Name: isolation of single intracellular bacterial communities generated from a murine model of urinary tract infection for downstream single-cell analysis
Uploaded: 2019-04-16T12:30:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis at JoVE.c

هذا البحث كان تدعمها "المؤسسة الوطنية للبحوث"، مكتب رئيس الوزراء، سنغافورة، ضمن "مخططها زمالة بحثية جبهة الخلاص الوطني" (جبهة الخلاص الوطني جائزة لا. NRF-RF2010-10)؛ المجلس الوطني للبحوث الطبية سنغافورة التابعة لوزارة الصحة (نمرك-سيرج/1358/2013)؛ وفي معهد الجينوم بسنغافورة (GIS)/وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث (A * ستار).

<ol>
	<li>Barber, A. E., Norton, P. J., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Tract+Infections:+Current+and+Emerging+Management+Strategies.">Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies.</a> Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).</li><li>Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infections:+epidemiology,+mechanisms+of+infection+and+treatment+options.">Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options.</a> Nature Reviews Microbiology. 13, 269-284 (2015).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurring+urinary+tract+infection:+incidence+and+risk+factors.">Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors.</a> American Journal of Public Health. 80, 331-333 (1990).</li><li>Foxman, B., Barlow, R., D'Arcy, H., Gillespie, B., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection:+self-reported+incidence+and+associated+costs.">Urinary tract infection: self-reported incidence and associated costs.</a> Annals of Epidemiology. 10 (8), 509-515 (2000).</li><li>Zowawi, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+threat+of+multidrug-resistant+Gram-negative+bacteria+in+urology.">The emerging threat of multidrug-resistant Gram-negative bacteria in urology.</a> Nature Reviews Urology. 12, 570-584 (2015).</li><li>Silverman, J. A., Schreiber, H. L., Hooton, T. M., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+physiology+to+pharmacy:+developments+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+recurrent+urinary+tract+infections.">From physiology to pharmacy: developments in the pathogenesis and treatment of recurrent urinary tract infections.</a> Current Urology Reports. 14, 448-456 (2013).</li><li>Sivick, K. E., Mobley, H. L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waging+war+against+uropathogenic+Escherichia+coli:+winning+back+the+urinary+tract.">Waging war against uropathogenic Escherichia coli: winning back the urinary tract.</a> Infection and Immunity. 78, 568-585 (2010).</li><li>Hung, C. -. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4, 1230-1243 (2009).</li><li>Cusumano, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infection+with+orally+active+FimH+inhibitors.">Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors.</a> Science Translational Medicine. , (2011).</li><li>Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+Immunization+with+Iron+Receptor+Antigens+Protects+against+Urinary+Tract+Infection.">Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection.</a> PLoS Pathogens. , (2009).</li><li>Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+uropathogenic+Escherichia+coli+persistence+and+eradication+from+the+urinary+tract.">Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2006).</li><li>Hunstad, D. A., Justice, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+lifestyles+and+immune+evasion+strategies+of+uropathogenic+Escherichia+coli.">Intracellular lifestyles and immune evasion strategies of uropathogenic Escherichia coli.</a> Annual Review of Microbiology. 64, 203-221 (2010).</li><li>Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+bacterial+communities+in+human+urinary+tract+infection.">Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection.</a> PLoS Medicine. , (2007).</li><li>Robino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+bacterial+communities+in+a+child+with+Escherichia+coli+recurrent+urinary+tract+infections.">Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections.</a> Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).</li><li>Robino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+bacteria+in+the+pathogenesis+of+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+children.">Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children.</a> Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).</li><li>Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+and+niche+distribution+of+uropathogenic+Escherichia+coli+during+acute+and+chronic+urinary+tract+infection.">Population dynamics and niche distribution of uropathogenic Escherichia coli during acute and chronic urinary tract infection.</a> Infection and Immunity. 79, 4250-4259 (2011).</li><li>Keshtkar, A., Keshtkar, A., Lawford, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+morphological+parameters+of+the+human+urinary+bladder+(malignant+and+normal).">Cellular morphological parameters of the human urinary bladder (malignant and normal).</a> International Journal of Experimental Pathology. 88, 185-190 (2007).</li><li>Duraiswamy, S., Chee, J. L. Y., Chen, S., Yang, E., Lees, K., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Intracellular+Bacterial+Communities+during+Experimental+Urinary+Tract+Infection+Reveals+an+Abundant+and+Viable+Bacterial+Reservoir.">Purification of Intracellular Bacterial Communities during Experimental Urinary Tract Infection Reveals an Abundant and Viable Bacterial Reservoir.