Name: isolation of single intracellular bacterial communities generated from a murine model of urinary tract infection for downstream single-cell analysis
Uploaded: 2019-04-16T12:30:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis at JoVE.c

Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Research Foundation, Büro des Premierministers Singapur unter seiner NRF Research Fellowship Scheme (NRF award keine. NRF-RF2010-10); der Singapur Ministry of Health National Medical Research Council (NMRC/CIRG/1358/2013); und die Genome Institute of Singapore (GIS) / Agency for Science, Technology and Research (A * STAR).

Alle Methoden, die hier beschriebene Tier Umgang haben institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Genome Institute of Singapore und Biological Resource Center der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung, Singapur gebilligt.
(1) Maus-Infektion
<ol><li>
Vorbereitung von Glaskapillaren
	<ol>
<li>Lichtquelle für eine offene Flamme (Bunsenbrenner oder Alkohol Brenner).</li>
		<li>Halten Sie ein Glas von beiden Enden fest kneifen Kapillare mit beiden Händen, dann erhitzen Sie die Mitte des Rohres gleichmäßig, bis das Glas weich geht. Drehen Sie die Kapillare sanft hin und her entlang seiner Achse um gleichmäßige Erwärmung des Glases zu helfen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Glas-Kapillare von der Wärmequelle zu und sofort ziehen Sie Hände auseinander, unter Beibehaltung der Griff an beiden Enden des Rohres. Die ideale endgültige Länge der gezogenen Kapillare ist 3-5 cm länger als ein unpulled Kapillare zu einen entsprechenden Innendurchmesser zur Isolierung von einzelnen Blase Epithelzellen zu gewährleisten. Vorsicht: Der Schlauch bleibt extrem heiß für einen bestimmten Zeitraum hinweg, also die Kapillare beiseite auf eine Hitze-Safe-Oberfläche für ein paar Minuten abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
		<li>Überprüfen Sie hohl um festzustellen, ob die Mitte der Glas-Kapillare geworden ist schmaler (Abb. 1A) und, dass das Innere des Rohres nach wie vor (Abbildung 1B). Zur Isolierung von IBC ist eine Bohrung von 200-400 µm verwendbar.</li>
		<li>Wählen Sie ein Ende der Kapillare mit einer Hand gezogen. Halten Sie ein paar Zangen mit der anderen Hand und verwenden Sie, um die gezogenem Glas Kapillare an ihrer schmalsten Stelle abholen. Stellen Sie sicher, dass die Zange mit genug Kraft, um die Kapillare Griff fest ohne zerkleinern es ausgeübt werden.</li>
		<li>Verwenden Sie eine schnelle Drehbewegung durch die Hand mit der Zange gezogene Kapillare an der schmalsten Stelle erstelle ich ein Mund Micropipetting Kapillare Snap. Hinweis: Mit Fingern statt Zange ist auch akzeptabel, solange ausreichender Schutz vor Glasscherben verwendet wird.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2-1.1.6 mindestens 4 x mehr zu produzieren genügend freie Micropipetting Kapillaren und bieten eine Reihe von Durchmessern für IBC-Isolierung. Wenn mehr als eine Infektion Gruppe zu rechnen ist, bereiten Sie 5 zusätzliche Micropipetting Kapillaren für jede zusätzliche Infektion-Gruppe. Vorsicht: Vergessen Sie nicht, die offene Flamme abschalten.</li>
		<li>Legen Sie die gezogenen Kapillaren in einem 100 mm Petrischale und setzen Sie die Schale, UV-Bestrahlung für 30 min um die Kapillaren zu sterilisieren.</li>
		<li>Setzen Sie den Deckel auf der Petrischale nach UV-Sterilisation und lagern Sie die Petrischale mit den Kapillaren bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Katheter vor der Infektion
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<li>Infektion wie Hung Et Al.8 und Conover Et Al.26 bis spätestens einen Tag vor der Infektion im bereiten Sie urinausscheidenden Katheter vor.</li>
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</li>
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Vorbereitung der fluoreszierenden adhärent E. Coli Kultur
	<ol>
<li>Wachsen die ausgewählten Fluorophor exprimierenden adhärent bakterielle Belastung nach etablierte Protokolle. Hinweis: Die Wahl der Sorte und Fluorophor hängen wesentlich von Mikroskop und Stämme, die in den einzelnen Labors zur Verfügung. In diesem Beispiel verwenden wir eine Sorte stammt aus UTI89, die eine klinische Isolat ursprünglich von einem Patienten mit rezidivierenden Zystitis. Dieser Stamm, SLC-638, trägt einen Plasmid (pSLC-77), die VsfGFP-9 und Kanamycin-Resistenz-18ausdrückt. SLC-638 wächst in LB Brühe bei 37 ° C mit 50 µg/mL Kanamycin ergänzt.</li>
		<li>Streifen Stamm SLC-638 auf eine Luria Bertani (LB)-Agarplatte mit 50 µg/mL Kanamycin ergänzt. Über Nacht inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C.</li>
		<li>(Optional) Zeigen Sie die Platte auf dem sezierenden Mikroskop, den Ausdruck der fluoreszierenden Marker vor der Auswahl einer Kolonie zu bestätigen.</li>
		<li>Mit einer bakteriellen Impfschlinge übertragen Sie die ausgewählten Kolonie, eine konische 125 mL-Flasche mit 10 mL LB-Brühe mit 50 µg/mL Kanamycin ergänzt. Inkubieren Sie die Küvette statisch bei 37 ° C für 24 h.</li>
		<li>Subkultur ergänzt die Bakterien aus dieser Flasche 10 µL der Kultur aus der Flasche und verdünnt es in 10 mL LB-Brühe mit 50 µg/mL Kanamycin in einem frischen 125 mL-Kolben (eine Verdünnung von 1: 1000). Inkubieren Sie dieses zweite Fläschchen statisch bei 37 ° C für ein weiteres 24 h.</li>
		<li>Spin-down die Bakterienkultur für 5 min bei 5.000 X g und 4 ° C.</li>
		<li>Den Überstand abgießen und Aufschwemmen der bakteriellen Pellets in kaltem PBS bei OD600 von 0,5. Hinweis: Obwohl es von Kultur zu Kultur unterschiedlich sein kann, in der Regel 1 mL der statische Kultur gibt etwa 4-5 mL OD600 = 0,5 Bakterienkultur. Das Gesamtvolumen der bakterielle Inokulum benötigt für jede Belastung kann wie folgt berechnet werden: 50 µL für jede Maus und 50 µL ist erforderlich für das Füllen der Nadelkopf. Weitere 10-20 % (mindestens 50 µL) des Inokulums empfiehlt sich Totvolumen in der Spritze zu berücksichtigen.</li>
		<li>Verwenden Sie die restliche bakterielle Mischung, um Infektion Titer zu bestimmen, wie in Hung Et Al.8beschrieben. Hinweis: Dieser Schritt kann für ein paar Stunden verzögert werden, durch die Speicherung der bakteriellen Mischung bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mausmodell der Infektion der Harnwege
	<ol>
