Name: isolation of single intracellular bacterial communities generated from a murine model of urinary tract infection for downstream single-cell analysis
Uploaded: 2019-04-16T12:30:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis at JoVE.c

מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר הלאומי, משרד, סינגפור ראש הממשלה, תחת שלה ערכה מלגת מחקר ה-NRF (ה-NRF פרס. לא. NRF-RF2010-10); סינגפור משרד הבריאות של המועצה הלאומית למחקר רפואי (NMRC/ספר הנהלים/1358-2013); מכון הגנום של סינגפור (GIS) / הסוכנות לענייני מדע, טכנולוגיה, מחקר (A * כוכב).

<ol>
	<li>Barber, A. E., Norton, P. J., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Tract+Infections:+Current+and+Emerging+Management+Strategies.">Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies.</a> Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).</li><li>Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infections:+epidemiology,+mechanisms+of+infection+and+treatment+options.">Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options.</a> Nature Reviews Microbiology. 13, 269-284 (2015).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurring+urinary+tract+infection:+incidence+and+risk+factors.">Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors.</a> American Journal of Public Health. 80, 331-333 (1990).</li><li>Foxman, B., Barlow, R., D'Arcy, H., Gillespie, B., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection:+self-reported+incidence+and+associated+costs.">Urinary tract infection: self-reported incidence and associated costs.</a> Annals of Epidemiology. 10 (8), 509-515 (2000).</li><li>Zowawi, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+threat+of+multidrug-resistant+Gram-negative+bacteria+in+urology.">The emerging threat of multidrug-resistant Gram-negative bacteria in urology.</a> Nature Reviews Urology. 12, 570-584 (2015).</li><li>Silverman, J. A., Schreiber, H. L., Hooton, T. M., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+physiology+to+pharmacy:+developments+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+recurrent+urinary+tract+infections.">From physiology to pharmacy: developments in the pathogenesis and treatment of recurrent urinary tract infections.</a> Current Urology Reports. 14, 448-456 (2013).</li><li>Sivick, K. E., Mobley, H. L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waging+war+against+uropathogenic+Escherichia+coli:+winning+back+the+urinary+tract.">Waging war against uropathogenic Escherichia coli: winning back the urinary tract.</a> Infection and Immunity. 78, 568-585 (2010).</li><li>Hung, C. -. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4, 1230-1243 (2009).</li><li>Cusumano, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infection+with+orally+active+FimH+inhibitors.">Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors.</a> Science Translational Medicine. , (2011).</li><li>Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+Immunization+with+Iron+Receptor+Antigens+Protects+against+Urinary+Tract+Infection.">Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection.</a> PLoS Pathogens. , (2009).</li><li>Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+uropathogenic+Escherichia+coli+persistence+and+eradication+from+the+urinary+tract.">Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2006).</li><li>Hunstad, D. A., Justice, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+lifestyles+and+immune+evasion+strategies+of+uropathogenic+Escherichia+coli.">Intracellular lifestyles and immune evasion strategies of uropathogenic Escherichia coli.</a> Annual Review of Microbiology. 64, 203-221 (2010).</li><li>Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+bacterial+communities+in+human+urinary+tract+infection.">Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection.</a> PLoS Medicine. , (2007).</li><li>Robino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+bacterial+communities+in+a+child+with+Escherichia+coli+recurrent+urinary+tract+infections.">Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections.</a> Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).</li><li>Robino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+bacteria+in+the+pathogenesis+of+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+children.">Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children.</a> Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).</li><li>Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+and+niche+distribution+of+uropathogenic+Escherichia+coli+during+acute+and+chronic+urinary+tract+infection.">Population dynamics and niche distribution of uropathogenic Escherichia coli during acute and chronic urinary tract infection.</a> Infection and Immunity. 79, 4250-4259 (2011).</li><li>Keshtkar, A., Keshtkar, A., Lawford, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+morphological+parameters+of+the+human+urinary+bladder+(malignant+and+normal).">Cellular morphological parameters of the human urinary bladder (malignant and normal).</a> International Journal of Experimental Pathology. 88, 185-190 (2007).</li><li>Duraiswamy, S., Chee, J. L. Y., Chen, S., Yang, E., Lees, K., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Intracellular+Bacterial+Communities+during+Experimental+Urinary+Tract+Infection+Reveals+an+Abundant+and+Viable+Bacterial+Reservoir.">Purification of Intracellular Bacterial Communities during Experimental Urinary Tract Infection Reveals an Abundant and Viable Bacterial Reservoir.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2, 739-752 (2007).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+and+stochastic+allele+specific+gene+expression+in+single+mouse+blastomeres.">Deterministic and stochastic allele specific gene expression in single mouse blastomeres.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>Wells, J. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+mouse+endoderm+is+patterned+by+soluble+factors+from+adjacent+germ+layers.">Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers.</a> Development. 127, 1563-1572 (2000).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+DNA+methylome+landscapes+of+mammalian+cells+with+single-cell+reduced-representation+bisulfite+sequencing.">Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing.</a> Nature Protocols. 10 (5), 645-659 (2015).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+clonally+derived+chicken+embryonic+fibroblast+cell+line+(CSC)+with+high+transfection+efficiency+and+ability+as+a+feeder+cell.">The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell.">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nature Protocols. 5 (3), 516-535 (2010).</li><li>Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporation+of+Neurons.">Single-Cell Electroporation of Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2017).</li><li>Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Characterization+of+UTI+and+CAUTI+in+a+Mouse+Model.">Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), 52892 (2015).</li><li>Justice, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+developmental+pathways+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+urinary+tract+pathogenesis.">Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).</li><li>Mulvey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+Evasion+of+Host+Defenses+by+Type+1-Piliated+Uropathogenic+Escherichia+coli.">Induction and Evasion of Host Defenses by Type 1-Piliated Uropathogenic Escherichia coli.</a> Science. 282 (5393), 1494-1497 (1998).</li><li>Zhang, H., Susanto, T. T., Wan, Y., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mutagenesis+of+the+fimS+promoter+regulatory+switch+reveals+novel+regulation+of+type+1+pili+in+uropathogenic+Escherichia+coli.">Comprehensive mutagenesis of the fimS promoter regulatory switch reveals novel regulation of type 1 pili in uropathogenic Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), 4182-4187 (2016).</li><li>Gally, D. L., Bogan, J. A., Eisenstein, B. I., Blomfield, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+regulation+of+the+fim+switch+controlling+type+1+fimbrial+phase+variation+in+Escherichia+coli+K-12:+effects+of+temperature+and+media.">Environmental regulation of the fim switch controlling type 1 fimbrial phase variation in Escherichia coli K-12: effects of temperature and media.</a> Journal of Bacteriology. 175 (19), 6186-6193 (1993).</li><li>Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+Enhance+Male+Urinary+Tract+Infection+Severity+in+a+New+Model.">Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1625-1634 (2016).</li><li>Garofalo, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+from+Urine+of+Female+Patients+with+Urinary+Tract+Infections+Is+Competent+for+Intracellular+Bacterial+Community+Formation.">Escherichia coli from Urine of Female Patients with Urinary Tract Infections Is Competent for Intracellular Bacterial Community Formation.</a> Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).</li><li>Berry, R. E., Klumpp, D. J., Schaeffer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+cultures+support+intracellular+bacterial+community+formation+by+uropathogenic+Escherichia+coli.">Urothelial cultures support intracellular bacterial community formation by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 2762-2772 (2009).</li><li>Holden, N., Totsika, M., Dixon, L., Catherwood, K., Gally, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+P-fimbrial+phase+variation+frequencies+in+Escherichia+coli+CFT073.">Regulation of P-fimbrial phase variation frequencies in Escherichia coli CFT073.</a> Infection and Immunity. 75 (7), 3325-3334 (2007).</li><li>Jost, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+growth+of+the+mouse+bladder.">Postnatal growth of the mouse bladder.</a> Journal of Anatomy. 143, 39-43 (1985).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול שתיארנו מאפשר ניתוקה של IBCs יחיד של המודל מאתר של UTI. פרוטוקול זה מבודד IBCs המכיל חיידקים תאיים קיימא, אשר ניתנת לאימות כמקורית על-ידי culturing עבור CFU. התוצאות פרוטוקול של חיידקים תאיים של IBCs עם מעט זיהום על ידי חיידקים חוץ-תאית, המאפשרות לקדם אפיון של שני חיידקים ולארח התא IBC (איור 4C). אנו גם מראים כי מחיידקים IBC יחיד ניתן להשתמש ביישומים במורד הזרם כגון qPCR (איור 4C), רומז כי הטכניקה שלנו יכול לשמש לתהליך IBCs עבור ניתוחים אחרים במבחנה. על ידי איגוד החיידק שנקטפו מעטים כמו 5 IBCs, בהמשך נדגים את היכולת שלנו לבצע ניתוח לרביעיית-PCR על שלושה גנים חיידקיים, מציע איכות טובה RNA ובביצים החיידק ב שלנו IBCs מבודדים (איור 4D). משולב, הנתונים הראינו מציינים כי ביצוע ניתוח RNA הגנום כולו (כגון רצפי RNA) על יחיד IBCs עשוי להיות אפשרי בעזרת טכניקה זו בידוד.
פרוטוקול זה, לנו יש התמקדו נקודת הזמן 6-אייץ ' כי זה כאשר IBC מספרי שיא ב שלפוחיות של עכברים 6 שחור נגוע UTI8927. יתר על כן, גם השתמשנו מערכת התרבות חיידקי סטטי כדי לשפר את הרמה של סוג 1 pilus ביטוי UTI89. הביטוי של pilus מסוג 1 הוא קריטי עבור e. coli לצרף להדביק תאים אפיתל שלפוחית השתן28. עם זאת, ביטוי זה הוא מוסדר בחוזקה29 , רמזים סביבתיים ידועים לשנות אותו30. על מנת לשמור על פנוטיפ זיהום עקבית בעלת מספר מספיק של IBCs, אנו ממליצים על שימוש 2 x 24 h סטטי חיידקי תרבות (מעט שונה Hung ואח8) לבין נקודת זמן זיהום 6-אייץ ' בעת עבודה עם בעבר נבדקו e. coli זנים כמו28,NU14, UTI8929. עם זאת, ייתכן כי משתנים אלה צורך להתאימם זנים אחרים UTI או בכל זני עכברים אחרים כדי להשיג את המספר האידיאלי של IBCs של כל זיהום.
בעוד הפרוטוקול מ- Hung ואח8 משתמשת רק נקבות עכברים, פרוטוקולים אחרים הוקמה להקמת זיהום בדרכי השתן בעכברים זכרים כבר דווח על31. במודל זה, דלקת שלפוחית השתן בעכברים זכרים גם בעקבות השביל IBC. כמו שלפוחיות של עכברים הזכר והנקבה דומים בגודלם, אנו צופים כי ניתן להשתמש פרוטוקול הבידוד שלנו IBC על עכברים זכר נגוע גם כן.