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2, 739-752 (2007).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+and+stochastic+allele+specific+gene+expression+in+single+mouse+blastomeres.">Deterministic and stochastic allele specific gene expression in single mouse blastomeres.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>Wells, J. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+mouse+endoderm+is+patterned+by+soluble+factors+from+adjacent+germ+layers.">Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers.</a> Development. 127, 1563-1572 (2000).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+DNA+methylome+landscapes+of+mammalian+cells+with+single-cell+reduced-representation+bisulfite+sequencing.">Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing.</a> Nature Protocols. 10 (5), 645-659 (2015).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+clonally+derived+chicken+embryonic+fibroblast+cell+line+(CSC)+with+high+transfection+efficiency+and+ability+as+a+feeder+cell.">The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell.">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nature Protocols. 5 (3), 516-535 (2010).</li><li>Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporation+of+Neurons.">Single-Cell Electroporation of Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2017).</li><li>Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Characterization+of+UTI+and+CAUTI+in+a+Mouse+Model.">Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), 52892 (2015).</li><li>Justice, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+developmental+pathways+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+urinary+tract+pathogenesis.">Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).</li><li>Mulvey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+Evasion+of+Host+Defenses+by+Type+1-Piliated+Uropathogenic+Escherichia+coli.">Induction and Evasion of Host Defenses by Type 1-Piliated Uropathogenic Escherichia coli.</a> Science. 282 (5393), 1494-1497 (1998).</li><li>Zhang, H., Susanto, T. T., Wan, Y., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mutagenesis+of+the+fimS+promoter+regulatory+switch+reveals+novel+regulation+of+type+1+pili+in+uropathogenic+Escherichia+coli.">Comprehensive mutagenesis of the fimS promoter regulatory switch reveals novel regulation of type 1 pili in uropathogenic Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), 4182-4187 (2016).</li><li>Gally, D. L., Bogan, J. A., Eisenstein, B. I., Blomfield, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+regulation+of+the+fim+switch+controlling+type+1+fimbrial+phase+variation+in+Escherichia+coli+K-12:+effects+of+temperature+and+media.">Environmental regulation of the fim switch controlling type 1 fimbrial phase variation in Escherichia coli K-12: effects of temperature and media.</a> Journal of Bacteriology. 175 (19), 6186-6193 (1993).</li><li>Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+Enhance+Male+Urinary+Tract+Infection+Severity+in+a+New+Model.">Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1625-1634 (2016).</li><li>Garofalo, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+from+Urine+of+Female+Patients+with+Urinary+Tract+Infections+Is+Competent+for+Intracellular+Bacterial+Community+Formation.">Escherichia coli from Urine of Female Patients with Urinary Tract Infections Is Competent for Intracellular Bacterial Community Formation.</a> Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).</li><li>Berry, R. E., Klumpp, D. J., Schaeffer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+cultures+support+intracellular+bacterial+community+formation+by+uropathogenic+Escherichia+coli.">Urothelial cultures support intracellular bacterial community formation by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 2762-2772 (2009).</li><li>Holden, N., Totsika, M., Dixon, L., Catherwood, K., Gally, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+P-fimbrial+phase+variation+frequencies+in+Escherichia+coli+CFT073.">Regulation of P-fimbrial phase variation frequencies in Escherichia coli CFT073.</a> Infection and Immunity. 75 (7), 3325-3334 (2007).</li><li>Jost, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+growth+of+the+mouse+bladder.">Postnatal growth of the mouse bladder.</a> Journal of Anatomy. 143, 39-43 (1985).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يسمح البروتوكول التي وصفناها لعزل للسوائب واحدة من طراز مورين من UTI. يعزل هذا البروتوكول الحاويات التي تحتوي على البكتيريا داخل الخلايا قابلة للحياة، والتي يمكن التحقق منها باستزراع لزيمبابوى. نتائج البروتوكول في البكتيريا داخل الخلايا من الحاويات مع القليل من التلوث بالبكتيريا خارج الخلية، مما يتيح لمزيد من الوصف لكل البكتيريا واستضافة الخلية من الحاويات الوسيطة للسوائب (الشكل 4ج). نحن نبين أيضا أن البكتيريا من الحَوسة واحدة يمكن استخدامها في تطبيقات المصب مثل قبكر (الشكل 4ج)، مما يوحي بأن لدينا تقنية يمكن استخدامها لعملية الحاويات لغيرها من التحليلات المختبرية. عن طريق تجميع البكتيريا تحصد من عدد قليل من 5 حاويات السوائب الوسيطة، كذلك نظهر قدرتنا على القيام بتحليل qRT PCR على ثلاثة جينات البكتيريا، مما يوحي بأن الجيش النيبالي الملكي نوعية جيدة يمكن أن تحصد من البكتيريا في أعمالنا الحاويات المعزولة (الشكل 4د). وتشير البيانات أننا أظهرنا جنبا إلى جنب، إلى أن إجراء تحليل الحمض النووي الريبي على نطاق الجينوم (مثل تسلسل الحمض النووي الريبي) على الحاويات واحد قد يكون من الممكن استخدام هذه التقنية العزلة.
