Name: isolation of single intracellular bacterial communities generated from a murine model of urinary tract infection for downstream single-cell analysis
Uploaded: 2019-04-16T12:30:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis at JoVE.c

Это исследование было поддержано в Национальный исследовательский фонд, офис премьер-министра, Сингапур, под своей программы стипендий исследования СРН (NRF награду нет. NRF-RF2010-10); Министерство здравоохранения Сингапура Национальный медицинский исследовательский совет (NMRC/CIRG/1358/2013); и Института генома Сингапура (ГИС) / агентство по науке, технологии и научных исследований (A * STAR).

<ol>
	<li>Barber, A. E., Norton, P. J., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Tract+Infections:+Current+and+Emerging+Management+Strategies.">Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies.</a> Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).</li><li>Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infections:+epidemiology,+mechanisms+of+infection+and+treatment+options.">Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options.</a> Nature Reviews Microbiology. 13, 269-284 (2015).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurring+urinary+tract+infection:+incidence+and+risk+factors.">Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors.</a> American Journal of Public Health. 80, 331-333 (1990).</li><li>Foxman, B., Barlow, R., D'Arcy, H., Gillespie, B., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection:+self-reported+incidence+and+associated+costs.">Urinary tract infection: self-reported incidence and associated costs.</a> Annals of Epidemiology. 10 (8), 509-515 (2000).</li><li>Zowawi, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+threat+of+multidrug-resistant+Gram-negative+bacteria+in+urology.">The emerging threat of multidrug-resistant Gram-negative bacteria in urology.</a> Nature Reviews Urology. 12, 570-584 (2015).</li><li>Silverman, J. A., Schreiber, H. L., Hooton, T. M., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+physiology+to+pharmacy:+developments+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+recurrent+urinary+tract+infections.">From physiology to pharmacy: developments in the pathogenesis and treatment of recurrent urinary tract infections.</a> Current Urology Reports. 14, 448-456 (2013).</li><li>Sivick, K. E., Mobley, H. L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waging+war+against+uropathogenic+Escherichia+coli:+winning+back+the+urinary+tract.">Waging war against uropathogenic Escherichia coli: winning back the urinary tract.</a> Infection and Immunity. 78, 568-585 (2010).</li><li>Hung, C. -. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4, 1230-1243 (2009).</li><li>Cusumano, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infection+with+orally+active+FimH+inhibitors.">Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors.</a> Science Translational Medicine. , (2011).</li><li>Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+Immunization+with+Iron+Receptor+Antigens+Protects+against+Urinary+Tract+Infection.">Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection.</a> PLoS Pathogens. , (2009).</li><li>Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+uropathogenic+Escherichia+coli+persistence+and+eradication+from+the+urinary+tract.">Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2006).</li><li>Hunstad, D. A., Justice, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+lifestyles+and+immune+evasion+strategies+of+uropathogenic+Escherichia+coli.">Intracellular lifestyles and immune evasion strategies of uropathogenic Escherichia coli.</a> Annual Review of Microbiology. 64, 203-221 (2010).</li><li>Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+bacterial+communities+in+human+urinary+tract+infection.">Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection.</a> PLoS Medicine. , (2007).</li><li>Robino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+bacterial+communities+in+a+child+with+Escherichia+coli+recurrent+urinary+tract+infections.">Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections.</a> Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).</li><li>Robino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+bacteria+in+the+pathogenesis+of+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+children.">Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children.</a> Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).</li><li>Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+and+niche+distribution+of+uropathogenic+Escherichia+coli+during+acute+and+chronic+urinary+tract+infection.">Population dynamics and niche distribution of uropathogenic Escherichia coli during acute and chronic urinary tract infection.</a> Infection and Immunity. 79, 4250-4259 (2011).</li><li>Keshtkar, A., Keshtkar, A., Lawford, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+morphological+parameters+of+the+human+urinary+bladder+(malignant+and+normal).">Cellular morphological parameters of the human urinary bladder (malignant and normal).</a> International Journal of Experimental Pathology. 88, 185-190 (2007).</li><li>Duraiswamy, S., Chee, J. L. Y., Chen, S., Yang, E., Lees, K., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Intracellular+Bacterial+Communities+during+Experimental+Urinary+Tract+Infection+Reveals+an+Abundant+and+Viable+Bacterial+Reservoir.">Purification of Intracellular Bacterial Communities during Experimental Urinary Tract Infection Reveals an Abundant and Viable Bacterial Reservoir.