הטכנולוגיה פשוטה יחסית מנוצל פרוטוקול זה גם מבטיח כי ניתן לפרוס במעבדות רוב. אחד השלבים המפתח מעורב פרוטוקול זה הוא הוצאת של נימי זכוכית ליצירת microcapillaries על בחירת סוג התא עניין. שלב זה מאפשר גמישות הקוטר של microcapillaries שנוצרו, ולכן השיטה ניתן להרחיב את מספר סוגי תאים מטרה שונים. עם זאת, בשל וריאציית הטמונה ביצירת נימים אלה, יש לנקוט כדי להבטיח הקוטר סופי בטווח שמיש. אם נימי הדם צרים מדי, הם נכשלים לאסוף את התא של עניין, אלא אם הם עשויים רחב מדי, יכול לבחור תאים מרובים בניסיון יחיד. יתר על כן, השימוש של להבה פתוחה במהלך התהליך של משיכת נימי נושא סיכון הטבועה של כוויות, שריפה, אז החוקר מנסה ליצור microcapillaries צריך לטפל כדי למנוע התרחשות אירועים כאלה. כדי להפחית את מידת ההשתנות, כמו גם הסיכון אש פתוחה המעורבים ביצירת נימים אלה, החוקר יכול לעשות שימוש micropipette מסורתיים משיכת מכונה, כגון אלה המשמשים לניסויים אלקטרופזיולוגים (למשל, PC-100, Narishige קבוצה). המכונות האלה עושים שימוש הכובד או פלטפורמות רובוטיות למשוך את נימי הדם, הם ניתן להתאימו לצרכים של המודל זיהום. עם זאת, מגוון רחב של micropipette מושך מכונות זמין פירושה כי החוקר בודדים תצטרך לעבור ניסוי וטעייה כדי לקבוע את הקוטר נימי הסופי המתאים לשימוש עם פרוטוקול זה.
פרוטוקול הציג עושה שימוש של חיידקים לבטא תגית פלורסנט חזותית לזהות את IBC. לפיכך, טכניקה זו הוא מוגבל על ידי היכולת החוקרים שינוי גנטי האורגניזם זיהומיות. במיוחד עבור UPEC, זנים להיוות IBC כגון CFT073 ו- NU14 כבר בהצלחה הפכו עם הבעת-GFP פלסמידים32,33,34; אלה ולכן צריך להיות נגיש באותו הפרוטוקול. מבוסס על האזור של העכבר שלפוחית השתן (70 מ"מ2)35, האורך של תאים אפיתל בודדים (50-120 מיקרומטר)17, וגם את התדירות של IBCs שלפוחית השתן יחיד16, הערכה זהירה על השכיחות של IBCs היא על 1 ב 1,000 תאים (או 0.1%). מהערכה זו מציגה את התועלת של פרוטוקול הבידוד שלנו תא היעד אירועים נדירים. הדיוק של התא הנבחר באמצעות פרוטוקול שלנו מגוון רחב של קטרים נימי זה ניתן למשוך להציע כי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבודד חיידקים תאיים אחרים דגמים ויוו, במבחנה של זיהום. אכן, בהצלחה השתמשנו בטכניקה זו כדי לבודד שלפוחית השתן נגוע בתרבית תאים אפיתל (נתונים לא מוצג).
אחד יותר טכנית מאתגר צעדים בפרוטוקול זה היפוך שלפוחית השתן כדי לחשוף בתאי אפיתל עבור גירוד. מצאנו שזה גם אפשרי לעשות חתך על שלפוחית השתן לפעור את זה עבור גירוד. אולם בשל להקפיד כדי לצמצם את הנזק בתאי אפיתל של שלפוחית השתן במהלך התהליך של חיתוך זה פתוח; אידיאלי חתך אחד צריך להיות מנוצל לפעור פתח שלפוחית השתן. בנוסף, החתך צריכה להיעשות תוך קר הציבורית, כדי למנוע אובדן בשוגג של תאים או רקמה בשלפוחית השתן במהלך התהליך.
הפה pipetting של IBCs ב פרוטוקול זה מספק שליטה רבה יותר על תהליך בחירת תאים, כמו גם הגבלת הנפח הסופי של פתרון הועבר יחד עם התא. שליטה טובה והפרדה גדול של פתרון מפיו החוקרים גם הגדלת הבטיחות של החוקרת, כמו אמצעי האחסון הועבר נמצאים במרחק nanoliter microliter לטווח. לעומת זאת, הניסיון שלנו עם micropipette המודרנית היא כי הוא נוטה להעביר יותר של נוזלים המקיפים תאים עם IBC, שעלול כדי זיהום בחיידקים luminal חוץ-תאית. מציאת שלנו כי הפה pipetting מספק ביצועים גבוהים יותר מעל שאר תא בודד שיטות בידוד גם דווחה על-ידי אחרים מעבדות22,23,24. מלבד בידוד תא בודד, הפה pipetting אפילו כבר בשימוש אלקטרופורציה תא בודד של נוירונים25, אשר בהמשך מדגים השירות והפקד דקה חוקר מיומן יכול להשיג עם הטכניקה. עם זאת, בטיחות ישנה חשיבות רבה, אנו מציעים פוטנציאליים לנקוט צעדים נוספים שניתן לנקוט בהתאם פתוגנים בשימוש: (i) ההרחבה של המאגר אוויר בין החוקר לבין החומר הביולוגי, לדוגמה על-ידי שימוש כ רפה בעברית פיפטה עם נפח גדול (למשל, 5 מ ל), או (ii) הוספת מסנן פיזי כמו צמר גפן לתוך פיפטה שואבת לשמש מכשול נוסף.