في هذا البروتوكول، ركزنا على هذه النقطة مرة ح 6 لأن ذلك عندما أرقام الحَوسة ذروة في أكياس الفئران 6 أسود بالعدوى عن طريق UTI8927. وعلاوة على ذلك، استخدمنا أيضا نظام ثقافة بكتيرية ثابتة لتعزيز مستوى التعبير الهياكل نوع 1 في UTI89. التعبير عن الهياكل نوع 1 أمر حاسم كولاي إرفاقه وتصيب المثانة الخلايا الظهارية28. بيد أن هذا التعبير هو محكم التنظيم29 ومنبهات البيئية معروفة لتغيير ذلك30. من أجل الحفاظ على النمط الظاهري العدوى متسقة وعدد كاف من الحاويات، نوصي باستخدام ثقافة بكتيرية ثابت ح 2 × 24 (معدلة قليلاً من هونغ et al.8) والنقطة وقت الإصابة ح 6 عند العمل مع سبق اختباره كولاي سلالات مثل NU14 و UTI89،من2829. ومع ذلك، من الممكن أن هذه المتغيرات سوف تحتاج إلى تعديل في سلالات UTI الأخرى أو في غيرها سلالات الفئران للحصول على العدد المثالي للحاويات من كل عدوى.
بينما يستخدم البروتوكول من هونغ et al.8 فقط من الفئران الإناث، كانت البروتوكولات الأخرى المتبعة لوضع عدوى المسالك البولية في الفئران الذكور عنها31. في هذا النموذج، التهاب المثانة في الفئران الذكور أيضا يتبع مسار الحاوية. كما قربه الفئران الذكور والإناث متشابهة في الحجم، فإننا نتوقع أن بروتوكولنا العزلة الحَوسة يمكن أن تستخدم في ذكور الفئران المصابة، وكذلك.
كما يضمن بسيطة نسبيا التكنولوجيا المستخدمة في هذا البروتوكول أن يمكن نشرة في معظم المختبرات. واحدة من الخطوات الرئيسية التي تنطوي عليها في هذا البروتوكول هو سحب الشعيرات الزجاجية لإنشاء ميكروكابيلاريس لتحديد نوع الخلية للفائدة. هذه الخطوة تسمح بالمرونة في أقطار ميكروكابيلاريس التي تم إنشاؤها، وهكذا الأسلوب يمكن أن تمتد إلى أنواع متعددة من الخلايا المستهدفة المختلفة. بيد سبب الاختلاف المتأصل في خلق هذه الشعيرات الدموية، يجب الحرص على التأكد من أن القطر النهائي في مجموعة قابلة للاستخدام. إذا كانت الشعيرات الدموية ضيقة جداً، فشلوا في التقاط خلية الاهتمام، ولكن إذا كانت واسعة جداً، ويمكن تحديد عدة خلايا في محاولة واحدة. وعلاوة على ذلك، استخدام اللهب المكشوف خلال عملية سحب شعري يحمل خطر كامن للحروق والحريق، حيث ينبغي أن تأخذ الرعاية الباحث محاولة إنشاء ميكروكابيلاريس لمنع حدوث مثل هذه الأحداث. للحد من التفاوت، فضلا عن خطر الحرائق المفتوحة شاركوا في صنع هذه الشعيرات الدموية، الباحث يمكن أن تجعل استخدام ميكروبيبيتي التقليدية سحب الجهاز، مثل تلك المستخدمة للتجارب الكهربية (مثل PC-100، مجموعة ناريشيجي). كما تجعل هذه الآلات من الجاذبية أو منصات الروبوتية لسحب الشعيرات الدموية، وأنها يمكن أن تكون مصممة لتلبية احتياجات طراز العدوى. بيد أن مجموعة واسعة من ميكروبيبيتي سحب الآلات المتاحة سوف يعني أن الباحث الفردية سوف تحتاج إلى الذهاب من خلال بعض التجربة والخطأ لتحديد القطر الشعرية النهائية المناسبة للاستخدام مع هذا البروتوكول.
عرض البروتوكول يجعل استخدام البكتيريا معربا عن علامة نيون بصريا تحديد الحاوية. وبالتالي، يقتصر هذا الأسلوب الباحثين القدرة على تعديلها وراثيا للكائن الحي المعدية. على وجه التحديد لابيك، سلالات تشكيل الحَوسة مثل CFT073 و NU14 قد نجحت في تحويل مع الإعراب عن بروتينات فلورية خضراء والبلازميدات32،،من3334؛ ولذلك ينبغي أن تكون هذه قابلة للاستخدام في البروتوكول نفسه. استناداً إلى منطقة المثانة (70 مم2) الماوس35وطول الخلايا الظهارية الفردية (50-120 ميكرومتر)17، وتواتر الحاويات في مثانة واحد16، تقدير متحفظ للإصابة بالحاويات عن 1 في 1,000 الخلايا (أو 0.1%). ويعرض هذا التقدير فائدة بروتوكولنا عزل الخلية لاستهداف الأحداث النادرة. دقة تحديد الخلية من خلال موقعنا البروتوكول ومجموعة واسعة من أقطار الشعرية التي يمكن سحبها تشير إلى أنه يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل البكتيريا داخل الخلايا من نماذج أخرى في المختبر والمجراه في العدوى. وفي الواقع، نحن استخدمت بنجاح هذا الأسلوب لعزل الخلايا الظهارية المصابة المثانة المستزرعة (البيانات لا تظهر).
واحدة من أكثر تحديا من الناحية التقنية خطوات في البروتوكول هو عكس المثانة للكشف عن الخلايا الظهارية لإلغاء. وقد وجدنا أن من الممكن أيضا جعل شق على المثانة تباعد لإلغاء. ومع ذلك الواجب ينبغي الحرص على تقليل الأضرار بالخلايا الظهارية من المثانة خلال عملية قطع أنها مفتوحة؛ ومن الناحية المثالية ينبغي أن تستخدم قطع واحد تباعد فتح المثانة. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي الخفض في برنامج تلفزيوني الباردة، لمنع الفقدان العرضي للخلايا أو أنسجة المثانة أثناء العملية.
الفم بيبيتينج للحاويات في هذا البروتوكول يوفر مزيدا من السيطرة على عملية اختيار الخلية، فضلا عن الحد من الحجم النهائي للحل نقل جنبا إلى جنب مع الخلية. مراقبة غرامة وفصل كبير من حل من الفم الباحثين أيضا تكبير سلامة الباحث، نظراً للكميات المنقولة داخل نانولتر لمجموعة ميكروليتير. على النقيض من ذلك، أن تجربتنا مع ميكروبيبيتي الحديث أنه يميل إلى نقل المزيد من السائل المحيطة والخلايا مع الحَوسة، يحتمل أن تؤدي إلى تلوث بالبكتيريا لومينال خارج الخلية. كما أبلغ لنا الاستنتاج أن الفم بيبيتينج يوفر أداء أعلى على خلية واحدة أخرى أساليب العزل بأخرى مختبرات22،،من2324. وبصرف النظر عن عزل خلية مفردة، بيبيتينج الفم حتى استخدمت في خلية واحدة انهانسر للخلايا العصبية25، مما يدل على زيادة الفائدة والسيطرة الدقيقة التي يمكن تحقيق باحث مدربين مع التقنية. بيد أن السلامة من الأهمية ونقترح التدابير الإضافية المحتملة التي يمكن اتخاذها تبعاً لمسببات الأمراض المستخدمة: (ط) تمديد المخزن المؤقت الجوي بين الباحث والمواد البيولوجية، على سبيل المثال باستخدام يسفط ماصة بحجم أكبر (مثلاً، 5 مل)، أو (الثاني) إضافة عامل تصفية الجسدية مثل القطن والصوف إلى ماصة يسفط بمثابة عقبة إضافية.
وفي الحالات التي يؤدي فيها تقييم لمخاطر إلى الاستنتاج بأن بيبيتينج الفم لا تزال محفوفة بالمخاطر أيضا، يمكن الجمع بين الأجهزة الروبوتية المتاحة تجارياً (مثل تلك المستخدمة في نانوينجيكشنز) مع الأقسام الأخرى من لدينا تقنية لتوفير وسيلة أكثر أماناً عزل الخلايا المصابة من المختلطة السكان. تجدر الإشارة إلى أن تجربتنا مع استخدام ميكرومانيبولاتور روبوتية أظهر انخفاض معدل عزل الحَوسة مقارنة بيبيتينج الفم، كما أن التباين داخل تجريبية كبيرة في حجم الخلية الظهارية المثانة يجعلها صعبة للمستخدم الذراع الروبوتية لتحديد القوة المطلوبة لالتقاط واحدة من الحاويات. ومع ذلك، يبقى خياراً قابلاً للتطبيق، على الرغم من أن تكلفة، لأولئك الذين يعملون مع وكلاء المرض المعدي.