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2, 739-752 (2007).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+and+stochastic+allele+specific+gene+expression+in+single+mouse+blastomeres.">Deterministic and stochastic allele specific gene expression in single mouse blastomeres.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>Wells, J. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+mouse+endoderm+is+patterned+by+soluble+factors+from+adjacent+germ+layers.">Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers.</a> Development. 127, 1563-1572 (2000).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+DNA+methylome+landscapes+of+mammalian+cells+with+single-cell+reduced-representation+bisulfite+sequencing.">Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing.</a> Nature Protocols. 10 (5), 645-659 (2015).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+clonally+derived+chicken+embryonic+fibroblast+cell+line+(CSC)+with+high+transfection+efficiency+and+ability+as+a+feeder+cell.">The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell.">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nature Protocols. 5 (3), 516-535 (2010).</li><li>Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporation+of+Neurons.">Single-Cell Electroporation of Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2017).</li><li>Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Characterization+of+UTI+and+CAUTI+in+a+Mouse+Model.">Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), 52892 (2015).</li><li>Justice, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+developmental+pathways+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+urinary+tract+pathogenesis.">Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).</li><li>Mulvey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+Evasion+of+Host+Defenses+by+Type+1-Piliated+Uropathogenic+Escherichia+coli.">Induction and Evasion of Host Defenses by Type 1-Piliated Uropathogenic Escherichia coli.</a> Science. 282 (5393), 1494-1497 (1998).</li><li>Zhang, H., Susanto, T. T., Wan, Y., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mutagenesis+of+the+fimS+promoter+regulatory+switch+reveals+novel+regulation+of+type+1+pili+in+uropathogenic+Escherichia+coli.">Comprehensive mutagenesis of the fimS promoter regulatory switch reveals novel regulation of type 1 pili in uropathogenic Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), 4182-4187 (2016).</li><li>Gally, D. L., Bogan, J. A., Eisenstein, B. I., Blomfield, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+regulation+of+the+fim+switch+controlling+type+1+fimbrial+phase+variation+in+Escherichia+coli+K-12:+effects+of+temperature+and+media.">Environmental regulation of the fim switch controlling type 1 fimbrial phase variation in Escherichia coli K-12: effects of temperature and media.</a> Journal of Bacteriology. 175 (19), 6186-6193 (1993).</li><li>Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+Enhance+Male+Urinary+Tract+Infection+Severity+in+a+New+Model.">Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1625-1634 (2016).</li><li>Garofalo, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+from+Urine+of+Female+Patients+with+Urinary+Tract+Infections+Is+Competent+for+Intracellular+Bacterial+Community+Formation.">Escherichia coli from Urine of Female Patients with Urinary Tract Infections Is Competent for Intracellular Bacterial Community Formation.</a> Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).</li><li>Berry, R. E., Klumpp, D. J., Schaeffer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+cultures+support+intracellular+bacterial+community+formation+by+uropathogenic+Escherichia+coli.">Urothelial cultures support intracellular bacterial community formation by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 2762-2772 (2009).</li><li>Holden, N., Totsika, M., Dixon, L., Catherwood, K., Gally, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+P-fimbrial+phase+variation+frequencies+in+Escherichia+coli+CFT073.">Regulation of P-fimbrial phase variation frequencies in Escherichia coli CFT073.</a> Infection and Immunity. 75 (7), 3325-3334 (2007).</li><li>Jost, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+growth+of+the+mouse+bladder.">Postnatal growth of the mouse bladder.</a> Journal of Anatomy. 143, 39-43 (1985).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Протокол, который мы описали позволяет для изоляции одного КСГМГ из мышиных модели ИМП. Этот протокол изолирует КСГМГ, содержащие жизнеспособные внутриклеточных бактерий, которые могут быть проверены путем культивирования для ГРУ. Протокол результаты внутриклеточных бактерий от КСГМГ с мало загрязнения внеклеточного бактериями, позволяя для дальнейшей характеризации обоих бактерий и принимающей ячейки от IBC (рис. 4C). Мы также показывают, что бактерии из одного IBC может использоваться в нисходящие приложения, например ПЦР (рис. 4C), предполагая, что наша техника может использоваться для процесса КСГМГ для других в пробирке анализов. Объединив бактерий, добываемых из всего лишь 5 КСГМГ, мы еще больше продемонстрировать нашу способность выполнить qRT ПЦР-анализа на три бактериальных генов, предполагая, что хорошее качество РНК могут быть собраны из бактерий в наших изолированных КСГМГ (рис. 4D). Комбинированные, которую мы показали данные указывают, что анализ генома общесистемной РНК (например, РНК последовательности) на одном КСГМГ может быть возможно с помощью этой техники изоляции.
