväxtfaktorer för att orkestrera angiogenes och immunsystemets vävnad remodeling3. MSCs interaktion med cancer vävnad är inte väl förstått, men ackumulerande bevis antyder att MSCs kan främja tumör initiering, progression och metastaser4.
MSCs målsökande förmåga att skadade eller kroniskt inflammerade området gör dem en värdefull kandidat för stamceller-baserade behandlingar. Men frigöra cancer vävnader, ”aldrig läka sår”, också inflammatoriska cytokiner, proangiogena molekyler och vitala tillväxtfaktorer, som locka MSCs till cancerogenous område5. Medan det finns begränsade rapporterade rapporter visar hämmande effekterna av MSCs på cancer tillväxt6,7, deras cancer progression och metastaser främjande effekter har varit omfattande8. MSCs påverkar direkt eller indirekt carcinogenes på olika sätt inklusive undertrycka immunceller, utsöndrar tillväxtfaktorer/cytokiner som stöder cancer cell spridning och migrering, öka angiogena aktivitet och reglera epitelial-mesenkymala övergången (EMT)9,10. Tumör miljön består av flera celltyper inklusive cancer-associerade fibroblaster (CAFs) eller myofibroblaster, endotelceller, adipocyter och immunceller11. Av dessa är CAFs den vanligast förekommande Celltypen i området tumör som utsöndrar olika chemokiner främjar cancer tillväxt och metastas8. Det har visats att benmärgen-derived MSCs kan differentieras till CAFs i tumör stroma12.
Tandpulpan stamceller (DPSCs), karakteriseras som de första dentala vävnad-derived MSCs av Gronthos et al. 13 år 2000 och sedan allmänt utreds av andra14,15, express pluripotency markörer såsom Oct4, Sox2och Nanog16 och kan differentieras till olika cell linages17. Gen och protein uttryck analys visade att DPSCs producera jämförbara nivåer av tillväxtfaktorer/cytokiner med andra MSCs såsom vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), angiogenin, fibroblast tillväxtfaktor 2 (FGF2), interleukin-4 IL-4, IL-6, IL-10, och stamceller faktor (SCF), samt fms-liknande tyrosin Kinas-3 ligand (Flt - 3L) som kan främja angiogenes, modulera immunceller, och stödja cancer cell spridning och migration18,19,20 . Medan interaktionerna av MSCs med cancer miljö har varit väl dokumenterade i litteraturen, har förhållandet mellan DPSCs och cancerceller inte utvärderats ännu. I den aktuella studien etablerat vi samarbete kultur och skick medium behandlingsstrategier för en mycket metastaserande prostatacancer cell fodrar, PC-3 och DPSCs att föreslå potentiella åtgärder av mekanism av dental MSCs i cancer progression och metastasering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11885084</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745E</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>For cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10010023</td>
			<td>For washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Component of differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Component of osteogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS &#8722;G)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Component of chondrogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SRP3171</td>
			<td>Component of chondrogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Component of adipogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7018</td>
			<td>Component of adipogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Component of adipogenic differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>Cell viability analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL Assay</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td>Apoptotic analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3396</td>
			<td>For trans-well migration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PKH67GL</td>
			<td>For co-culture cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td>For co-culture cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>For cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Kossa Kit</td>
			<td>BioOptica</td>
			<td>04-170801.A</td>
			<td>For cell staining (differentiation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2899</td>
			<td>For cell staining (differentiation)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions

Cancer som en utgångsämnet process och komplicerade sjukdom är inte bara regleras av enskilda cellproliferation och tillväxt men också kontrolleras av tumör miljö och cell-cell interaktioner. Identifiering av cancer och stem cell interaktioner, inklusive ändringar i extracellulära miljön, fysiska interaktioner och utsöndrade faktorer, kan möjliggöra upptäckten av nya behandlingsalternativ. Vi kombinerar kända samtidig kultur tekniker för att skapa ett modellsystem för mesenkymala stamceller (MSC) och cancer cell interaktioner. I den aktuella studien undersöktes tandpulpan stamceller (DPSCs) och PC-3 prostatacancer cell interaktioner genom direkta och indirekta samtidig kultur tekniker. Villkor medium (CM) erhålls från DPSCs och 0,4 µm porstorlek storlek trans-väl membran användes för att studera parakrin aktivitet. Samtidig kultur av olika celltyper utfördes tillsammans för att studera direkt cell-cell interaktioner. Resultaten visade att CM ökad cellproliferation och minskade apoptos i prostatacancer cellkulturer. Både CM och trans-väl systemet ökade cell migration kapacitet av PC-3 celler. Celler som färgas med olika membran färgämnen var seedad i de samma odlingskärl och DPSCs deltog i en självorganiserade strukturen med PC-3 celler under detta direkt samarbete kultur tillstånd. Sammantaget visade resultaten att samtidig kultur tekniker kan vara användbar för cancer och MSC interaktioner som modellsystem.