التهابات المسالك البولية (UTIs) واحدة من حالات العدوى البكتيرية الأكثر شيوعاً. من المتوقع أن تجربة واحدة على الأقل عدوى المسالك البولية (UTI) خلال بهم العمر1ما يقدر 40-50 ٪ من النساء. أحد العوامل الرئيسية ل UTI أوروباثوجينيك كولاي (أبيك)، التي تمثل أكثر من 70% من غير معقدة يوتيس2. وعلاوة على ذلك، سوف يكون الربع تقريبا من أولئك الذين لديهم UTI عدوى متكررة، غالباً بسبب نفس السلالة، على الرغم من العلاج بالمضادات الحيوية المناسبة3. ارتفاع عدد حالات UTI يمثل عبئا كبيرا على أنظمة الرعاية الصحية، تكلف أكثر من $ 2 بیلیون في السنة في الولايات المتحدة4. وعلاوة على ذلك، يؤدي استخدام المضادات الحيوية لعلاج يوتيس أيضا إلى ارتفاع معدلات المقاومة للمضادات الحيوية، وهو قلق رئيسيا لصحة العامة5.
ولذلك، وضعت جهدا كبيرا في فهم الآليات التي يصيب أبيك المسالك البولية، فضلا عن قدرته على تسبب التهابات متكررة6،،من78. على وجه الخصوص، قد استخدمت نموذج الفأر من العدوى لدراسة خصائص البكتيريا والمضيفة التي تسهم UTI8. هذا نموذج الفأر قد يعود بالنفع قابلة للتطبيق لسلالات السريرية غير معدلة المعزولة من المرضى البشر. كما أدى هذا النموذج إلى اكتشاف مسارات البكتيرية دروجابل محتملة هامة لإنشاء UTI، مثل النوع 1 الهياكل9 والحديد اقتناء نظم10.
بالمقارنة مع هذه النجاحات في دراسة الأحداث المبكرة في UTI، معرفة الآليات الكامنة وراء UTI المتكررة تزال مفتقدة11. فرضية واحدة هي أن أبيك يتهرب من العلاج بالمضادات الحيوية، ويسبب التهابات متكررة في المثانة عن طريق تشكيل المجتمعات داخل الخلايا البكتيرية (الحاويات) داخل الخلايا الظهارية المثانة. الحاويات قد حددت في نماذج مورين من العدوى وفي البشرية UTI المرضى12،13. ارتبط وجود حاويات السوائب الوسيطة في عينات البول من المرضى UTI الأطفال مع ارتفاع معدلات تكرار14،15. ومع ذلك، عزل حاويات السوائب الوسيطة ودراسة البكتيريا داخلها قد ثبت أن تحديا من الناحية التقنية نظراً لندرة بهم؛ يقدر أن مثانة مورين مصابة عادة فقط لديها 10 100 حاويات السوائب الوسيطة16. وعلاوة على ذلك، تكون الخلايا الظهارية المثانة كبيرة نسبيا (50-120 ميكرومتر)17، مما يجعل من تحدي لنشر الأسفار بمساعدة الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) نظراً لأن نموذجية نظام مراقبة الأصول الميدانية فوهات مصممة مع أقطار 70 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر. وبالتالي، غالباً ما تتم إزالة خلايا كبيرة مثل الخلايا الظهارية المثانة عن طريق الترشيح من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتجنب انسداد في فلويديكس.
ووصف لدينا مختبر مؤخرا طريقة عامة واقتصادا لعزل الخلايا المصابة نادرة من الخلائط مثل كشط الخلايا الظهارية من المثانة18. لعزل فعال حاويات السوائب الوسيطة، استخدمنا بيبيتينج الفم التقليدية. ميكروبيبيتينج الفم هو أسلوب الذي تم استخدامه منذ وقت طويل ميكرومانيبوليشن من الخلايا المفردة والأجنة لأغراض التحليل المصب19،20،21،،من2223، 24 , 25-بيبيتينج الفم التقليدية كميات سائلة كبيرة (في ملليلتر) كثيرا ما كان السبب المختبرية المتعلقة بالحوادث، والتقنية قد تم منبوذة عن حق بكثير من مجتمع البحث خارج علم الأجنة التقليدي و تطبيقات خلية مفردة. لدينا بروتوكول مستوحاة من الإصدارات خلية واحدة فقط من هذا الأسلوب19،20، التي تخفف من المخاطر بتوفير مخزن كبير (> 2 مل) نقل جوي بين الباحث وعينه مقارنة بحجم السائل (< 1 ميليلتر). يأخذ هذا الأسلوب أيضا ميزة التحكم غرامة هذا الفم ويوفر ميكروبيبيتينج، الذي يترجم إلى وحدة تخزين نهائي منخفضة المحيطة بالحل نقل ودرجة نقاء عالية من الخلايا المعزولة. الأسلوب الذي يستخدم مواد غير مكلفة (< 50 دولار)، وهكذا ينبغي أن يكون ممكناً تنفذ في جميع مختبرات.
ويصف هذا البروتوكول البصرية لدينا تقنية عزل الحاوية، توفير مرجع لمساعدة الباحثين الآخرين تسعى إلى تكرار هذا الأسلوب. الباحث بحاجة للوصول إلى مجهر تشريح الفلورسنت (أو معدات مماثلة) التي يمكن استخدامها لوضع تصور الخلايا الظهارية الفردية والبكتيريا الفلورسنت أثناء التصوير الحي، مع مرحلة تصوير مفتوحة ويمكن الوصول إليها من أجل ميكروبيبيتينج (انظر الجدول للمواد للاطلاع على تفاصيل المجهر المستخدمة، على الرغم من أن نماذج يعادل أداة أخرى يمكن أن تستخدم أيضا). بينما سيركز هذا البروتوكول على الحاويات في نموذج مورين UTI، ينبغي أن تكون أساليب مماثلة تنطبق على عزل الخلايا المصابة من تعليق خلية في نماذج أخرى من العدوى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:939px;" width="939">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5ml eppendorf tube</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:428px;">For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100% ethanol</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For Alcohol Burner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml conical tube</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1ml Tuberculin Syringe</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3% Bacterial Agar</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aesculap anatomic forceps</td>
			<td style="width:176px;">Braun/Kruuse</td>
			<td style="width:119px;">BD222R</td>
			<td>For initial dissection of mouse (skin, fascia)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcohol Burner</td>
			<td style="width:176px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">237070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirating pipette</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">357558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacterial loops</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td>Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical flasks</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digital camera for microscope</td>
			<td style="width:176px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">DP71</td>
			<td style="width:428px;">For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillaries</td>
			<td style="width:176px;">Kimax</td>
			<td style="width:119px;">6148K07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iris Scissors STR SS 110MM</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BC110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isoflurane (Isothesia)</td>
			<td style="width:176px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:119px;">29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td style="width:176px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">420311</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth (Miller)</td>
			<td style="width:176px;">Thermo/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10855021</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Light source unit for microscope</td>
			<td style="width:176px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">LG-PS2</td>
			<td style="width:428px;">For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lubricant&#160;</td>
			<td style="width:176px;">KY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any similar commercial medical lubricant will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Macro fluorescence microscope</td>
			<td style="width:176px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">MVX10</td>
			<td style="width:428px;">For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette + micropipette tips</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 1x</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette controller + Pipettes</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td style="width:176px;">BD Intramedic</td>
			<td style="width:119px;">427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Precision Glide needle 30G</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305107</td>
			<td>Possibly under new catalogue number (305106)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Splinter forceps curved</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BD312R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spray bottle (for ethanol)</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Square cuvettes</td>
			<td style="width:176px;">Elkay</td>
			<td style="width:119px;">127-1010-400</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterilgard III Advance Safety Cabinet</td>
			<td style="width:176px;">Baker</td>
			<td style="width:119px;">SG403</td>
			<td>Any biosafety cabinet with a UV irridiator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterilin 90mm Standard Petri Dish</td>
			<td style="width:176px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">101VR20</td>
			<td>Any sterile petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">OK366R</td>
			<td>Recommended for harvesting of bladder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Surgical Scissors STR S/B 105MM</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BC320R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810R</td>
			<td>Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">WPA C08000 cell density meter</td>
			<td style="width:176px;">Biowave (Biochrom)</td>
			<td style="width:119px;">80-3000-45</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of single intracellular bacterial communities generated from a murine model of urinary tract infection for downstream single-cell analysis