В этом протоколе мы сосредоточились на момент времени 6 h, потому что, когда IBC номера пик в пузырях черный 6 мышей, инфицированных UTI8927. Кроме того мы также использовали систему статический бактериальной культуры для повышения уровня экспрессии pilus типа 1 в UTI89. Выражение типа 1 pilus имеет решающее значение для кишечной палочки для присоединения к и инфицировать эпителиальные клетки мочевого пузыря28. Однако это выражение является жестко регулируемых29 и экологические сигналы, как известно, изменить его30. Чтобы поддерживать последовательную инфекции фенотипа и достаточного количества КСГМГ, мы рекомендуем использовать статические бактериальной культуры 2 x 24 h (слегка изменен Hung et al.8) и 6 h инфекции момент при работе с ранее протестированных E. coli штаммов, таких как NU14 и UTI8928,29. Однако вполне возможно, что эти переменные нужно будет корректироваться в другие штаммы UTI или другие штаммы мышей, чтобы получить идеальное количество КСГМГ от каждой инфекции.
Хотя протокол от Hung et al.8 использует только самок мышей, другие установленные протоколы для создания инфекции мочевыводящих путей у мышей-самцов были сообщил31. В этой модели цистит у мышей-самцов также следовать пути IBC. Как пузыри мужские и женские мышей имеют одинаковый размер, мы ожидаем, что наш Протокол изоляции IBC может использоваться на зараженных мышей-самцов также.
Относительно простой технологии, используемые в настоящем Протоколе также гарантирует, что он может быть развернут в большинстве лабораторий. Одним из ключевых шагов, участвующих в настоящем Протоколе является потянув из стеклянных капилляров для создания microcapillaries для выбора ячейки типа интереса. Этот шаг позволяет гибкость в диаметры microcapillaries создан, и таким образом метод может быть расширен для нескольких различных целевых типов клеток. Однако из-за присущего различия в создании этих капилляров, должны быть осторожность для обеспечения того, чтобы окончательный диаметр используемого диапазона. Если капилляры являются слишком узкими, они не могут подобрать клетки интереса, но если они являются слишком широкими, несколько ячеек может быть выбран в одной попытки. Кроме того использование открытого пламени во время процесса капиллярного потянув носит имманентный риск ожогов и огня, поэтому исследователь, пытаясь создать microcapillaries должны заботиться, чтобы предотвратить появление таких событий. Чтобы снизить изменчивость, а также открытые пожароопасных участвует в принятии этих капилляров, исследователь может сделать использование традиционных микропипеткой, потянув машины, такие как те, которые используются для электрофизиологических экспериментов (например, PC-100, Narishige группы). Как сделать эти машины использовать тяжести или роботизированной платформы, чтобы вытащить капилляров, они могут быть приспособлены для удовлетворения потребностей в модели инфекции. Однако широкий спектр микропипеткой, потянув машин будет означать, что индивидуальный исследователь нужно будет пройти через несколько проб и ошибок, чтобы определить соответствующий окончательный диаметр капилляра для использования с настоящим Протоколом.