Figur 1 illustrerar allmänna MSC egenskaper DPSCs kultur villkor. DPSCs utöva fibroblast-liknande cellmorfologi efter plätering (figur 1B). MSC ytantigener (CD29, CD73, CD90, CD105 och CD166) uttrycks mycket medan hematopoetiska markörer (CD34 CD45 och CD14) är negativ (figur 1 c). Ändringar på morfologiska och molekylära nivå med osteo-, chondro- och adipo-genic differentiering kan observer...

Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions at JoVE.com

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Vi tillhandahåller protokoll för kvalitetsbedömning av mesenkymala stamceller isoleras från tandpulpan och prostatacancer cell interaktioner bygger på direkta och indirekta samtidig kultur metoder. Villkor medium och trans-väl membran är lämpliga att analysera indirekta parakrin aktivitet. Seedning differentially är färgade celler tillsammans en lämplig modell för direkta cell-cell interaktioner.

Mesenkymala stamceller isolering från massa vävnad och samtidig kultur med cancerceller för att studera deras interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom stamcellsområdet om vuxna stamcellers roll i regleringen av cancercellbeteende. Den största fördelen med denna teknik är att det möjliggör utvärdering av cancer cell och stamcellsinteraktioner in vitro utan användning av levande organismer. Denna teknik har potential för cancer metastasering som det modeller främja roll vuxna stamceller i cancer metastasering till hårda vävnader såsom ben.Demonstration av förfarandet kommer att utföras av Huseyin Apdik, en post-doktoral i mitt laboratorium. Börja med att använda sterila extraktionstens tuten för att avlägsna massavävnaden från visdomständernas centrum som erhållits från unga vuxna i åldern 17 till 20 år. Placera vävnaden i kallt komplett DMEM i 10-centimeters vävnadsodlingsrätter och använd en skalpell för att finhacka proverna i två till tre millimeters fragment.Överför bitarna från varje maträtt i enskilda brunnar av en vävnadskultur behandlad sex-brunnsplatta och täck vävnaderna i varje brunn med 200 mikroliter av kompletta DMEM. Låt vävnaderna fästa vid brunnsbottnar med en minst två timmars inkubation i en befuktad, 37 grader Celsius och 5%CO2 cellodling inkubator. I slutet av inkubationen, mata vävnaderna med två till 2,5 milliliter färskt komplett medium och odla cellerna i ytterligare åtta till nio dagar.När kulturen har nått 80%konfluency, tvätta varje brunn med två milliliter PBS följt av lossning av cellerna med två milliliter trypsin vid 37 grader Celsius. Efter två minuter, stoppa reaktionen med två milliliter av komplett DMEM per brunn och samla cellerna genom centrifugeringen. Sedan, resuspend pellets i 15 milliliter av färskt komplett medium per två brunnar av celler och passage cellerna i T75 flaskor för deras efterföljande kultur.Efter minst åtta passager, visualisera cellerna genom ljusmikroskopi. Den tandmassa stamceller bör ha fäst vid odlingsrätter och bör visa en spindel-liknande cell morfologi. För ytan markör analys, efter trypsinization påvisas, fixera cellerna med 4%paraformaldehyd i 20 minuter vid rumstemperatur i 1,5-milliliter rör följt av tre tvättar i 500 mikroliter PBS per tvätt.Efter den sista tvätten, märka cellerna med lämpliga antikroppar av intresse i 100 mikroliter PBS per rör i en timme vid fyra grader Celsius. Vid inkubationens tvätta cellerna tre gånger i PBS som påvisats och märk cellerna med lämpliga sekundära antikroppar i 100 mikroliter PBS per rör i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Tvätta sedan proverna tre gånger i PBS och analysera cellerna genom flödescytometri enligt standardprotokoll.För differentiering av dentala massa stamceller, utsäde en gånger 10 till de fyra cellerna i enskilda brunnar av 24-brunn plattor i 500 mikroliter av kompletta DMEM för en 24-timmars inkubation i cellkulturen inkubator. Nästa dag, ersätta mediet i varje brunn med lämplig differentiering medium och returnera cellerna till inkubatorn, uppfriskande mediet två gånger i veckan i två veckor. Differentiering kan bekräftas av von Kossa och Alcian blå färgning enligt standardprotokoll.Efter två till fyra passager, samla de betingade medium supernatanterna från de odlade tandmassa stamceller när kulturerna når 80%confluency. Sedan centrifug det insamlade mediet för att ta bort eventuella avfallsvävnad material och cell skräp och lagra mediet vid negativa 20 grader Celsius tills användning. För cancer cellbehandling, utsäde en gånger 10 till de fem tumörcellerna i enskilda brunnar av en 12-brunnsplatta för övernattning inkubation vid 37 grader Celsius och 5%CO2.Nästa morgon, använd en steril 200-mikroliter spets för att göra en repa skada i varje brunn och omedelbart ersätta supernatant i varje brunn med färskt medium som innehåller olika koncentrationer av konditionerat medium. Sedan, omedelbart observera repor under ett inverterat mikroskop och få bilder av de skadade kulturerna med jämna tidsintervall. I slutet av analysen mäter du repstängningen över tid i ImageJ.För att bedöma dental