<li>Die Mäuse zu infizieren, wie beschrieben von Hung Et Al.8, mit einer experimentellen Gruppe für jede Belastung von fluoreszierenden E. Coli in Abschnitt 1.3 kultiviert. Hinweis: Siehe auch Conover Et Al.26 für visuelle Unterstützung.</li>
		<li>Notieren Sie die Zeit der bakteriellen Impfung für die Maus oder den Käfig.</li>
		<li>Wiederholen Sie Infektionen für die gesamte experimentelle Gruppe. Hinweis: Die Infektion Katheter kann für alle Mäuse in der gleichen Gruppe wiederverwendet werden.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1-1.4.3 für jede experimentelle Gruppe geplant, um sicherzustellen, dass eine frische Katheter und neue Gleitgel ist für jede Gruppe bereit. Hinweis: Für Experimente mit einer großen Anzahl von Tieren es empfiehlt sich, die Tiere in Gruppen von fünf Teilen und Staffelung der Infektionen, so dass jede Gruppe ist infiziert, etwa 30 min bis 1 h auseinander. Dies bietet genügend Zeit für die folgenden Schritte (§ § 2 und 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Blase Epithelzelle Ernte um eine Zellsuspension zu erhalten
<ol><li>
Ernte und invertieren murine Harnblasen
	<ol>
<li>Bereiten Sie drei 50 mL konische Röhrchen gefüllt mit 45 mL 70 % igem Ethanol für die Sterilisierung der OP-Ausstattung.</li>
		<li>Legen Sie in zwei der Rohre in 2.1.1 Schritt vorbereitet eine Schere und ein paar Zangen jedes. Legen Sie zwei Paare von Zangen (eine vorzugsweise schmaler und mit einer abgerundeten Spitze, für die Inversion der Blase) in der dritten Röhre. Hinweis: Die Werkzeuge in der ersten Röhre auf der äußeren Region verwendet werden, die Werkzeuge in der zweiten werden in die Blase Ernte verwendet werden, und die beiden Paare von Zangen in den letzten Rohr wird verwendet in der Blase Umkehrung.</li>
		<li>Um 6 Uhr nach Infektion, einschläfern der infizierten Mäusen nach der Institution etablierte IACUC Protokolle. Hinweis: Unser IACUC-Protokoll erfordert Euthanasie durch zervikale Dislokation durchgeführt, während die Maus unter Narkose (Isofluran) ist.</li>
		<li>Die Tiere flach auf dem Rücken und mit einer Sprühflasche gefüllt mit 70 % Ethanol um ihren Bauchbereich zu sterilisieren.</li>
		<li>Mit einer Zange und chirurgische Scheren aus der ersten Röhre (vorbereitet in Schritt 2.1.2), öffnen machen einen kleinen quer-Schnitt auf der Haut ca. 1 cm über die Harnröhre. Den Schnitt schräg in Richtung der oberen Gliedmaßen der Maus erweitern, erstellen einen v-förmigen Schnitt entlang der gesamten vorderen der Maus, die den Inhalt des Bauchfells aussetzt. Stellen Sie sicher, dass während dieses Vorgangs die Schere nicht durch den Darm der Maus (Abbildung 2A, B) schneiden.</li>
		<li>Wechseln Sie in den zweiten Satz von Werkzeugen (vorbereitet in Schritt 2.1.2). Drücken Sie die Klingen der Schere oder die Wellen der Zange verwenden, vorsichtig auf die Fettpolster in der Nähe der Beckenregion der Maus. Hinweis: Dieser Schritt bewirkt, dass die Blase nach außen vorstehen und sorgt für Sichtbarkeit für die Ernte.</li>
		<li>Greifen Sie die freiliegende Blase an der Spitze mit einer Zange (Abb. 2C).</li>
		<li>Halten einen festen Griff auf die Blase mit der Zange, geschnitten und frei die Blase vom Rest des Tieres (wegschneiden der Harnröhre und Harnleiter) mit der chirurgische Schere. Nicht entbinden die Zange hält die Blase noch.</li>
		<li>Der Wechsel von der Schere zu schmaler abgerundeten Pinzette aus der dritten konische Rohr (aus Schritt 2.1.2), führen Sie die Spitze von einer Welle von den abgerundeten Pinzette in die Öffnung der Blase, wo es nur im vorherigen Schritt (Abbildung 2D) geschnitten wurde. Lassen Sie mit der Spitze eines der abgerundeten Pinzette sicher in die Öffnung der Blase eingelegt das Paar der Zange greifen die Spitze der Blase und mit dem zweiten konischen Rohr zurück.</li>
		<li>Das zweite Paar der Zange aus dem dritten Röhrchen vorsichtig drehen Sie mit der Blase "inside out", zuerst ziehen die äußere Ende von der Mündung der Blase Weg von den abgerundeten Pinzette (Abbildung 2D, Pfeil 1) und Führung, um und über die andere Spitze des die abgerundeten Pinzette (Abbildung 2D, Pfeil 2). Hinweis: Die Aktion kann eine Socke aus einem Fuß entfernen und ziehen Sie ihn über den anderen verglichen werden.<ol>
<li>Pflegen Sie bei der Inversion das erste abgerundete paar Zangen fast vollständig geschlossen. Dies bietet genügend Bewegungsfreiheit, die Blase von der ersten Welle der abgerundeten Pinzette abziehen aber auch der erste die zweite Welle des abgerundeten Pinzette näher bringt und ermöglicht für die Blase leicht übertragen werden. Das endgültige Ergebnis dieses Schrittes ist, dass die Blase wird invertiert und an der Spitze der zweiten Welle des ersten Paares der Zange (Abb. 2E) enden soll.</li>
			<li>Koax mit dem zweiten Paar Zangen, sanft die invertierte Blase aus der Spitze von der Zange in 1 mL kaltem PBS. Hinweis: (Optional) Dies ist der Zeitpunkt für Bildaufnahmen des gesamten invertiert, infizierte Blase, die allgemeine Häufigkeit und Verteilung von IBCs, ggf. zu beobachten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.10 für jede Blase in der experimentellen Gruppe (bis maximal fünf Tiere).</li>
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</li>
	<li>
Blase Epithelzelle Schaben
	<ol>
<li>Mit zwei Paaren der Zange reinigen, sanft die Außenseite der invertierten Blase (das ist der interne epitheliale Zellschicht) kratzen. Die umliegenden PBS erscheint trüber als Erlös Schaben und Epithelzellen in der PBS-Lösung freigesetzt werden.</li>
		<li>(Optional) Bestätigen Sie visuell, dass die Blase Schaben Zellen in Lösung mit einem sezierenden Mikroskop freigegeben hat. Abbildung 3 " A, B). Der PBS erscheint bewölkt mit dem bloßen Auge, und die ausgekratzte einzelne Blase Epithelzellen können man bei 10-facher Vergrößerung.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritte 2.2.1-2.2.2 für jeden geernteten Blase aus Schritt 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) intrazelluläre bakterielle Gemeinschaft (IBC) Isolierung: Mund Pipettieren von IBCs
Hinweis: Alle in diesem Abschnitt beschriebene Methoden haben eine institutionelle Risikobewertung unterzogen. Mund pipettieren, trägt das Risiko der Einnahme der Lösung, die übertragen wird. Dieses Risiko ist weitgehend entgegengewirkt, indem die Nanoliter-Volumes, die dieses Protokoll verwendet, und wir empfehlen, dass alle Nutzer des Pay-Protokoll auf, das Vorsorgeprinzip und Praxis Notizen, hier und in der Diskussion aufgelistet.