Представленные протокол использует бактерий, выражая флуоресцентные метки для визуально определить КСГМГ. Таким образом эта техника ограничивается способность исследователей генетически модифицировать инфекционными организма. Специально для УПЭК формирования IBC штаммов, таких как CFT073 и NU14 были успешно преобразованы с GFP-выражая плазмид32,,3334; Поэтому их следует использовать в тот же протокол. Основываясь на область мочевого пузыря (70 мм2) мыши35, длина отдельных эпителиальных клеток (50-120 мкм)17и частота КСГМГ в одном пузыря16, консервативная оценка для случаев КСГМГ идет о 1 в 1000 клетки (или 0,1%). Эта оценка демонстрирует полезность наших клеток Протокол изоляции для редких событий. Точность клеточной селекции через наш протокол и широкий круг диаметром капилляров, которые могут быть выведены предполагают, что этот протокол может использоваться для изоляции внутриклеточных бактерий от других моделей в vivo и in vitro инфекции. Действительно мы успешно использовали этот метод для изоляции инфицированных искусственного мочевого пузыря эпителиальных клеток (данные не показаны).
Одним из наиболее технически сложных шагов в протоколе инверсия мочевого пузыря подвергать эпителиальных клеток для соскабливания. Мы нашли, что это также можно сделать надрез на пузырь, чтобы скошенный его для соскабливания. Однако следует позаботиться о том, чтобы уменьшить ущерб в эпителиальные клетки мочевого пузыря во время процесса резки открытым; в идеале разрубом один должны использоваться для скошенный открытым мочевого пузыря. Кроме того в холодной PBS, для предотвращения случайной потери клеток или тканей мочевого пузыря во время процесса следует сократить.
Рот закупорить КСГМГ в этот протокол обеспечивает больший контроль над процесс отбора клеток, а также ограничение окончательный объем раствора, передаваемых вместе с ячейки. Точное управление и большие разделение решения от исследователей рот также увеличивает безопасность исследователя, как тома переданы находятся в пределах nanoliter микролитр диапазон. Напротив наш опыт работы с современной микропипеткой является, что она стремится передавать больше окружающих жидкости и клетки с IBC, потенциально ведет к загрязнению с внеклеточного Люминал бактерий. Наш вывод, что рот закупорить обеспечивает более высокую производительность над другими одну ячейку методы изоляции сообщалось также в других лабораториях по22,23,24. Помимо изоляции одной ячейки закупорить рот даже были использованы в одноклеточных электропорации для нейронов25, который также демонстрирует утилита и минуту управления, обученный исследователь может достичь с техникой. Однако, безопасность имеет первостепенное значение, и мы предлагаем потенциальных дополнительных мер, которые могут быть приняты в зависимости от используемого патогенов: (i) расширение буфера воздуха между исследователем и биологический материал, например с помощью аспирационных Пипетка с большего объема (например, 5 мл), или (ii) добавить физический фильтр как вата в аспирационных пипеткой выступать дополнительным барьером.
В тех случаях, когда оценки риска приводит к выводу, что рот закупорить все еще слишком рискованным коммерчески доступных роботизированной установок (например, те, которые используются для nanoinjections) могут быть объединены с другими разделами нашего технику, чтобы обеспечить безопасный метод для изоляция инфицированных клеток со смешанным населением. Следует отметить, что наш опыт с использованием роботизированной микроманипулятор продемонстрировал снижение ставки IBC изоляции, по сравнению с рот закупорить, как большой внутри экспериментальной отклонения в размерах мочевого пузыря эпителиальных клеток делает его сложным для пользователя Роботизированная рука для определения силы обязаны забрать один КСГМГ. Тем не менее он по-прежнему жизнеспособной, хотя и дороже, вариант для тех, кто работает с высоко возбудителей заболеваний.

Инфекции мочевыводящих путей (UTIs) являются одним из наиболее распространенных бактериальных инфекций. Ожидается, что примерно 40-50% женщин, опыт по крайней мере один инфекции мочевыводящих путей (UTI) во время их жизни1. Одним из главных агентов UTI является uropathogenic E. coli (УПЭК), который приходится свыше 70% неосложненной UTIs2. Кроме того приблизительно одна четверть тех, которые имеют UTI будет иметь рецидивирующие инфекции, часто вызваны же штамм, несмотря на соответствующее лечение антибиотиками3. Высокая распространенность UTI представляет тяжелым бременем на системы здравоохранения, стоимостью более 2 миллиардов долларов в год в США4. Кроме того использование антибиотиков для лечения UTIs также приводит к рост к антибиотикам, который является обеспокоенность общественного здравоохранения5.