במקרים שבהם הערכת סיכונים מוביל למסקנה כי הפה pipetting הוא עדיין מסוכן מדי, זמינים מסחרית setups רובוטית (כגון אלה שימשו nanoinjections) יכול להיות משולב עם סעיפים אחרים של הטכניקה שלנו כדי לספק שיטה בטוחה יותר בידוד תאים נגועים של אוכלוסיות מעורבות. יצוין כי הניסיון שלנו עם שימוש של micromanipulator רובוטית הוכיח שיעור מופחת של בידוד IBC בהשוואה הפה pipetting, כמו וריאציה התוך ניסיוני גדול בגודל תאים אפיתל שלפוחית השתן הופך אותו מאתגרת עבור המשתמש של זרוע רובוטית כדי לקבוע את הכוח הנדרש כדי לאסוף IBCs יחיד. למרות זאת, נותר אופציה בת קיימא, למרות costlier, אלה שעבדו עם סוכנים מאוד מדבקת של המחלה.

דלקת בדרכי השתן (זיהומים) הם אחד זיהומים חיידקיים השכיחה ביותר. המשוער 40-50% מהנשים צפויים לחוות לפחות אחד זיהום בדרכי השתן (UTI) במהלך כל החיים שלהם1. אחד הסוכנים הראשיים של UTI הוא uropathogenic e. coli (UPEC), אילו חשבונות עבור יותר מ 70% של אוטיס מסובכת2. יתר על כן, בערך רבע של אלו של UTI יהיה זיהום חוזר ונשנה, לעיתים קרובות נגרמת על ידי המתח זהה, למרות טיפול אנטיביוטי מתאים3. שכיחות גבוהה של UTI מייצג נטל משמעותי במערכות הבריאות, עולה יותר מ 2 מיליארד דולר בשנה ב ארה ב4. יתר על כן, השימוש באנטיביוטיקה לטיפול זיהומים בדרכי השתן מוביל גם המחירים העולה עמידות לאנטיביוטיקה, וזו הדאגה לבריאות הציבור העיקריים5.
לכן, מאמץ גדול הושם אל תוך הבנת המנגנונים שבאמצעותו UPEC מדביק בדרכי השתן, כמו גם היכולת שלו לגרום דלקות חוזרות ונשנות-6,-7,-8. בפרט, דגם העכבר של זיהום שימש לבחון מאפיינים בקטריאלי, המארח שתורמים UTI8. זה המודל העכבר יש את היתרון של להיות רלוונטי שלא שונתה זנים קליניים מבודדים מחולים אנושי. מודל זה הוביל גם הגילוי של מסלולים חיידקי druggable פוטנציאל חשוב עבור הקמת UTI, כגון סוג 1 pilus9 ו ברזל רכישת מערכות10.
לעומת הצלחות אלה לומדים את האירועים מוקדם ב- UTI, ידע של המנגנונים UTI חוזרים ונשנים עדיין חסר11. אחת ההשערות היא כי UPEC מתחמק טיפול אנטיביוטי גורם דלקות חוזרות בשלפוחית השתן על ידי יצירת קהילות חיידקי תאיים (IBCs) בתוך תאי אפיתל שלפוחית השתן. IBCs זוהו במודלים מאתר של זיהום והן אנושית UTI חולים12,13. הנוכחות של IBCs בדגימות שתן מחולים UTI בילדים היה קשור עם שיעור גבוה יותר של הישנות14,15. עם זאת, בידוד IBCs וללמוד את החיידקים בתוכם הוכיחה להיות טכנית מאתגר בשל נדירותם; ההערכה היא כי מאתר שלפוחית השתן נגוע בדרך כלל יש רק 10-100 IBCs16. יתר על כן, תאי אפיתל שלפוחית השתן גדולות יחסית (50-120 מיקרומטר)17, שהופך אותו מאתגר לפרוס פלורסצנטיות בסיוע מיון תא (FACS) לאור העובדה חרירי FACS טיפוסית מתוכננים עם קטרים של מיקרומטר 70 או 100 מיקרומטר. לפיכך, תאים גדולים כמו תאים אפיתל שלפוחית השתן מוסרות לעיתים קרובות על-ידי סינון לפני FACS כדי למנוע סתימת פלואידיקה.
המעבדה שלנו לאחרונה תיאר שיטה כללית וחסכוני לבודד תאים נגועים נדיר של תערובות כגון שרוטים לתאי האפיתל של שלפוחית השתן18. לבודד ביעילות IBCs, השתמשנו הפה מסורתיים pipetting. Micropipetting הפה הוא טכניקה זמן רב השתמשו המיקרומניפולציה של תאים בודדים, העוברים על ניתוח במורד הזרם19,20,21,22,23, 24 , 25. הפה מסורתי pipetting כמויות גדולות נוזלי (ב מיליליטר) לעיתים קרובות היה הגורם מעבדה בנושא תאונות, הטכניקה התרחקה בצדק בהרבה של קהילת המחקר מחוץ אמבריולוגיה מסורתי, יישומים תא בודד. פרוטוקול שלנו הוא בהשראת הגירסאות תא בודד של19,טכניקה20, אשר לצמצם את הסיכון באמצעות חוצץ גדול (> 2 מ"ל) של אוויר בין החוקר לבין מדגם לעומת הנפח של נוזלים הועבר (< 1 ΜL). שיטה זו גם מנצל הפקד בסדר הפה micropipetting מספקת, אשר מתורגם נפח סופי נמוך סביב פתרון הועבר וטוהר גבוהה של תאים מבודדים. הטכניקה משתמשת חומרים זולים (< 50 דולר), וכך צריך להיות ריאלי ליישם כל מעבדות.