<ol><li>
Nach der Zellen haben in der PBS, richten Sie den Mund Micropipetting Apparat (Abb. 3C) abgekratzt worden.
	<ol>
<li>Legen Sie das dickere Ende von gezogenem Glas Kapillare (unpulled Ende) in den Gummistopfen (weiße Ende) der Absauganlage Röhre.</li>
		<li>Legen Sie das schmale Ende einer Pipettenspitze 1 mL in das andere offen (rot) Ende des Rohres Absauganlage, sicherstellen, dass Sie ein festen Sitz.</li>
		<li>Legen Sie das schmale Ende einer 2 mL Pipette in das offene, breiteren Ende des die Pipettenspitze 1 mL Absaugen, wieder sicherstellen, dass es eine enge Passform. Hinweis: Die daraus resultierende Einrichtung ermöglicht es den Forscher Mund Pipette aus größeren, offenen Ende der Absaugnadeln Pipette eine schonende Saugkraft aus dem schmalen Ende des Kapillarröhrchens am anderen Ende des Apparates zu erstellen.</li>
		<li>Testen Sie den endgültigen Mund Micropipetting Apparat mit einer 100 mm Petrischale mit entionisiertem Wasser. Eine leichte Saug Wirkung auf das offene Ende des Absaugnadeln Pipette (ähnlich wie bei einem Getränk mit einem Strohhalm schlürfen) sollte erhöhen das Niveau der Flüssigkeit in der Kapillare, aber nicht dazu führen, dass die deionisiertes Wasser bis zum Überlauf in den Sauger Schlauch. Verwenden Sie einerseits um das Kapillarrohr zu steuern, während mit der anderen Hand um die Position der Petrischale. Hinweis: Die Stärke des Saugens erforderlich für eine einzelne IBC Mund-Pipettieren variiert unter den Forschern. Jedoch wird empfohlen, dass jeder Forscher versuchen, diese Technik mit einer schwachen Absaugung beginnen und langsam zu erhöhen, wenn keine Flüssigkeit auf die Kapillare fließt. Es gibt keine Notwendigkeit für eine Kraft größer ist als das Saugen an einem Strohhalm zum trinken. Erscheint die Kapillare nicht Abholung Flüssigkeit während des Tests in Schritt 3.1.4, ist es möglich, dass die Kapillare oder die Absaugnadeln Röhre verschlossen ist und muss ersetzt werden. Weiterhin wird empfohlen, alle neuen Forscher erste Praxis controlling saugen in den Mund Pipettieren Apparat mit Wasser sterilisiert. Darüber hinaus beachten Sie, dass die Steuerung der Lautstärke durch den Mund Pipettieren Apparat aufgenommen durch den Einsatz des Forschers Zunge. Die Zunge kann fein passen Sie die Stärke des Saugens angewendet sowie fungieren als Not-aus.</li>
		<li>Testen Sie nach dem Erreichen der erfolgreichen Aufnahme der Flüssigkeit, die Möglichkeit, es aus der Kapillare zu vertreiben, indem man sanft in das offene Ende des Absaugnadeln Pipette bläst. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen entstehen bei der Ausweisung der Flüssigkeit um die IBCs während Schritt 3.5 zu verhindern. Hinweis: Wie wird die Stärke der Überdruck angewendet, indem die Forscher die IBC in die Zentrifugenröhrchen zu vertreiben mit Absaugung, unter den Forschern variieren. Es empfiehlt sich für Forscher neue dieses Protokolls zur Praxis Schritt 3.1 ein paar Tage vor der eigentlichen Infektion. Ein Vorschlag für Praktizierende Mund Micropipetting ist zu üben, die Übertragung von Kleinmengen sterilisierten Wasser gemischt mit ein paar Tropfen Lebensmittelfarbe (für Sichtbarkeit) mit dem Mund Mikropipette Vorrichtung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die ausgekratzte Zellsuspension unter dem sezierenden Mikroskop und identifizieren Sie die IBCs als großen fluoreszierende Aggregaten (Bild 3A, B). Das ideale Angebot der Vergrößerung ist 20-40 X. Tauchen Sie die feine Ende des Glases Kapillare in ein frisches Gefäß von PBS für 1 s, die Aufnahme von unerwünschten Volumen durch Kapillarwirkung zu reduzieren.</li>
	<li>Blick durch das Mikroskop, identifizieren Sie das IBC von Interesse zu und langsam das offene Ende des Kapillarröhrchens auf der IBC. Verwenden Sie das feine Ende des Glases Kapillare hinwegfegen zusätzliche Zellen in der Nähe von jeder IBC, die Aspiration von zwei oder mehr Zellen zu verhindern oder zu brechen auseinander größere Aggregaten von Zellen.</li>
	<li>Gelten Sie beim Blick durch das Mikroskop eine geringe Saugkraft am hinteren Ende (Absaugnadeln Pipette) den Mund Micropipetting Apparat, die IBC in der Glas-Kapillare zu führen.</li>
	<li>Verschieben Sie nach Abholung des IBCs die Kapillare an eine leere 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und wenden Sie einen leichten Überdruck, der Tropfen und die IBC in Zentrifugenröhrchen (Abbildung 3D) zu vertreiben.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.3-3.6 auf, wie viele IBCs aus der aktuellen Blase, bevor Sie fortfahren, die nächste Blase erforderlich sind. Absaugnadeln Pipetten und Kapillaren häufig zu verhindern, dass Speichel zu ändern. Vorsicht: Beim Arbeiten mit infektiösen (oder klinischen) Bakterienstämme überwachen Sie ständig die Höhe der Lösung in die Kapillare. Lassen Sie sich nicht das Niveau der Flüssigkeit pipettiert Überlauf von der Kante der Kapillare in den Sauger Schlauch sein. In diesem Fall sofort wechseln zu einem anderen Sauger Schlauch, und entsorgen Sie den vorherigen Satz oben.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.6 auf alle geernteten Harnblasen oder bis Sie ausreichende Anzahl von biologischen Proben für die experimentelle Gruppe gesammelt worden sind.</li>
	<li>(Optional) Wiederholen Sie die Schritte 3.6 und 3.7, bis alle experimentellen Gruppen (oder Mäuse) eingeschläfert wurde und ausreichende biologische Proben aus jeder Gruppe wurden geerntet.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Protokoll, die, das wir beschrieben haben, ermöglicht die Isolation der einzelnen IBCs aus einem Mausmodell der UTI. Dieses Protokoll isoliert IBCs mit lebensfähigen intrazelluläre Bakterien, die durch Kultivierung für KBE überprüft werden können. Die Protokoll-Ergebnisse in intrazelluläre Bakterien von IBCs mit wenig Verunreinigungen durch extrazelluläre Bakterien ermöglicht weitere Charakterisierung der beiden Bakterien und host-Zelle aus einer IBC (Abb. 4C). Wir zeigen auch, dass die Bakterien aus einem einzigen IBC verwendet werden können, in den nachgelagerten Anwendungen wie qPCR (Abb. 4C), was darauf hindeutet, dass unsere Technik Prozess IBCs für in-vitro-Analysen verwendet werden kann. Durch die Bündelung der Bakterien aus so wenig wie 5 IBCs geerntet, zeigen wir weiter unsere Leistungsfähigkeit qRT-PCR-Analyse auf drei bakteriellen Gene, was darauf hindeutet, dass gute Qualität RNA aus den Bakterien in unserem isolierten IBCs (Abbildung 4D) geerntet werden kann. Kombiniert, zeigen die Daten, die wir gezeigt haben, dass Analyse genomweiten RNA (z. B. RNA Sequenzierung) auf einzelne IBCs möglich mit dieser Technik isoliert werden kann.