Таким образом большое усилие было помещено в понимании механизмов, посредством которых УПЭК поражает мочевыводящих путей, а также его способность вызывать рецидивирующие инфекции6,,78. В частности модель мыши инфекции был использован для изучения бактериальных и принимающих характеристики, которые способствуют UTI8. Эта модель мыши имеет преимущество, применимых к неизмененным Клинические штаммы изолированы от человеческого пациентов. Эта модель также привело к открытию потенциально druggable бактериальной пути, важные для создания UTI, таких как тип 1 pilus9 и железа приобретения систем10.
По сравнению с эти успехи в изучении ранних событиях в UTI, знаний о механизмах, лежащих в основе периодически UTI до сих пор отсутствует11. Одна из гипотез является УПЭК избегает антибактериальной терапии и вызывает рецидивирующие инфекции мочевого пузыря, формируя внутриклеточных бактериальных сообществ (КСГМГ) внутри пузыря эпителиальных клеток. КСГМГ были определены как в мышиных моделях инфекции, так и в человеческих UTI пациентов12,13. Присутствие КСГМГ в пробах мочи в педиатрических пациентах UTI был связан с более высокой частотой повторения14,15. Однако изолируя КСГМГ и изучая бактерии в них оказалось технически сложным из-за их редкости; Предполагается, что зараженные мышиных пузыря, как правило, только имеет 10-100 КСГМГ16. Кроме того, эпителиальные клетки мочевого пузыря являются относительно большие (50-120 мкм)17, что делает его сложным для развертывания флуоресценции помощь клеток сортируя (FACS) учитывая, что типичный СУИМ сопла разработаны с диаметром 70 мкм или 100 мкм. Таким образом фильтрации до СУИМ во избежание засорения fluidics часто удаляются клетки, как большой, как эпителиальные клетки мочевого пузыря.
Наша лаборатория недавно описал общие и экономичный метод, чтобы изолировать редких инфицированных клеток от смесей, таких как царапины эпителиальные клетки мочевого пузыря18. Чтобы эффективно изолировать КСГМГ, мы использовали традиционные рот закупорить. Рот micropipetting — это метод, который уже давно используется для микроманипуляции одиночных клеток и эмбрионов для вниз по течению анализа19,20,21,,2223, 24 , 25. традиционные рот закупорить больших объемов жидкости (в миллилитрах) часто являются причиной несчастных случаев лаборатории, и техника справедливо избегали большая часть научного сообщества за пределы традиционных эмбриологии и Одноячеистый приложений. Наш протокол вдохновлен одну ячейку версий этой техники19,20, которые смягчения риска, предоставляя большой буфер (> 2 мл) воздуха между исследователем и образца, по сравнению с объем жидкости переданы (< 1 МКЛ). Этот метод также использует преимущества точного управления что рот micropipetting обеспечивает, который переводится на низкий конечный объем окружающих решения переданы и высокой чистоты изолированных клеток. Техника использует недорогие материалы (<$ 50) и таким образом должен быть реально внедрить в всех лабораториях.
Этот визуальный протокол описывает нашу IBC изоляции технику, предоставляя ссылку на помощь других исследователей, стремящихся повторить эту технику. Исследователь будет необходим доступ к флуоресцентный Микроскоп рассечения (или аналогичное оборудование), который может использоваться для визуализации отдельных эпителиальных клеток и флуоресцентные бактерий во время живых изображений, с открытой и доступной этап визуализации для micropipetting (см. Таблицу материалов для деталей Микроскоп используется, хотя другие эквивалентные инструмент модели также могут быть использованы). Хотя этот протокол будет сосредоточена на КСГМГ в мышиных модели UTI, аналогичные методы должны применяться изолировать зараженные клетки от клеточных суспензий в других моделях инфекции.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:939px;" width="939">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5ml eppendorf tube</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:428px;">For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100% ethanol</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For Alcohol Burner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml conical tube</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1ml Tuberculin Syringe</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3% Bacterial Agar</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aesculap anatomic forceps</td>
			<td style="width:176px;">Braun/Kruuse</td>
			<td style="width:119px;">BD222R</td>
			<td>For initial dissection of mouse (skin, fascia)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcohol Burner</td>
			<td style="width:176px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">237070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirating pipette</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">357558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacterial loops</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td>Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical flasks</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digital camera for microscope</td>