פרוטוקול חזותי זה מתאר את הטכניקה הבידוד שלנו IBC, ומספק הפניה כדי לסייע לחוקרים אחרים המבקשים לשכפל בטכניקה זו. החוקר צריך גישה במיקרוסקופ ויבתר פלורסנט (או ציוד דומים) זה יכול לשמש כדי להמחיש תאים אפיתל בודדים, החיידק פלורסנט במהלך דימות בשידור חי, עם שלב ההדמיה פתוח ונגיש עבור micropipetting (ראה טבלה של חומרים עבור הפרטים של המיקרוסקופ משמש, על פי מודלים אחרים המקבילה כלי עשוי לשמש גם). בעוד פרוטוקול זה יתמקד IBCs במודל של מאתר של UTI, שיטות דומות צריך להיות רלוונטי לבודד תאים נגועים מ תא המתלים במודלים אחרים של זיהום.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:939px;" width="939">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5ml eppendorf tube</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:428px;">For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100% ethanol</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For Alcohol Burner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml conical tube</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1ml Tuberculin Syringe</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3% Bacterial Agar</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aesculap anatomic forceps</td>
			<td style="width:176px;">Braun/Kruuse</td>
			<td style="width:119px;">BD222R</td>
			<td>For initial dissection of mouse (skin, fascia)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcohol Burner</td>
			<td style="width:176px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">237070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirating pipette</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">357558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacterial loops</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td>Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical flasks</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digital camera for microscope</td>
			<td style="width:176px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">DP71</td>
			<td style="width:428px;">For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillaries</td>
			<td style="width:176px;">Kimax</td>
			<td style="width:119px;">6148K07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iris Scissors STR SS 110MM</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BC110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isoflurane (Isothesia)</td>
			<td style="width:176px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:119px;">29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td style="width:176px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">420311</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth (Miller)</td>
			<td style="width:176px;">Thermo/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10855021</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Light source unit for microscope</td>
			<td style="width:176px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">LG-PS2</td>
			<td style="width:428px;">For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lubricant&#160;</td>
			<td style="width:176px;">KY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any similar commercial medical lubricant will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Macro fluorescence microscope</td>
			<td style="width:176px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">MVX10</td>
			<td style="width:428px;">For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette + micropipette tips</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 1x</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette controller + Pipettes</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td style="width:176px;">BD Intramedic</td>
			<td style="width:119px;">427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Precision Glide needle 30G</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305107</td>
			<td>Possibly under new catalogue number (305106)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Splinter forceps curved</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BD312R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spray bottle (for ethanol)</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Square cuvettes</td>
			<td style="width:176px;">Elkay</td>
			<td style="width:119px;">127-1010-400</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterilgard III Advance Safety Cabinet</td>
			<td style="width:176px;">Baker</td>
			<td style="width:119px;">SG403</td>
			<td>Any biosafety cabinet with a UV irridiator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterilin 90mm Standard Petri Dish</td>
			<td style="width:176px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">101VR20</td>
			<td>Any sterile petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">OK366R</td>
			<td>Recommended for harvesting of bladder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Surgical Scissors STR S/B 105MM</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BC320R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810R</td>
			<td>Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">WPA C08000 cell density meter</td>
			<td style="width:176px;">Biowave (Biochrom)</td>
			<td style="width:119px;">80-3000-45</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of single intracellular bacterial communities generated from a murine model of urinary tract infection for downstream single-cell analysis

במאמר זה, אנחנו חלוקה לרמות הליך נהגו לבודד את קהילות חיידקי תאיים בודדות של עכבר זה נדבק בווירוס השפעול בדרכי השתן. הפרוטוקול ניתן לחלק לשלושה חלקים: זיהום, קציר תאים אפיתל שלפוחית השתן, או micropipetting הפה בידוד תאי האפיתל הנגוע בודדים. תא אפיתל מבודד מכיל תאים חיידקיים קיימא, כמעט ללא תשלום של מזהם חיידקים חוץ-תאית, שהופך אותו אידיאלי עבור ניתוח מתא בודד במורד הזרם. הזמן שנלקחו ההתחלה של זיהום להשגת קהילה חיידקי תאיים יחיד הוא בערך 8 שעות. פרוטוקול זה לא יקר לפרוס ומשתמש בחומרים זמינים באופן נרחב, אנו צופים כי זה יכול גם להיות מנוצל במודלים אחרים זיהום ' כדי לבודד תאים נגועים בודדים מן התא תערובות גם אם תאים נגועים אלה הם נדירים. עם זאת, בשל סיכון פוטנציאלי בתוך הפה micropipetting, פרוצדורה זו אינה מומלצת מאוד מדבקים.