In diesem Protokoll haben wir uns auf den 6 h Zeitpunkt konzentriert, weil das ist, wenn IBC Zahlen in der Bladder schwarz 6 Mäuse infiziert durch UTI8927emporragen. Darüber hinaus haben wir auch eine statische Bakterienkultur-System verwendet, um den Typ 1 Pilus Ausdruck in UTI89 zu erhöhen. Die Expression von Typ-1-Pilus soll für E. Coli von entscheidender Bedeutung beimessen und Blase Epithelzellen28zu infizieren. Aber dieser Ausdruck ist streng regulierte29 und ökologische Hinweise sind dafür bekannt, es30ändern. Um eine konsistente Infektion Phänotyp und IBCs in ausreichender Zahl zu erhalten, empfehlen wir eine 2 x 24 h statische Bakterienkultur (leicht modifiziert von Hung Et Al.8) und der Zeitpunkt 6 h Infektion beim Arbeiten mit zuvor E. Coli getestet Stämme wie NU14 und UTI8928,29. Es ist jedoch möglich, dass diese Variablen angepasst werden, in anderen Stämmen UTI oder andere Mäuse-Stämme, die ideale Anzahl von IBCs von jeder Infektion zu erhalten müssen.
Während die Protokolle von Hung Et Al.8 nur weibliche Mäuse verwendet werden, wurden andere etablierte Protokolle für die Festlegung der urinausscheidende Fläche Infektion bei männlichen Mäusen berichteten31. In diesem Modell folgte Zystitis bei männlichen Mäusen auch den IBC-Weg. Da die Blase von männlichen und weiblichen Mäusen in der Größe ähnlich sind, erwarten wir, dass unser IBC-Isolierung-Protokoll auf infizierten männlichen Mäusen als auch verwendet werden kann.
Die relativ einfache Technik, die in diesem Protokoll genutzt wird auch sichergestellt, dass es in den meisten Labors bereitgestellt werden kann. Eines der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll ist das Ziehen von Glaskapillaren Mikrokapillaren für die Auswahl der Zelle Art von Interesse zu erstellen. Dieser Schritt ermöglicht Flexibilität in den Durchmessern von Mikrokapillaren erstellt, und somit kann die Methode auf mehrere unterschiedliche Zelltypen verlängert werden. Aufgrund der inhärenten Variation bei der Schaffung dieser Kapillaren, muss jedoch darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass die endgültige Durchmesser in einem nutzbaren Bereich liegt. Wenn die Kapillaren zu schmal sind, sie nicht zu holen, die Zelle von Interesse, aber wenn sie zu breit gebildet werden, mehrere Zellen in einem einzigen Versuch ausgewählt werden konnte. Darüber hinaus führt die Verwendung von offenem Feuer während des Prozesses der Kapillare ziehen eine Risiko von Verbrennungen und Feuer, so dass der Forscher versuchen, Mikrokapillaren erstellen darauf achten sollte, um solche Ereignisse zu verhindern. Die Variabilität sowie das offene Feuer-Risiko reduzieren machen diese Kapillaren beteiligt der Forscher könnten machen Gebrauch von einer traditionellen Mikropipette ziehen Maschine, wie Sie für Elektrophysiologische Experimente (z. B. PC-100, Narishige-Gruppe). Da diese Maschinen machen Schwerkraft oder Roboter-Plattformen verwenden, um die Kapillaren zu ziehen, können sie die Infektionsmodell Bedürfnisse zugeschnitten sein. Jedoch bedeutet die unterschiedlichsten Mikropipette Zuggeräten verfügbar, dass der einzelnen Forscher muss einige Trial And Error zu bestimmen, die entsprechenden Kapillare Enddurchmesser für die Verwendung mit diesem Protokoll durchlaufen wird.
Die vorgestellten Protokoll nutzt Bakterien mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Tags die IBC visuell zu identifizieren. Somit ist diese Technik durch die Forscher Fähigkeit, infektiösen Organismus genetisch zu verändern beschränkt. IBC-bildende Stämme wie CFT073 und NU14 wurden speziell für UPEC erfolgreich mit GFP exprimierenden Plasmiden32,33,34umgestaltet; Diese sollten daher in dasselbe Protokoll verwendet werden. Basierend auf dem Bereich der Maus Blase (70 mm2)35, die Länge der einzelnen Epithelzellen (50-120 µm)17und die Häufigkeit der IBCs in einem einzigen Blase16, eine konservative Schätzung für das Auftreten von IBCs ist über 1 in 1.000 Zellen (oder 0,1 %). Diese Schätzung zeigt das Dienstprogramm unserer Zelle isoliert Protokoll auf seltene Ereignisse. Die Präzision der Zellauswahl durch unser Protokoll und die breite Palette der Kapillare Durchmesser, die gezogen werden kann vorschlagen, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um intrazelluläre Bakterien von anderen in-vivo und in vitro Modellen der Infektion zu isolieren. In der Tat haben wir erfolgreich diese Technik verwendet, um die infizierten kultivierten Blase Epithelzellen (Daten nicht gezeigt) zu isolieren.
Einer der technisch anspruchsvollen Schritte im Protokoll ist die Blase, die die Epithelzellen zum Schaben aussetzen invertieren. Wir haben festgestellt, dass es auch möglich, einen Einschnitt auf der Blase, es zum Schaben spreizen sich zu machen. Jedoch aufgrund sollte darauf geachtet werden, die Schadensminderung zu den Epithelzellen der Blase während des Prozesses der schneiden es offen; Idealerweise sollte ein einzigen Schnitt genutzt werden, um die Blase offen zu spreizen. Darüber hinaus sollte der Schnitt in kaltem PBS erfolgen, um versehentlichen Verlust von Zellen oder Gewebe der Blase während des Prozesses zu verhindern.