			<td style="width:176px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">DP71</td>
			<td style="width:428px;">For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillaries</td>
			<td style="width:176px;">Kimax</td>
			<td style="width:119px;">6148K07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iris Scissors STR SS 110MM</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BC110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isoflurane (Isothesia)</td>
			<td style="width:176px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:119px;">29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td style="width:176px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">420311</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth (Miller)</td>
			<td style="width:176px;">Thermo/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10855021</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Light source unit for microscope</td>
			<td style="width:176px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">LG-PS2</td>
			<td style="width:428px;">For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lubricant&#160;</td>
			<td style="width:176px;">KY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any similar commercial medical lubricant will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Macro fluorescence microscope</td>
			<td style="width:176px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">MVX10</td>
			<td style="width:428px;">For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette + micropipette tips</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 1x</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette controller + Pipettes</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td style="width:176px;">BD Intramedic</td>
			<td style="width:119px;">427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Precision Glide needle 30G</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305107</td>
			<td>Possibly under new catalogue number (305106)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Splinter forceps curved</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BD312R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spray bottle (for ethanol)</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Square cuvettes</td>
			<td style="width:176px;">Elkay</td>
			<td style="width:119px;">127-1010-400</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterilgard III Advance Safety Cabinet</td>
			<td style="width:176px;">Baker</td>
			<td style="width:119px;">SG403</td>
			<td>Any biosafety cabinet with a UV irridiator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterilin 90mm Standard Petri Dish</td>
			<td style="width:176px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">101VR20</td>
			<td>Any sterile petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">OK366R</td>
			<td>Recommended for harvesting of bladder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Surgical Scissors STR S/B 105MM</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BC320R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810R</td>
			<td>Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">WPA C08000 cell density meter</td>
			<td style="width:176px;">Biowave (Biochrom)</td>
			<td style="width:119px;">80-3000-45</td>
			<td>For static bacterial culture and OD measurement</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of single intracellular bacterial communities generated from a murine model of urinary tract infection for downstream single-cell analysis

В этой статье мы приводим процедуру, используемую для изоляции отдельных внутриклеточных бактериальных сообществ от мыши, который был заражен экспериментально в мочевыводящих путях. Протокол можно разделить на три секции: инфекции, заготовка эпителиальных клеток мочевого пузыря и рот micropipetting изолировать отдельные инфицированные эпителиальных клеток. Изолированные эпителиальных клеток содержит жизнеспособных клеток бактерий и почти бесплатно загрязнять внеклеточного бактерии, что делает его идеальным для вниз по течению одноклеточных анализа. Время от начала инфекции для получения единого внутриклеточных бактериальных сообщества — около 8 ч. Этот протокол является недорогим для развертывания и использует широко доступны материалы, и мы ожидаем, что он также может использоваться в других моделях инфекции изолировать один инфицированных клеток от клеток смеси, даже если эти зараженные клетки встречаются редко. Однако из-за потенциального риска в рот micropipetting, эта процедура не рекомендуется для высоко инфекционных агентов.