מלבד אישור (איור 3ד') של המצאות IBC מבודד יחיד בצינור אוסף באמצעות המיקרוסקופ ויבתר, הטוהר של IBC מבודד יכולה גם להיות מאושרות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. כפי שמוצג באיור 4א, תאים מבודדים צריך כתם עבור e. coli ו- uroplakin, גודל הצפוי עבור IBCs (50-120 מיקרומטר)17. יתר על כן, e. coli מכתים אינו נוכח בתוך הנוזל שמסביב. בהתבסס על הנתונים שלנו, יותר מ- 90% של תאים מבודדים עם טכניקה זו הם IBCs18. לאחר בידוד, הנוכחות ואת הכדאיות של תאי חיידקים IBC בודדים יכול להיות אישרו דרך המושבה ויוצרים יחידה (CFU) ספירה (איור 4B) או כמותית תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) עבור מקבילות גנומית ( איור 4 C)- איור 4C גם מדגים כי נגוע לתאי האפיתל מבודדת באותו הפרוטוקול אין כמויות לכימות של חיידקים. על סמך נתונים אלה, אנו מעריכים כי בטווח של CFUs ב IBC יחיד הוא2-10 103 במודל מאתר של דלקת בדרכי השתן. אחת המטרות העיקריות של בידוד IBC יחיד היא לבצע ניתוח במורד הזרם כגון רצפי RNA. כדי לוודא כי שיטת הבידוד שלנו הוא מסוגל להשיג RNA של חיידקים IBCs לניתוח, ביצענו שעתוק במהופך כמותיים פולימראז תגובת שרשרת (לרביעיית-PCR) כימות של שלושה גנים (16, cyoB, ו frdA) עבור טווח IBCs במאגר מבודדים בנפרד (איור 4D). כל המידע המוצג באיור 4 הותאם באישור Duraiswamy et al.18. סקירה סכמטית פרוטוקול הבידוד שלנו IBC ניתן לראות באיור 5, אשר שוחזרו מ Duraiswamy et al.18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig1.jpg"> איור 1 : נימים משך ידו שומרים על פתחים צרים. (א) דוגמאות משך ידו צינורות קפילר מוצגים על רקע שחור ' ניגוד '. מלמטה למעלה, על נימי unpulled, נים זה נמשכה לא במידה מספקת, על נימי יכול לשמש עבור שלפוחית השתן יחיד קציר תאים אפיתל, נימי שמשך היה דק מדי (, ובכך מופרדים לתוך שתי חתיכות) מוצגים. סרגל 15 ס מ ממוקמת בתחתית התמונה בתור קנה מידה. נקודת המשוערת של הצמדת את נימי שמיש מציינים על הדמות החץ האדום. (B) התמונה נלקחה עם מיקרוסקופ ויבתר המאשרת את קוטר פנימי חלול נימי משך (למטה). נימי unpulled ממוקם מעל כדי להדגים את ההבדל בגודל היחסי של הנימים שני. סרגל קנה מידה = 4.0 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig2.jpg"> איור 2 : ניתוח של העכבר כדי לקצור תאי אפיתל שלפוחית השתן- (א) תמונה של עכבר עם קווים לבנים הוסיף כדי לציין את מיקום משוער ואת הזווית של חתכים לחשוף את חלל הצפק מאתר ואת שלפוחית השתן. (B) תמונה של החשופים העכבר חלל הצפק שלאחר החתך. (ג) תמונה של החשופים שלפוחית השתן (חץ אדום) בולט בין הידיות השמן. (ד) תמונה של שלפוחית השתן מאתר עם הקצה של המלקחיים מוכנס לתוך לומן, עם החצים כדי לציין את הכיוון של התנועה הדרושים כדי להפוך את שלפוחית השתן. שלפוחית השתן הראשון נמשך מתחילות מעט ואז סביב והחוצה מוט הראשון של המלקחיים. כיווני תנועה לשני המעשים הם כפי שצוין על ידי החצים הלבנים ממוספרים 1 ו- 2. (E) תמונה המציגה את המיקום הסופי של שלפוחית השתן הפוכה מוכנס אל מוט השני של המלקחיים. המוטות של המלקחיים מסומנות בשתי החלוניות D ו- E עם חצים אדומים וטקסט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig3.jpg"> איור 3 : IBC קציר מתאי שלפוחית השתן- (א) שלפוחית השתן נגוע, הפוך בפתרון PBS קר לפני תא גירוד. (B) תמונה המציגה שיפשף תאים שלפוחית השתן כפי שנראה במיקרוסקופ. IBCs יכול להיות מזוהה אגרגטים ניאון ירוק גדול גם תמונות (ראה חצים אדומים). (ג) תמונה של השלים הפה micropipetting מכשיר. שואבת פיפטה עצה פיפטה, ליניקת צינור, צינור קפילרי משך מזוהים עם החצים ממוספרות כמצוין בצד הימין. (D) תמונה של יחידה מבודדת IBC הכליון אוסף 1.5 mL (המתוארים באדום). סרגלי קנה מידה (כפי שמצוין) מיוצגים על ידי קווים לבנים פאנלים א', ב' וד' <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig4.jpg"> איור 4 : IBCs שנקטפו טהור והוא יכול לשמש לניתוח במורד הזרם. דמות זו שונתה באישור ואח Duraiswamy18. (א) תמונות של שני תאים GFP-חיוביות מבודד היו מוכתמים נוגדנים anti-uroplakin ו- anti -e. coli . התא הראשון (IBC 1) יש תמונות