في هذه المقالة، نحن مخطط إجراء المستخدم لعزل فرادى المجتمعات البكتيرية داخل الخلايا من ماوس التي قد أصيبوا بالعدوى تجريبيا في المسالك البولية. يمكن تقسيم البروتوكول إلى ثلاثة أقسام: العدوى، وحصاد الخلايا الظهارية المثانة، والفم ميكروبيبيتينج لعزل الخلايا الظهارية المصابة الفردية. الخلية الظهارية معزولة تحتوي على خلايا جرثومية قادرة على البقاء وتقريبا خالية من تلوث البكتيريا خارج الخلية، مما يجعله مثاليا لتحليل خلية واحدة أسفل المجرى. الوقت المستغرق من بداية الإصابة للحصول على مجتمع البكتيريا داخل الخلايا واحد حوالي 8 ساعات. غير مكلفة لنشر هذا البروتوكول ويستخدم مواد متاحة على نطاق واسع، ونحن نتوقع أنها أيضا يمكن أن تستخدم في نماذج أخرى من العدوى عزل الخلايا المصابة واحدة من الخلائط الخلية حتى لو كانت تلك الخلايا المصابة نادرة. ومع ذلك، نظراً لخطر محتمل في الفم ميكروبيبيتينج، هذا الإجراء لا ينصح للعوامل المعدية جداً.