Mund Pipettieren von IBC in diesem Protokoll bietet mehr Kontrolle über das Auswahlverfahren der Zelle sowie die Begrenzung der letzte Band der Lösung zusammen mit der Zelle übertragen. Die Feinsteuerung und großen Trennung der Lösung von den Forschern Mund auch maximiert die Sicherheit des Forschers, wie die Volumes übertragen innerhalb der Nanoliter Mikroliter Bereich sind. Im Gegensatz dazu ist unsere Erfahrung mit den modernen Mikropipette, dass es mehr umgebende Flüssigkeit und Zellen mit dem IBC tendenziell, möglicherweise führend zu Kontaminationen mit extrazellulären luminalen Bakterien übertragen. Unsere Feststellung, dass Mund Pipettieren eine höhere Leistung über andere einzelne Zelle isoliert Methoden bietet wurde auch von anderen Labors22,23,24berichtet. Abgesehen von einzelnen Zelle isoliert Mund Pipettieren sogar in einzellige Elektroporation Neuronen25, wird seit dem weiterer Beweis für den nutzen und die Minuten-Steuerelement, das ausgebildete Forscher mit der Technik erreichen können. Aber Sicherheit ist von zentraler Bedeutung und empfehlen wir mögliche zusätzliche Maßnahmen je nach Erreger verwendet werden können: (i) die Erweiterung des Puffers Luft zwischen dem Forscher und das biologische Material, zum Beispiel mithilfe einer Absaugen Pipette mit einem größeren Volumen (z. B. 5 mL), oder (Ii) hinzufügen eines physischen Filters wie Watte in die Absaugnadeln Pipette als eine zusätzliche Barriere fungieren.
In Fällen, wo eine Risikobewertung zu der Schlussfolgerung führt, dass Mund Pipettieren noch zu riskant ist, im Handel erhältlichen Roboter-Setups (z. B. zur Nanoinjections) mit den anderen Abschnitten unserer Technik ermöglichen eine sicherere Methode für kombinierbar Isolieren von infizierten Zellen aus gemischten Populationen. Es sei darauf hingewiesen, dass unsere Erfahrung mit der Verwendung von einem Roboter Mikromanipulator, eine verringerte Rate von IBC-Isolierung im Vergleich gezeigt hat zu Mund pipettieren, da die große Intra experimentelle Variation in der Blase Epithelzelle Größe es schwierig für den Benutzer macht der Roboterarm zu bestimmen, die erforderliche Kraft, um einzelne IBCs abholen. Dennoch bleibt es eine praktikable, obwohl teurer, Option für die Arbeit mit hoch infektiöse Erreger der Krankheit.

Harnwegsinfektionen (HWI) sind eine der häufigsten bakteriellen Infektionen. Schätzungsweise 40-50 % der Frauen sollen mindestens eine urinausscheidende Fläche Infektion (UTI) während ihrer Lebensdauer1erleben. Eines der wichtigsten Akteure der UTI ist adhärent E. Coli (UPEC), welche Konten für über 70 % der unkomplizierten HWI2. Darüber hinaus haben rund ein Viertel derjenigen, die eine UTI haben eine wiederkehrende Infektion, häufig verursacht durch die gleiche Belastung, trotz Behandlung mit geeigneten Antibiotika3. Die hohe Inzidenz von Harnwegsinfektionen stellt eine erhebliche Belastung der Gesundheitssysteme, kostet mehr als $ 2 Milliarden pro Jahr in den USA-4. Darüber hinaus führt der Einsatz von Antibiotika zur Behandlung von HWI auch auf steigende Antibiotika-Resistenz-Preise, die eine große öffentliche Gesundheit Sorge5.
Daher wurde eine große Anstrengung gelegt, in das Verständnis der Mechanismen, mit denen UPEC die ableitenden Harnwege, sowie seine Fähigkeit, rezidivierende Infekte6,7,8verursachen infiziert. Insbesondere wurde ein Maus-Modell der Infektion zur Bakterien- und Host Eigenschaften untersuchen, die UTI8beitragen. Dieses Maus-Modell hat den Vorteil, dass auf unveränderte klinische Stämme isoliert von menschlichen Patienten anwendbar. Dieses Modell führte auch zur Entdeckung von potenziell druggable bakterielle Wege Bedeutung für Aufbau von Harnwegsinfektionen, wie z. B. der Typ1 Pilus9 und Eisen Erwerb Systeme10.
Im Vergleich zu diesen erfolgen bei der Untersuchung der frühen Ereignisse in UTI, fehlt wissen über die Mechanismen, die immer wiederkehrenden Harnwegsinfektionen11. Eine Hypothese ist, dass UPEC entzieht sich der Antibiotika-Therapie und rezidivierende Infektionen in der Blase Ursachen durch intrazelluläre bakterielle Gemeinschaften (IBC) in Blase Epithelzellen bilden. IBCs wurden in murinen Modellen der Infektion und in menschlichen UTI Patienten12,13identifiziert. Das Vorhandensein von IBCs in Urinproben von pädiatrischen Patienten im UTI wurde verknüpft mit höheren Raten von Wiederholung14,15. Jedoch erweist IBCs zu isolieren und studieren die Bakterien darin sich wegen ihrer Seltenheit technisch anspruchsvoll; Schätzungen zufolge eine infizierte murine Blase in der Regel nur 10-100 IBCs16hat. Darüber hinaus Blase Epithelzellen sind relativ groß (50-120 µm)17, macht es schwierig, Fluoreszenz bereitstellen unterstützt Zellsortierung (FACS), angesichts der Tatsache, dass typische FACS-Düsen mit einem Durchmesser von 70 µm oder 100 µm ausgelegt sind. So werden die Zellen so groß wie Blase Epithelzellen oft durch Filtration vor FACS zur Vermeidung von Verstopfungen der Fluidik entfernt.
Unser Labor beschrieb kürzlich eine allgemeine und wirtschaftliche Methode zur seltenen infizierte Zellen aus Mischungen wie geschabt Epithelzellen der Blase18zu isolieren. Um effektiv IBCs isolieren, verwendeten wir traditionelle Mund pipettieren. Mund Micropipetting ist eine Technik, die lange für Mikromanipulation von einzelnen Zellen und Embryonen für nachgelagerte Analyse19,20,21,22,23, verwendet worden ist 24 , 25. traditionelle Mund Pipettieren flüssige großvolumige (in Millilitern) wurde oft die Ursache für Labor im Zusammenhang mit Unfällen und die Technik hat zu Recht von einem großen Teil der wissenschaftlichen Gemeinschaft außerhalb der traditionellen Embryologie gemieden wurde und einzelne Zelle Anwendungen. Unser Protokoll ist inspiriert durch die einzelne Zelle Versionen von dieser Technik19,20, die Risikominderung durch die Bereitstellung eines großen Puffers (> 2 mL) der Luft zwischen dem Forscher und Probe im Vergleich zu das Volumen der Flüssigkeit übertragen (< 1 ΜL). Diese Methode auch nutzt die Feinsteuerung dieser Mund Micropipetting bereitstellt, die zu einem niedrigen Endvolumen der umgebenden Lösung übertragen und hohe Reinheit der isolierten Zellen übersetzt. Die Technik nutzt preiswerte Materialien (<$ 50), und somit sollte möglich sein, in allen Labors zu implementieren.