של ערוצים בודדים (בהגדלה נמוכה), משמאל, תמונת הממוזג גבוהה ההגדלה היא בצד הימין. התא השני (IBC 2) מוצג בהגדלה בערוצים הממוזג ואישי. סרגלי קנה מידה הן כמצוין. הדנ א הוא מוכתם 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), מיוצגים בערוץ הצבע הכחול. אנטי -e. coli הוא מוכתם של נוגדנים משניים מצומדת כדי fluorescein isothiocyanate (FITC), ייצג לערוץ הצבע הירוק. Anti-uroplakin הוא מוכתם של נוגדנים משניים מצומדת כדי tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), ייצג את הערוץ האדום. CFUs חיידקי (B) מ- IBCs מבודדים. IBCs היו מעובדים באופן מיידי, או מודגרות ב- 0.1% טריטון-X עבור 10 או 30 דק CFU איחדו סעיפים של IBCs בודדים מבודד n = 3 ניסויים נפרדים מוצגים. גבול של זיהוי = יומן 0.710 CFUs/IBC. נקודות אדומות המותווית על גבול זיהוי מציינים דוגמאות אשר נמצאו אין מושבות. כל הדגימות המכילות IBC אינם שונים באופן משמעותי (p > 0.05, מבחן מאן-ויטני); בתאי אפיתל נגוע שונים באופן משמעותי הנתונים IBC (10 דקות) (0.001 <p , מבחן מאן-ויטני). (ג) qPCR כימות של חיידקים על IBCs בודדים ותאי אפיתל נגוע לאחר דגירה 10 דקות ב- 0.1% טריטון-X (*, p < 0.0001, מבחן מאן-ויטני, n = 4). גבול של זיהוי = 1.18 יומן10 גנום חיידקי מקבילות/מבני תעשייה. הנקודות האדומות מציינות דגימות שעבורו אין מושבות ששוחזרו על titering בלוח ב' (D) כימות של מטוסי אף-16 גנים rRNA, cyoB, ו frdA עבור מספר משתנה של IBCs במאגר מבודדים בנפרד (n = 1 ניסוי; אחד נקודת ציון הממוצע של משכפל טכני 3). NC = אין שליטה שלילי של ה-DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig5.jpg"> איור 5 : שרטוט ותצלומים הקשורים שלה המייצג את ניתוקה של IBCs דרך הפה micropipetting מן נגוע עכברים שלפוחיות. איור זה מתרבה מ Duraiswamy et al.18. (א) A לקצור כל שלפוחית השתן; (B) הפוך כל שלפוחית השתן חושפת את ה-GFP לבטא IBCs; (ג) תקריב של קצה שלפוחית השתן שרוטים מציג IBCs בודדים ההשעיה במאגר סמוכים; (ד) יחידה מבודדת IBC pipetted לתוך צינור. חצים אדומים בחלונית B מציינים דוגמאות GFP-חיוביות IBCs על פני השטח luminal של שלפוחית השתן. קו מקווקו אדום בחלונית C מציין את הגבול הימני של שלפוחית השתן הפוכה (מסומן בתור "BL"); חצים אדומים בחלונית C עולה לכאורה GFP-חיוביות אפיתל תאים בודדים זה שורטת מעל פני השטח שלפוחית השתן. קו מנוקד לבן בחלונית D מציין droplet sub micropipetted-microliter המכיל IBC מבודדים, אשר מסומן על ידי חץ לבן. גודל ברים = 2 מ מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis at JoVE.c

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה של לבודד תאים אפיתל יחיד, שלפוחית השתן נגוע של המודל מאתר של דלקת בדרכי השתן.

בידוד של אחת הקהילות חיידקי תאיים שנוצר ממודל מאתר של זיהום בדרכי השתן לניתוח תא בודד במורד הזרם

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

קהילות חיידקים תאיים, או IBCs, נצפו בעכברים שקיבלו זיהומים ניסיוניים בדרכי השתן, או UTIs. הם גם נראו במשיעי השתן של חולי UTI אנושיים. הטכניקה שאנו מתארים היום היא דרך לבודד IPCs יחיד מעכברים נגועים בניסויים.טכניקת micropipetting הפה היא הטכניקה היחידה הזמינה כיום עבור בידוד חיידקים תאיים משלפוחיות עכבר נגועות. כדי להכין פיפיות פה זכוכית, לצבוט בחוזקה את שני הקצוות של צינור נימי זכוכית באופן שווה לסובב את אמצע הצינור קדימה ואחורה לאורך הציר שלה על מקור להבה פתוח. כאשר הזכוכית הופכת רכה, להסיר את נימי ממקור החום ומיד למשוך את הזכוכית לגזרים.האורך הסופי האידיאלי של נימי משך הוא שלושה עד חמישה סנטימטרים יותר נימי unpulled כדי להבטיח קוטר פנימי מתאים לבודד תאים אפיתל שלפוחית השתן יחיד. כאשר הזכוכית התקררה, בדוק אם אמצע נימי הזכוכית צר יותר ושפנים הצינור עדיין חלול. להרים את הקצה הגדול של נימי משך ביד אחת, להשתמש מדפים כדי לתפוס את נימי בנקודה הצרה ביותר שלה, לוודא המדפים מופעלים עם מספיק כוח כדי לאחוז נימי בחוזקה מבלי למחוץ אותו.