وبصرف النظر عن تأكيد وجود الحَوسة معزولة وحيدة في أنبوب جمع عبر مجهر تشريح (الشكل 3د)، يمكن أيضا تأكيد نقاء الحَوسة معزولة بالفحص المجهري [كنفوكل]. كما هو موضح في الشكل 4أ، الخلايا المعزولة أن وصمة عار لكل من كولاي وأوروبلاكين، والحجم المتوقع للحاويات (50-120 ميكرومتر)17. وعلاوة على ذلك، تلطيخ كولاي غير موجودة في السائل المحيطة بها. استناداً إلى البيانات المتوفرة لدينا، أكثر من 90% خلايا المعزولة بهذا الأسلوب هي حاويات السوائب الوسيطة18. بعد عزل، يمكن تأكيد وجود وبقاء الخلايا البكتيرية في الحاوية الفردية عن طريق مستعمرة تشكيل وحدة (زيمبابوي) التعداد (الشكل 4ب) أو الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR) لمعادلات الجينوم ( الشكل 4 ج). كما يوضح الشكل 4ج أن الخلايا الظهارية مصابة معزولة مع البروتوكول نفسه لا تملك المبالغ القابلة للقياس الكمي للبكتيريا. استناداً إلى هذه البيانات، فإننا نقدر أن طائفة كفوس في الحَوسة واحد هو 102-103 في نموذج مورين من عدوى المسالك البولية. أحد الأهداف الرئيسية لواحد الحَوسة العزلة إجراء تحليلات المصب مثل تسلسل الحمض النووي الريبي. للتحقق من أن لدينا طريقة العزل غير قادرة على الحصول على الحمض النووي الريبي من البكتيريا في حاويات السوائب الوسيطة للتحليل، أجرينا النسخ العكسي الكمية بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (قرة-PCR) التحديد الكمي للجينات الثلاثة (16S و سيوب، و فردا) مجموعة من الحاويات منفردة معزولة والمجمعة (الشكل 4د). تم تكييف جميع البيانات المبينة في الشكل 4 بإذن من دوريسوامي et al.18. نظرة عامة تخطيطي لدينا بروتوكول العزلة الحَوسة يتبين في الشكل 5، الذي يرد من دوريسوامي et al.18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig1.jpg"> الشكل 1 : سحبت يد الشعيرات الدموية الاحتفاظ الفتحات الضيقة. يتم عرض عينات (A) من الأنابيب الشعرية سحبت يده على خلفية سوداء للتباين. من أسفل إلى أعلى، شعري أونبوليد الشعرية التي سحبت لا بدرجة كافية، تظهر الشعرية التي يمكن أن تستخدم لحصاد المثانة وحيدة الخلية الظهارية، والشعرية التي تم سحب رقيقة جداً (وهكذا المنفصلين إلى قطعتين). يتم وضع مسطرة 15 سم في الجزء السفلي من الصورة للحجم. يتم الإشارة إلى هذه النقطة المقدرة لالتقاط قبالة الشعرية قابلة للاستخدام على الرقم السهم الأحمر. (ب) صورة يؤخذ مع مجهر تشريح يؤكد قطرها الداخلي جوفاء شعري سحبت (أسفل). يتم وضع أونبوليد الشعرية أعلاه تثبت الفرق الحجم النسبي الشعيرات الدموية اثنين. شريط المقياس = 4.0 مم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig2.jpg"> الشكل 2 : تشريح للماوس لحصاد الخلايا الظهارية المثانة. (أ) صورة لماوس مع خطوط بيضاء إضافة للإشارة إلى موقع المقدرة وزاوية من شقوق لكشف التجويف الصفاقى مورين والمثانة. (ب) صورة من يتعرض الماوس التجويف الصفاقى بعد انتهاء الشق. (ج) صورة من يتعرض المثانة (السهم الأحمر) بارزة بين منصات الدهون. (د) صورة من المثانة موريني بطرف الملقط إدراجها في التجويف، مع أسهم تشير إلى اتجاه الحركة اللازمة لعكس المثانة. يتم أولاً سحب المثانة قليلاً إلى الخارج، ثم حول وخارج المنجم الأول الملقط. بناء على توجيهات الحركة لكل الإجراءات كما هو مبين بالأسهم البيضاء المرقمة 1 و 2. (ه) صورة تبين الموقف النهائي من المثانة المقلوب إدراجه في الفتحة الثانية الملقط. تتم تسمية في مهاوي الملقط في كلا الفريقين د وه مع الأسهم الحمراء والنص. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig3.jpg"> الشكل 3 : IBC الحصاد من خلايا المثانة. (أ) مثانة المصابة ومقلوب في حل برنامج تلفزيوني الباردة قبل إلغاء الخلية. (ب) صورة تبين كشط خلايا المثانة كما يرى تحت مجهر. يمكن التعرف على الحاويات المجاميع الفلورية الخضراء الكبيرة في كلا الصورتين (انظر الأسهم الحمراء). (ج) صورة من المكتملة الفم ميكروبيبيتينج الجهاز. يتم تعريف ماصة يسفط ونصيحة ماصة، أنبوب المضخة، وسحبت أنبوب شعري مع الأسهم المرقمة كما هو مبين على الحق. (د) صورة وحيدة معزولة الحَوسة داخل أنبوب جمع 1.5 مل (المشار إليها باللون الأحمر). أشرطة مقياس (كما هو موضح) هي ممثلة بخطوط بيضاء في لوحات ألف باء ودال <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig4.jpg"> الشكل 4 : IBCs المقطوع نقية، ويمكن أن تستخدم لتحليل المتلقين للمعلومات- لقد تم تعديل هذا الرقم مع إذن من دوريسوامي et al18. (أ) الصور من خليتين من بروتينات فلورية خضراء-الإيجابية المعزولة التي كانت ملطخة بمكافحة أوروبلاكين ومضادات الأجسامالقولونية . الخلية الأولى (IBC 1) صور قنوات الفردية (في التكبير المنخفض) على اليسار، وصورة مدمجة عالية التكبير على الحق. الخلية الثانية (IBC 2) يرد في تضخم عالية في القنوات المدمجة والفردية. أشرطة مقياس كما هو مبين. الحمض النووي هو الملون مع 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) والممثلة في القناة الزرقاء. مضاداتكولاي هي ملطخة بجسم ثانوي مترافق إلى fluorescein isothiocyanate (فيتك)، وتمثل في قناة الأخضر. مكافحة--أوروبلاكين هو ملطخة بجسم ثانوي يضاف إلى تيتراميثيلرهوداميني isothiocyanate (تريتك)، وتمثل في القناة الحمراء. (ب) "كفوس البكتيرية" من الحاويات المعزولة. حاويات السوائب الوسيطة كانت معالجتها فورا، أو المحتضنة في 0.1% تريتون-X ل 10 أو 30 دقيقة التهم "زيمبابوي المجمعة" من الحاويات الفردية المعزولة من n = 3 يبين تجارب منفصلة. الحد الأقصى لكشف = 0.7 سجل10 كفوس/الحاوية. تبين نقاط حمراء المرسومة في الحد من الكشف عن العينات التي تم انتشال لا المستعمرات. جميع العينات المحتوية على الحَوسة لا تختلف اختلافاً كبيرا (p > 0.05، اختبار مان-ويتني)؛ الخلايا الظهارية مصابة تختلف اختلافاً كبيرا عن البيانات الحاوية (10 دقيقة) (ف < 0.001، اختبار مان-ويتني). (ج) qPCR الكمي للبكتيريا على الحاويات الفردية والخلايا الظهارية مصابة بعد حضانة 10 دقيقة في 0.1% تريتون العاشر (*، ف < 0.0001، اختبار مان-ويتني، n = 4). الحد الأقصى لكشف = 1.18 سجل10 الجينوم البكتيري مكافئات/الحاوية. تشير النقاط الحمراء إلى العينات التي تم انتشال لا المستعمرات في تيتيرينج في لوحة (ب) (د) الكمي للجينات الرنا الريباسي، سيوب، و فردا 16S لإعداد متفاوتة من الحاويات منفردة معزولة والمجمعة (n = 1 التجربة؛ وكل تشير إلى متوسط 3 replicates التقنية). NC = أي سيطرة الحمض النووي سلبية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig5.jpg"> الشكل 5 : تخطيطي والصور المرتبطة به يمثل عزل الحاويات عن طريق الفم ميكروبيبيتينج من قربه الفئران المصابة. ويرد هذا الرقم من دوريسوامي et al.18. (أ) بحصاد المثانة كاملة؛ (ب) المقلوب المثانة كله تعريض بروتينات فلورية خضراء معربا عن الحاويات؛ (ج) عن قرب من حافة المثانة كشط عرض الحاويات الفردية في تعليق في المخزن المؤقت المتاخمة؛ (د) وحيدة معزولة الحَوسة بيبيتيد في أنبوب. الأسهم الحمراء في لوحة ب الإشارة إلى أمثلة من الحاويات الحاملات للتجارة والنقل على سطح لومينال المثانة. خط منقط أحمر في لوحة ج يشير إلى الحد الأيمن للمثانة مقلوب (المشار إليها بوصفها "BL")؛ وتبين الأسهم الحمراء في لوحة ج الظاهر الفردية بروتينات فلورية خضراء-إيجابية الخلايا الظهارية التي قد تم كشط قبالة سطح المثانة. يشير الخط المنقط أبيض في لوحة د معالجة تجميعية ميكروليتير فرعية ميكروبيبيتيد التي تحتوي على حاوية وسيطة للسوائب معزولة، يشار بشكل سهم أبيض. تغيير حجم أشرطة = 2 مم- <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis at JoVE.c