Dieses visuelle Protokoll beschreibt unser IBC Isolation Technik, bietet einen Verweis auf andere Forscher versuchen, diese Technik zu replizieren zu unterstützen. Die Forscher benötigen Zugriff auf einen fluoreszierenden sezierenden Mikroskop (oder ähnliche Geräte), die verwendet werden, um einzelne Epithelzellen und fluoreszierenden Bakterien während der live Aufnahme mit offener und zugänglicher bildgebenden frühzeitig für Micropipetting visualisieren (siehe die Tabelle der Materialien für die Details des Mikroskops verwendet, obwohl auch andere gleichwertige Instrument-Modelle verwendet werden können). Während dieses Protokolls in einem Mausmodell der UTI IBCs konzentrieren wird, sollten ähnliche Methoden auf infizierte Zellen von Zellsuspensionen in anderen Modellen der Infektion isolieren anwendbar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:939px;" width="939">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5ml eppendorf tube</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:428px;">For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100% ethanol</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For Alcohol Burner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml conical tube</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1ml Tuberculin Syringe</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3% Bacterial Agar</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aesculap anatomic forceps</td>
			<td style="width:176px;">Braun/Kruuse</td>
			<td style="width:119px;">BD222R</td>
			<td>For initial dissection of mouse (skin, fascia)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcohol Burner</td>
			<td style="width:176px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">237070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirating pipette</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">357558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacterial loops</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td>Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical flasks</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digital camera for microscope</td>
			<td style="width:176px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">DP71</td>
			<td style="width:428px;">For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillaries</td>
			<td style="width:176px;">Kimax</td>
			<td style="width:119px;">6148K07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iris Scissors STR SS 110MM</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BC110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isoflurane (Isothesia)</td>
			<td style="width:176px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:119px;">29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td style="width:176px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">420311</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth (Miller)</td>
			<td style="width:176px;">Thermo/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10855021</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Light source unit for microscope</td>
			<td style="width:176px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">LG-PS2</td>
			<td style="width:428px;">For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lubricant&#160;</td>
			<td style="width:176px;">KY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any similar commercial medical lubricant will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Macro fluorescence microscope</td>
			<td style="width:176px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">MVX10</td>
			<td style="width:428px;">For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette + micropipette tips</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 1x</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette controller + Pipettes</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td style="width:176px;">BD Intramedic</td>
			<td style="width:119px;">427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Precision Glide needle 30G</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305107</td>
			<td>Possibly under new catalogue number (305106)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Splinter forceps curved</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BD312R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spray bottle (for ethanol)</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Square cuvettes</td>
			<td style="width:176px;">Elkay</td>
			<td style="width:119px;">127-1010-400</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterilgard III Advance Safety Cabinet</td>
			<td style="width:176px;">Baker</td>
			<td style="width:119px;">SG403</td>
			<td>Any biosafety cabinet with a UV irridiator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterilin 90mm Standard Petri Dish</td>
			<td style="width:176px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">101VR20</td>
			<td>Any sterile petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">OK366R</td>
			<td>Recommended for harvesting of bladder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Surgical Scissors STR S/B 105MM</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BC320R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810R</td>
			<td>Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">WPA C08000 cell density meter</td>
			<td style="width:176px;">Biowave (Biochrom)</td>
			<td style="width:119px;">80-3000-45</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of single intracellular bacterial communities generated from a murine model of urinary tract infection for downstream single-cell analysis

In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren zur individuellen intrazelluläre bakterielle Gemeinschaften von einer Maus zu isolieren, die experimentell in der Harnwege infiziert wurde. Das Protokoll kann im großen und ganzen in drei Abschnitte unterteilt: die Infektion, Blase Epithelzelle Ernte und Mund Micropipetting, einzelne infizierte Epithelzellen zu isolieren. Die isolierten Epithelzelle enthält lebensfähige Bakterienzellen und ist nahezu frei von kontaminierenden extrazelluläre Bakterien, wodurch es ideal für nachgeschaltete einzellige Analyse. Die Zeit vom Beginn der Infektion zum Erhalt einer einzigen intrazellulären bakteriellen Gemeinschaft geht es um 8 h. Dieses Protokoll ist kostengünstig zu implementieren und allgemein zur Verfügung stehenden Materialien verwendet, und wir erwarten, dass es auch in anderen Infektionsmodelle, einzelne infizierte Zellen von Zelle Mischungen zu isolieren, auch wenn die infizierten Zellen selten sind ausgenutzt werden kann. Jedoch wegen ein potenzielles Risiko im Mund Micropipetting, ist dieses Verfahren nicht für hoch infektiöse Erreger empfohlen.