סובב במהירות את המדפים כדי לצלם את נימי המשכה בנקודה הצרה ביותר. לאחר מכן, מניחים את נימי בגודל מיקרופיפט בפה בצלחת פטרי 100 מילימטר ו UV לעקר את המנה במשך 30 דקות. כדי לקצור את שלפוחית השתן, מניחים עכבר בתצורת supine ולעקר את אזור הבטן עם 70% אתנול.באמצעות ממטרים מעוקרים אתנול ומספריים כירורגיים, לבצע חתך עור רוחבי בסנטימטר אחד מעל פתח השופכה ולהרחיב את החתך באלכסון לכיוון הגפיים העליונות של העכבר כדי ליצור חתך בצורת V לאורך כל החלק הראשון של העכבר החושף את התוכן של peritoneum. באמצעות כלים מעוקרים חדשים, בעדינות לדחוף למטה על רפידות השומן ליד אזור האגן של העכבר כדי לגרום לשלפוחית השתן לבוט ולתפוס את שלפוחית השתן החשופה על שיא. שמירה על אחיזה איתנה על שלפוחית השתן, לחתוך את השופכים ואת השופכה כדי לשחרר את שלפוחית השתן ולהכניס את הקצה של פיר אחד של מדפים מעוגל לתוך פתיחת שלפוחית השתן שבו זה היה רק חרות.שחררו את המלכודות שאוחזות את העופרת ושומרות על המדפים מעוגל סגורים כמעט לחלוטין, השתמשו בזוג מלכודות שני כדי למשוך בעדינות את הקצה החיצוני של הפה של שלפוחית השתן הרחק מהמדפים העגולים ומסובבים את הקצה השני של המדפים המגולפים כדי להפוך את שלפוחית השתן מבפנים החוצה. לאחר מכן, השתמש בזוג המדפים השני כדי לפתות בעדינות את שלפוחית השתן ההפויה מקצות הממטרים למיליליטר אחד של PBS קר. ובעדינות לגרד את שכבת התא האפיתל הפנימי בצד החיצוני של שלפוחית השתן הפוכה עם שני זוגות של מדפים נקיים.כאשר כל התאים כבר גירד, להכניס את הקצה unpulled של נימי זכוכית משך לתוך תקע הגומי של צינור שאפתן להתאים בחוזקה את הקצה הצר של קצה פיפטה מיליליטר אחד לתוך הקצה הפתוח השני של הצינור. התאימו היטב את הקצה הצר של פיפטה שאפתנית של שני מיליליטר לקצה הפתוח והרחב יותר של קצה החלילן המיליליטרי והמקום את מתלי התאים השרוטים תחת מיקרוסקופ ניתוח. באמצעות הגדלה של פי 20 עד 40, זהה את ה- IBCs כאגרגטים פלואורסצנטיים גדולים וטבול את הקצה המשובח של נימי הזכוכית בצינור טרי של PBS לשנייה אחת כדי להפחית את ספיגת נפח לא רצוי באמצעות פעולה נימית.כאשר IBC של עניין כבר ממוקם, לאט להביא את הקצה הפתוח של הצינור נימי לכיוון IBC ולהחיל כוח יניקה קטן מאוד על פיפטה שאפתן להנחות את IBC לתוך נימי הזכוכית. לאחר מכן, להעביר את נימי ריק 1.5 צינור צנטריפוגה מיליליטר ולהחיל לחץ חיובי קל לגרש את טיפה IBC לתוך הצינור. בנוסף לאישור נוכחותו של IBC מבודד אחד בצינור האיסוף באמצעות המיקרוסקופ המ לנתח, טוהר IBC המבודד יכול להיות מאושר על ידי מיקרוסקופ קונפוקלים.התאים המבודדים צריכים להכתים הן E.coli והן uroplakin צריך להיות בין 50 ל 120 מיקרומטר בגודל. לאחר הבידוד, ניתן לאשר את נוכחותם וכדאיותם של תאי החיידקים ב- IBC הבודד באמצעות כימות יחידה יוצרת מושבה או תגובת שרשרת פולימראז כמותית למקבילות גנומיות. יש לציין, תאי אפיתל לא מושפעים מבודדים עם אותו פרוטוקול אינם מדגימים כמויות לכימות של חיידקים.יתר על כן, ניתוח תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך כמותי מאשר את נוכחותם של גנים חיידקיים במגוון של IBCs מבודדים ומגובים בנפרד. תמיד לוודא כי micropipette הפה יכול להרים ולגרש נוזל בקלות. אל תהססו לשנות את נימי או את המנגנון כולו אם micropipette הפה מרגיש occluded.טכניקת מיקרופיטינג בפה זו מאפשרת לנו לחקור באופן ישיר ומפורש את האוכלוסיות תאיות הטופס במהלך UTI ניסיוני. ללא טכניקה זו, אוכלוסיות תאיים אלה יהיו מזוהמים בחיידקים חוץ-תאיים ונחיתות במספרם. כמה סוכנים זיהומיות אחרים עשויים להיות בקלות רבה יותר aerosolized או מועבר מאשר E.coli השתמשנו ביישום זה.במקרים אלה, פקדים נוספים מסוימים עשויים אפוא להיות מוצדקים, כגון הוספת מסנן או הארכת הצינור, בהתאם ליישום בו נעשה שימוש. IBCs מבודדים באמצעות טכניקת micropipetting הפה זה עשוי לשמש בניתוחים אחרים במורד הזרם תא יחיד, כגון QRTPCR או רצף RNA.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

אינדוקציה Transurethral של דלקת בדרכי השתן עכבר

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

זיהום בדרכי השתן במודל בעלי חיים קטנים: צנתור-Transurethral של זכר ונקבה עכברים

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...