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل الخلايا الظهارية واحد، وإصابة المثانة من طراز مورين من عدوى المسالك البولية.

عزل واحد المجتمعات البكتيرية داخل الخلايا التي تم إنشاؤها من نموذج موريني لعدوى المسالك البولية لتحليل خلية واحدة أسفل المجرى

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

وقد لوحظت المجتمعات البكتيرية داخل الخلايا، أو الحاويات الوسيطة، في الفئران التي أعطيت التهابات المسالك البولية التجريبية، أو التهابات المسالك البولية. كما أنها شوهدت في رواسب البول من المرضى UTI الإنسان. التقنية التي نوصفها اليوم هي طريقة لعزل IPCs واحدة من الفئران المصابة تجريبيا.تقنية الخفق المجهري للفم هي التقنية الوحيدة المتاحة حاليًا لعزل البكتيريا داخل الخلايا من مثانات الماوس المصابة. لإعداد ماصات الفم الزجاجية ، قرصة بحزم طرفي أنبوب الشعرية الزجاجية وتدوير بالتساوي منتصف الأنبوب ذهابا وإيابا على طول محورها على مصدر اللهب المفتوح. عندما يصبح الزجاج لينة، وإزالة الشعيرات الدموية من مصدر الحرارة وسحب الزجاج على الفور بعيدا.الطول النهائي المثالي للشعر الشعري المسحوب هو ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات أطول من الشعيرات الدموية دون عقاب لضمان قطر داخلي مناسب لعزل الخلايا الظهارية المفردة في المثانة. عندما يبرد الزجاج، تحقق لمعرفة ما إذا كان منتصف الشعيرات الدموية الزجاجية أضيق وأن الجزء الداخلي من الأنبوب لا يزال أجوف. التقاط نهاية كبيرة من الشعيرات الدموية سحبت بيد واحدة، واستخدام ملقط لفهم ما يصل شعرية في أضيق نقطة لها، والتأكد من أن تمارس ملقط مع ما يكفي من القوة لقبضة الشعيرات الدموية بحزم دون سحق ذلك.تطور بسرعة ملقط لالتقاط الشعيرات الدموية سحبت في أضيق نقطة. ثم، ضع الشعر الشعري بحجم ميكروبيت الفم في طبق بيتري عيار 100 ملليمتر وقم بتعقيم الطبق للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. لحصاد المثانة، ضع فأرًا في موضع الوبين وأعقم منطقة البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول.باستخدام ملقط الإيثانول المعقم والمقص الجراحي، وجعل شق الجلد عرضية سنتيمتر واحد الأولية فوق فتحة مجرى البول وتوسيع شق قطريا نحو الأطراف العليا من الماوس لخلق قطع على شكل حرف V على طول الأمامي بأكمله من الماوس الذي يعرض محتويات الصفاق. باستخدام أدوات جديدة معقمة، ادفع بلطف على منصات الدهون بالقرب من منطقة الحوض من الماوس للتسبب في المثانة لبرز وفهم المثانة المكشوفة في القمة. الحفاظ على قبضة صارمة على المثانة، وقطع الحالب ومجرى البول لتحرير المثانة وإدراج غيض من رمح واحد من ملقط مدورة في فتحة المثانة حيث كان مجرد incised.الافراج عن ملقط تجتاح قمة والحفاظ على ملقط مدورة مغلقة تماما تقريبا، واستخدام زوج الثاني من ملقط لسحب بلطف الطرف الخارجي للمصب من المثانة بعيدا عن ملقط مدورة وحولها وعلى الطرف الآخر من ملقط مدورة لتحويل المثانة الداخل إلى الخارج. ثم، استخدم الزوج الثاني من ملقط لاقناع بلطف المثانة المقلوبة من غيض من ملقط في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة. وكشط بلطف طبقة الخلية الظهارية الداخلية على السطح الخارجي للمثانة المقلوبة مع اثنين من أزواج من ملقط نظيفة.عندما تم كشط جميع الخلايا، إدراج نهاية دون عقاب من الشعرية الزجاجية سحبت في المكونات المطاطية من أنبوب الpirator وتناسب بإحكام الطرف الضيق من طرف ماصة ملليلتر واحد في الطرف الآخر المفتوحة من الأنبوب. تناسب بإحكام الطرف الضيق من ماصة التعرق ملليلتر اثنين في مفتوحة, نهاية أوسع من طرف ماصة ملليلتر واحد ووضع تعليق الخلية كشط تحت مجهر تشريح. باستخدام التكبير 20 إلى 40X، وتحديد الحاويات الوسيطة للسوائب التراكمات الفلورية الكبيرة وتراجع نهاية غرامة من الشعرية الزجاجية في أنبوب جديد من برنامج تلفزيوني لثانية واحدة للحد من امتصاص حجم غير المرغوب فيها من خلال العمل الشعري.عندما تم تحديد موقع IBC من الفائدة، ببطء جلب الطرف المفتوح من أنبوب الشعرية نحو IBC وتطبيق قوة شفط صغيرة جدا على ماصة التعرق لتوجيه IBC في الشعرية الزجاجية. ثم، نقل الشعيرية إلى أنبوب جهاز طرد مركزي فارغ 1.5 ملليلتر وتطبيق ضغط إيجابي طفيف لطرد القطرة وBC في الأنبوب. بالإضافة إلى تأكيد وجود IBC معزولة واحدة في أنبوب جمع عن طريق المجهر تشريح، يمكن تأكيد نقاء IBC معزولة عن طريق المجهر confocal.الخلايا المعزولة يجب أن تلطخ لكل من الإشريكية القولونية والأروبليكين وينبغي أن يكون ما بين 50 و 120 ميكرومتر في الحجم. بعد العزل، يمكن تأكيد وجود وديمومة الخلايا البكتيرية في IBC الفردية من خلال مستعمرة تشكيل وحدة الكم أو الكم البوليميراز سلسلة التفاعل لمعادلات الجينوم. وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا الظهارية غير المصابة المعزولة مع نفس البروتوكول لا تثبت كميات قابلة للقياس الكمي من البكتيريا.وعلاوة على ذلك، الكمّيّة النسخ العكسيّة البوليمرات تحليل تفاعل سلسلة يؤكّد وجود الجينات الجرثومية في مجموعة من الحاويات الوسيطة المعزولة والمجمّعة بشكل فردي. تأكد دائما من أن الفم micropipette يمكن التقاط وطرد السائل بسهولة. لا تتردد في تغيير الشعيرات الدموية أو الجهاز بأكمله إذا كان الفم micropipette يشعر occluded.تسمح لنا تقنية الخفق المجهرية هذه بدراسة السكان داخل الخلايا التي تتشكل خلال عملية UTI تجريبية. بدون هذه التقنية، تلك التجمعات داخل الخلايا ستكون ملوثة بالبكتيريا خارج الخلية و يفوقها عدد يفوقها. قد تكون بعض العوامل المعدية الأخرى أكثر سهولة أو تنتقل من الإشريكية القولونية التي استخدمناها في هذا التطبيق.في هذه الحالات، قد يكون هناك بعض عناصر التحكم الإضافية لذلك مبرر، مثل إضافة عامل تصفية أو توسيع الأنابيب، اعتماداً على التطبيق قيد الاستخدام. ويمكن بعد ذلك استخدام الحاويات الوسيطة الوسيطة المعزولة باستخدام تقنية الخفق المجهرية هذه في تحليلات الخلايا المفردة الأخرى في المصب، مثل QRTPCR أو تسلسل الحمض النووي الريبي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

عبر الاحليل تحريض العدوى ماوس المسالك البولية

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

وحيد الخلية تحليل<emالعصوية الرقيقة> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

العزلة وتحليل الجينوم Virions واحدة باستخدام &#39;جينوم فيروس واحد&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

عزل الخلايا اللمفاوية من المسالك التناسلية الماوس الغشاء المخاطي

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

القياسات خلية واحدة من تمزق رغوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

إعداد وحيدة الخلية تعليق لتحليل Cytofluorimetric من المناطق الجلد ماوس مختلفة

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

عدوى المسالك البولية في نموذج حيوانات صغيرة: قسطرة Transurethral من الفئران الذكور والإناث

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...