Abgesehen von (Abbildung 3D) Bestätigung der Anwesenheit einer einzigen isolierten IBC in dem Sammelrohr über dem sezierenden Mikroskop kann die Reinheit der isolierten IBC auch durch konfokale Mikroskopie bestätigt werden. Wie in Abbildung 4Adargestellt, die isolierten Zellen sollten für E. Coli und Uroplakin beflecken, und sind die erwartete Größe für IBCs (50-120 µm)17. Darüber hinaus ist E. Coli Färbung nicht in die umgebende Flüssigkeit. Anhand unserer Daten sind mehr als 90 % der Zellen, die mit dieser Technik isoliert IBCs18. Nach Isolierung können das Vorhandensein und die Lebensfähigkeit der bakteriellen Zellen in den einzelnen IBC durch Kolonie bildende Einheit (KBE) Aufzählung (Abbildung 4B) oder quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) für genomische Äquivalente (bestätigt werden Abbildung 4 ( C). Abbildung 4C zeigt auch, dass nicht infizierte Epithelzellen isoliert mit gleichem Protokoll keinen messbare Mengen von Bakterien. Basierend auf diesen Daten, schätzen wir, dass die Reichweite der KBE in einer einzigen IBC 102-103 im Mausmodell der Infektion der Harnwege ist. Eines der Hauptziele der einzelnen IBC Isolation soll nachgeschaltete Analysen z. B. RNA Sequenzierung durchführen. Um sicherzustellen, dass unsere Isolationsmethode RNA aus Bakterien im IBC zur Analyse erhalten kann, führten wir quantitative reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Quantifizierung von drei Genen (16 s, CyoB, und Aufwändigkeit) für eine Auswahl an individuell isoliert und zusammengefasste IBCs (Abbildung 4D). Alle Daten, die in Abbildung 4 dargestellte adaptiert wurde mit freundlicher Genehmigung von Duraiswamy Et Al.18. Eine Übersicht Schaltplan unseres IBC-Isolierung-Protokolls in Abbildung 5sehen, die von Duraiswamy Et Al.18wiedergegeben wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig1.jpg"> Abbildung 1 : Hand zog Kapillaren halten enge Öffnungen. (A) Proben von Hand gezogen Kapillarröhrchen werden angezeigt auf einem schwarzen Hintergrund für den Kontrast. Von unten nach oben, ein unpulled Kapillare, eine Kapillare, die nicht in ausreichendem Maße gezogen wurde, erscheinen eine Kapillare, die für die einzelnen Blase Epithelzelle Ernte verwendet werden kann und eine Kapillare, die zu dünn (und somit in zwei Teile getrennt) gezogen wurde. Ein 15 cm Lineal befindet sich am unteren Rand des Bildes als Maßstab. Der geschätzte Punkt für die nutzbare Kapillare Abknicken ist durch den roten Pfeil auf der Abbildung angezeigt. (B) Bild mit einem sezierenden Mikroskop Bestätigung des hohlen Innendurchmessers einer gezogenen Kapillare (unten). Ein unpulled Kapillare befindet sich oben zeigen die relative Größenunterschied der beiden Kapillaren. Maßstabsleiste = 4,0 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig2.jpg"> Abbildung 2 : Dissektion der Maus Blase Epithelzellen ernten. (A) ein Bild einer Maus mit weißen Linien hinzugefügt, um die geschätzte Position und Winkel der Einschnitte anzuzeigen, setzen der murinen Bauchhöhle und Blase. (B) ein Bild der exponierten Maus Bauchhöhle nach dem Schnitt. (C) ein Bild der exponierten Blase (roter Pfeil) ragt zwischen der Fettpolster. (D) ein Bild von der murinen Blase mit der Spitze von der Zange eingefügt in das Lumen mit Pfeile die Richtung der Bewegung an benötigt, um die Blase zu invertieren. Die Blase wird zuerst leicht nach außen gezogen, dann herum und von der ersten Welle der Zange. Die Bewegungsrichtungen für beide Aktionen sind wie durch weiße Pfeile Nummern 1 und 2 angegeben. (E) ein Bild zeigt die Endposition der invertierten Blase auf die zweite Welle der Zange eingelegt. Die Wellen der Zange sind in beiden Platten D und E mit roten Pfeile und Text beschriftet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig3.jpg"> Abbildung 3 : IBC Ernte von Blase Zellen. (A) einer infizierten und invertierten Blase in kaltem PBS-Lösung vor der Zelle zu kratzen. (B) ein Bild zeigt geschabt Blase Zellen unter dem Mikroskop gesehen. IBCs sind als große grüne fluoreszierende Aggregate in beiden Bildern erkennbar (siehe rote Pfeile). (C) ein Bild von der fertigen Mund Micropipetting Apparat. Die Absaugnadeln Pipette, Pipettenspitze Sauger Schlauch und zog Kapillarröhrchen werden mit nummerierten Pfeilen identifiziert, wie auf der rechten Seite angezeigt. (D) ein Bild einer einzelnen isolierten IBC innerhalb einer Auflistung von 1,5 mL Tube (rot dargestellt). Maßstabsbalken (wie angegeben) sind vertreten durch weiße Linien in Platten A, B und D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig4.jpg"> Abbildung 4 : Geernteten IBCs sind rein und eignet sich für nachgelagerte Analyse. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Duraiswamy Et al.18geändert. (A) Bilder von zwei isolierte GFP-positiven Zellen, die mit Anti-Uroplakin und Anti -E.coli -Antikörpern angefärbt wurden. Die erste Zelle (IBC-1) besteht aus Bildern der einzelnen Kanäle (bei Low-Vergrößerung) auf der linken Seite, und eine hohe Vergrößerung zusammengefügte Bild ist auf der rechten Seite. Die zweite Zelle (IBC-2) wird bei hoher Vergrößerung im zusammengeführten und einzelnen Kanäle angezeigt. Maßstabsleisten sind wie angegeben. DNA ist mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) befleckt und im Blaukanal vertreten. Anti -E. Coli wird gefärbt, mit einem sekundären Antikörper konjugiert zu Fluorescein erfolgt (FITC) und in den grünen Kanal vertreten. Anti-Uroplakin ist mit einem sekundären Antikörper konjugiert zu Tetramethylrhodamine erfolgt (TRITC) und vertreten im roten Kanal befleckt. (B) bakterielle KBE von isolierten IBCs. IBCs wurden sofort bearbeitet, oder inkubiert in 0,1 % Triton-X für 10 oder 30 min. gebündelt KBE zählt der einzelnen IBCs von n isoliert = 3 separate Experimente gezeigt. Nachweisgrenze = 0,7 Log10 KBE/IBC. Rote Punkte an der Nachweisgrenze geplottet zeigen Proben, bei denen keine Kolonien geborgen wurden. Alle IBC-haltigen Proben unterscheiden sich nicht signifikant (p > 0,05, Mann-Whitney-Test); die nicht infizierten Epithelzellen unterscheiden sich wesentlich von der IBC (10 min)-Daten (p < 0,001, Mann-Whitney-Test). (C) qPCR Quantifizierung der Bakterien auf einzelnen IBCs und nicht infizierten Epithelzellen nach eine 10 min Inkubation bei 0,1 % Triton-X (*, Mann-Whitney-Test, p < 0,0001, n = 4). Nachweisgrenze = 1,18 Log10 Bakteriengenom äquivalente/IBC. Rote Punkte zeigen die Proben für die keine Kolonien wurden auf verschoben im Bedienfeld "B. (D) Quantifizierung der 16 s rRNA, CyoB, und Aufwändigkeit Gene unterschiedlich vielen einzeln isoliert und zusammengefasste IBCs geborgen (n = 1 Experiment; jeweils Punkt zeigt den Mittelwert aus 3 Technische Wiederholungen). NC = keine DNA-negativ-Kontrolle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig5.jpg"> Abbildung 5 : Eine schematische und seine zugehörigen Fotografien repräsentieren die Isolation der IBCs per Mund Micropipetting von infizierten Mäusen Harnblasen. Diese Zahl wird von Duraiswamy Et Al.18wiedergegeben. (A) A geerntet ganze Blase; (B) eine invertierte ganze Blase Freilegung der GFP IBCs zum Ausdruck zu bringen; (C) eine Nahaufnahme des Randes der geschabt Harnblase zeigt individuelle IBCs in der Schwebe im angrenzenden Puffer; (D) eine einzelne isolierte IBC in ein Röhrchen pipettiert. Rote Pfeile im Bedienfeld "B" zeigen Beispiele von GFP-positiven IBC auf der luminalen Oberfläche der Blase. Die rot gepunktete Linie im Bedienfeld "C" zeigt den rechten Rand der invertierten Blase (gekennzeichnet als "BL"); rote Pfeile im Bedienfeld "C" zeigen offensichtlichste individuelle GFP-positiven epitheliale Zellen, die die Blasenoberfläche abgeschabt. Weiße gepunktete Linie im Bedienfeld "D" zeigt ein micropipetted Sub-Mikroliter Tröpfchen mit einer isolierten IBC, die durch einen weißen Pfeil angezeigt wird. Skalieren von Balken = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung von einzelner, infizierte Blase Epithelzellen aus einem Mausmodell der urinausscheidende Fläche Infektion.