massa stamcellsmigration, första frö tre gånger 10 till de fyra tandmassa stamceller på enskilda 24-brunn plåt skär med 0,4 mikron porer i 250 mikroliter av DMEM och inkubera skär över natten på 37 grader Celsius. Nästa, frö fem gånger 10 de fyra tumörcellerna i enskilda brunnar av en 24-väl platta i 500 mikroliter av DMEM för övernattning inkubation vid 37 grader Celsius. Nästa morgon, repa tumörcellerna som visat.Byt ut supernatanterna mot 500 mikroliter av färskt DMEM och placera en tandmassastamcellsfrösad insats i varje välmatad med färskt medium. Sedan omedelbart observera celler på en inverterad mikroskop och bild cellerna med jämna mellanrum för att bedöma dental massa stamceller migration. För att bedöma de direkta interaktionerna mellan dentala massa stamceller med cancerceller, trypsinize varje märkt kultur för att få encelliga suspensioner och samla de dissocierade cellerna genom centrifugeringen.Resuspend pellets i distinkta celllänker färgämne lösningar beredda i spädningsvätska C buffert, levereras enligt tillverkarens instruktioner, och inkubera cellerna är rumstemperatur i 10 minuter. Avsluta färgning reaktion med 100 mikroliter av fetala nötkreatur serum och samla in cellerna genom centrifugeringen. Sedan centrifug cellerna med fullständig tillväxt medium innan plätering fem gånger 10 till de fyra tandmassa stamceller och tumörceller per brunn i en sex-väl platta på en en till ett förhållande i två milliliter av komplett medium.Samla upp cellerna efter 24 eller 48 timmars inkubation genom centrifugering följt av en tvätt i PBS. Sedan, resuspend cellerna i 300 mikroliter av fluorescens-aktiverad cell sortering buffert i fem-milliliter rund botten flöde cytometrirör och virvel för att skingra alla cellaggregat innan analysera cellerna enligt standard flödescytometriska analysprotokoll. Dental massa stamceller uppvisar en fibroblast-liknande cell morfologi efter plätering och uttrycka mesenkymala stamceller yta antigener men inte hematopoietic cell markörer.Förändringar på morfologisk och molekylär nivå relaterade till osteo, kondro och adipogenic differentiering observeras också i den dental massa stamceller kulturer efter lämplig differentiering cocktail ansökan. Behandlingen av scratch-skadade tumör cell kulturer med 10 och 20%koncentrationer av konditionerat medium ökar scratch stängningen betydligt jämfört med kontroll-medium-behandlade tumör cell kulturer. Utsöndade molekyler från dentala massa stamceller infoga samkulturer ökade också scratch stängning i skadade tumörceller jämfört med kontrollcell kokulturer.Fluorescens mikroskop analys av interaktioner av tandläkare massa stam och tumörcell inom en in vitro cell kultur avslöjar skapandet av en välorganiserad struktur inom vilken tumörceller snabbt föröka sig efter 48 timmar. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att hålla två vävnadsprover i kallt medium och omedelbart transportera prover till laboratoriet för att minimera celldöd. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom stamcellsfälten i att utforska vuxna stamcellscancer interaktioner hos människor.Efter detta förfarande, andra metoder som immuncellsspårning för differentiella märkta celler av olika stamceller och cancertyper kan utföras för att svara på ytterligare fråga om hur vuxna stamceller interagerar med cancerceller och kontroll cancer metastasering. Glöm inte att det kan vara farligt att arbeta med de mänskliga proverna och att försiktighetsåtgärder som att analysera patientprover för infektionssjukdomar och erhålla skriftligt patientmedgivande alltid bör genomföras när du utför denna procedur.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolering protokoll mus monocyt-derived dendritiska celler och deras efterföljande In Vitro -aktivering med tumör immunkomplex

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Generation och isolering av cellcykeln-arresterade celler med komplexa Karyotypes

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Erhålla Cancer Stem Cell Spheres från gynekologiska och bröstcancertumörer

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering av Stem-liknande celler från 3-dimensionella sfäroid kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

En biomimetisk modell för levercancer för att studera tumör-stromainteraktioner i en 3D-miljö med tunable biofysiska egenskaper

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering och funktionell bedömning av mänskliga bröstcancerstamceller från cell- och vävnadsprover

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Studying TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â² Signaling and TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Studerar TGF-β signal- och TGF-β-inducerad epitelial-till-mesenkymal övergång i bröstcancer och normala celler

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Samkultur av Glioblastoma stamliknande celler på mönstrade nervceller för att studera migration och cellulära interaktioner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...