Isolierung der einzelnen intrazelluläre bakterielle Gemeinschaften erzeugt aus einem Mausmodell der urinausscheidende Fläche Infektion nachgelagerten Einzeller Analysezwecken

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Intrazelluläre Bakteriengemeinschaften, oder IBCs, wurden bei Mäusen beobachtet, die experimentelle Harnwegsinfektionen erhalten haben, oder UTIs. Sie wurden auch in den Urinsedimenten menschlicher UTI-Patienten gesehen. Die Technik, die wir heute beschreiben, ist eine Möglichkeit, einzelne IPCs von experimentell infizierten Mäusen zu isolieren.Die Mund-Mikropipetting-Technik ist die einzige derzeit verfügbare Technik zur Isolierung intrazellulärer Bakterien aus infizierten Mausblasen. Um Glasmundpipetten vorzubereiten, kneifen Sie beide Enden eines Glaskapillarrohres fest und drehen Sie die Mitte des Rohres entlang seiner Achse gleichmäßig über eine offene Flammenquelle hin und her. Wenn das Glas weich wird, entfernen Sie die Kapillare von der Wärmequelle und ziehen Sie das Glas sofort auseinander.Die ideale Endlänge der gezogenen Kapillare ist drei bis fünf Zentimeter länger als eine ungezogene Kapillare, um einen geeigneten Innendurchmesser für die Isolierung einzelner Blasenepithelzellen zu gewährleisten. Wenn das Glas abgekühlt ist, überprüfen Sie, ob die Mitte der Glaskapillare schmaler ist und ob das Innere des Rohres noch hohl ist. Nehmen Sie das große Ende der gezogenen Kapillare mit einer Hand, verwenden Sie Zange, um die Kapillare an ihrer engsten Stelle zu greifen, um sicherzustellen, dass die Zange mit genügend Kraft ausgeübt wird, um die Kapillare fest zu greifen, ohne sie zu zerquetschen.Drehen Sie die Zange schnell, um die gezogene Kapillare an der engsten Stelle zu schnappen. Dann legen Sie den Mund Mikropipette-große Kapillare in eine 100-Millimeter-Petrischale und UV sterilisieren die Schale für 30 Minuten. Um die Blase zu ernten, legen Sie eine Maus in die Rückenposition und sterilisieren Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol.Mit Ethanol-sterilisierten Zangen und chirurgischen Scheren, machen Sie einen anfänglichen ein Zentimeter quer Hautschnitt über der Harnröhrenöffnung und erweitern Sie den Schnitt diagonal in Richtung der oberen Gliedmaßen der Maus, um einen V-förmigen Schnitt entlang der gesamten Vorderseite der Maus zu schaffen, der den Inhalt des Peritoneums freilegt. Mit neuen sterilisierten Werkzeugen, drücken Sie vorsichtig auf die Fettpolster in der Nähe der Beckenregion der Maus, um die Blase zu protrukern und greifen Sie die exponierte Blase an der Spitze. Halten Sie einen festen Griff auf die Blase, schneiden Sie die Harnleiter und Harnröhre, um die Blase zu befreien und legen Sie die Spitze einer Welle von abgerundeten Zangen in die Öffnung der Blase, wo es gerade eingeschnitten wurde.Lassen Sie die Zangen, die den Scheitelgreifen und halten Sie die abgerundeten Zangen fast vollständig geschlossen, verwenden Sie ein zweites Paar Zangen, um das äußere Ende des Mundes der Blase sanft weg von den abgerundeten Zangen und um und über die andere Spitze der abgerundeten Zange zu ziehen, um die Blase nach innen zu drehen. Verwenden Sie dann das zweite Zangenpaar, um die invertierte Blase von der Spitze der Zange sanft in einen Milliliter kalten PBS zu verwandeln. Und kratzen Sie vorsichtig die innere Epithelzellschicht auf der Außenseite der invertierten Blase mit zwei Paaren sauberer Zangen.Wenn alle Zellen abgekratzt sind, legen Sie das ungezogene Ende einer gezogenen Glaskapillare in den Gummistopfen eines Saugrohrs und passen Sie das schmale Ende einer ein Milliliter-Pipettenspitze fest in das andere offene Ende des Rohres. Das schmale Ende einer zwei Milliliter-Saugpipette fest in das offene, breitere Ende der ein Milliliter Pipettespitze einbauen und die abgekratzte Zellsuspension unter ein Sezierendes Mikroskop legen. Identifizieren Sie die IBCs mit einer 20- bis 40-fachen Vergrößerung als große fluoreszierende Aggregate und tauchen Sie das feine Ende der Glaskapillare für eine Sekunde in ein frisches Rohr von PBS, um die Aufnahme unerwünschten Volumens durch Kapillarwirkung zu reduzieren.Wenn ein IBC von Interesse gefunden wurde, bringen Sie langsam das offene Ende des Kapillarrohres in Richtung des IBC und wenden Sie eine sehr kleine Saugkraft auf die Ansaugpipette an, um die IBC in die Glaskapillare zu führen. Dann bewegen Sie die Kapillare auf ein leeres 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr und wenden Sie einen leichten positiven Druck an, um das Tröpfchen und den IBC in das Rohr zu vertreiben. Neben der Bestätigung des Vorhandenseins eines einzelnen isolierten IBC im Sammelrohr über das Sezierendes Mikroskop kann die Reinheit des isolierten IBC durch konfokale Mikroskopie bestätigt werden.Die isolierten Zellen sollten sowohl für E.coli als auch für Uroplakin färben und zwischen 50 und 120 Mikrometer groß sein. Nach der Isolierung kann das Vorhandensein und die Lebensfähigkeit der Bakterienzellen in den einzelnen IBC durch koloniebildende Einheitsquantifikation oder quantitative Polymerase-Kettenreaktion für genomische Äquivalente bestätigt werden. Insbesondere zeigen nicht infizierte Epithelzellen, die mit demselben Protokoll isoliert sind, keine quantifizierbaren Mengen an Bakterien.Darüber hinaus bestätigt die quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse das Vorhandensein von bakteriellen Genen in einer Reihe von individuell isolierten und gepoolten IBCs. Stellen Sie immer sicher, dass eine Mundmikropipette Flüssigkeit leicht aufnehmen und vertreiben kann. Zögern Sie nicht, die Kapillare oder das gesamte Gerät zu wechseln, wenn sich die Mundmikropipette verschlossen anfühlt.Diese Mund-Mikropipetting-Technik ermöglicht es uns, die intrazellulären Populationen, die sich während einer experimentellen UTI bilden, direkt und spezifisch zu untersuchen. Ohne diese Technik wären diese intrazellulären Populationen mit den extrazellulären Bakterien kontaminiert und in der Überzahl. Einige andere Infektionserreger können leichter aerosolisiert oder übertragen werden als die E.coli, die wir in dieser Anwendung verwendet haben.In diesen Fällen können daher einige zusätzliche Kontrollen gerechtfertigt sein, z. B. das Hinzufügen eines Filters oder das Erweitern der Schläuche, je nach verwendeter Anwendung. Die mit dieser Mund-Mikropipetting-Technik isolierten IBCs können dann in anderen nachgeschalteten Einzelzellanalysen wie QRTPCR oder RNA-Sequenzierung eingesetzt werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Transurethrale Induktion von Maus Harnwegsinfekt

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Forschung

Immunologie und Infektion

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit &#39;Single Virus Genomics&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinausscheidende Fläche Infektion in eine kleine Tiermodell: transurethrale Katheterisierung von männlichen und weiblichen Mäusen

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...