Помимо подтверждения (рис. 3D) присутствие одной изолированной IBC в коллекции трубку через рассечения микроскопа чистоту изолированных IBC также могут быть подтверждены confocal микроскопии. Как показано на рис. 4A, изолированные клетки должны пятно для е. coli и uroplakin и ожидаемый размер для КСГМГ (50-120 мкм)17. Кроме того E. coli окрашивание не присутствует в окружающей жидкости. Основываясь на наших данных, более чем 90% клеток, изолированные с этой техникой, КСГМГ18. После изоляции присутствие и жизнеспособность бактериальных клеток в отдельных IBC может быть подтверждена через колонии, формируя блок (CFU) перечисления (Рисунок 4B) или количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) для геномной эквиваленты ( Рисунок 4 C). рис. 4C также показывает, что неинфицированных клеток эпителия, изолированные с тот же протокол не поддающихся количественной оценке количества бактерий. Основываясь на этих данных, мы оцениваем, что диапазон CFUs в одном МКБ-102-103 в мышиных модели инфекции мочевыводящих путей. Одна из главных целей одного IBC изоляции является анализ течению например РНК последовательности. Чтобы убедиться, что наш метод изоляции является возможность получить РНК от бактерий в КСГМГ для анализа, мы провели Количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР) количественная оценка трех генов (16S, cyoB и frdA) для спектр индивидуально изолированных и обобщённые КСГМГ (рис. 4D). Все данные, показанный на рисунке 4 была адаптирована с разрешения Дурайсвами et al.18. Обзор схемы нашей IBC изоляции протокола можно увидеть в рисунке 5, который воспроизводится Дурайсвами et al.18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig1.jpg"> Рисунок 1 : Вытащил руку капилляров сохраняют узкие отверстия. (A) образцы вытащил руку капиллярных трубок отображаются на черном фоне для контраста. От дна к верхней, unpulled капилляров, капиллярные, который не был разобран в достаточной степени показаны капилляров, который может использоваться для уборки единого пузыря эпителиальных клеток и капилляров, вытащенных слишком тонкий (и таким образом разделенных на две части). Правитель 15 см помещается в нижней части изображения для масштаба. Предположительная точка для привязки от используемых капиллярное обозначается красной стрелкой на рисунке. (B) изображение взято с микроскопом рассечения, подтверждающие полые внутренний диаметр вытащил капиллярные (внизу). Unpulled капиллярной позиционируется выше продемонстрировать относительного размера разницы двух капилляров. Шкалы бар = 4,0 мм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig1large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig2.jpg"> Рисунок 2 : Рассечение мыши урожая мочевого пузыря эпителиальных клеток. (A) изображение мыши с белыми линиями, добавил сообщить ориентировочное местоположение и угол разреза подвергать мышиных брюшной полости и мочевого пузыря. (B) изображение подвергается мыши брюшной полости после разреза. (C) изображение подвергается мочевого пузыря (красная стрелка) выступающие между жировых отложений. (D) изображение мышиных мочевого пузыря с наконечником щипцы, вставляется в Люмене, со стрелками, чтобы указать направление движения необходимо инвертировать мочевого пузыря. Мочевого пузыря сначала извлекается слегка наружу, затем вокруг и первый вал щипцы. Направления движения для обоих этих действий являются как обозначается белыми стрелками, №№ 1 и 2. (E) изображения показаны окончательную позицию Перевернутый мочевого пузыря, вставить второй вал щипцы. Валы щипцы помечены в обеих панелей D и E с текстом и красными стрелками. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig3.jpg"> Рисунок 3 : IBC заготовки из мочевого пузыря клеток. (A) зараженных и инвертированных пузыря в холодных PBS раствор перед соскоб клеток. (B) изображения показаны царапины клетки мочевого пузыря как увидеть под микроскопом. КСГМГ могут быть определены как большой Зеленый флуоресцентный агрегатов в оба изображения (см. Красные стрелки). (C) изображение завершившегося рот micropipetting аппарат. Аспирационных пипетки, наконечник пипетки, аспиратор трубки и вытащил капиллярной трубки отождествляются с пронумерованные стрелки, как указано на право. (D) изображение одной изолированной IBC в коллекции 1,5 мл трубки (изложенные в красном). Масштаб баров (как указано) представлены белые линии в группах A, B и D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig4.jpg"> Рисунок 4 : Собранный КСГМГ чистой и может использоваться для анализа течению. Эта цифра была изменена с разрешения Дурайсвами et al18. (A) образы двух изолированных GFP-положительных клеток, которые были окрашены с анти uroplakin и анти -E.coli антител. Первая ячейка (IBC 1) имеет изображения отдельных каналов (при низкой увеличение) на левой стороне, и объединенное изображение высокого увеличения находится на правой. Во второй ячейке (IBC 2) показано в большим увеличением в Объединенные и отдельные каналы. Масштаб адвокатские сословия, как указано. ДНК витражи с 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и представлены в канале синего. Анти -E. coli запачкается с вторичное антитело проспряганное флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) и представлены в зелёном канале. Анти uroplakin запачкается с вторичное антитело проспряганное тетраметилродамина Изотиоцианаты (TRITC) и представляют в красный канал. (B) бактериального CFUs от изолированных КСГМГ. КСГМГ были обработаны немедленно, или инкубировали в 0,1% тритон-X для 10 или 30 мин пуле CFU количество отдельных КСГМГ изолированы от n = 3 показаны отдельные эксперименты. Предел обнаружения = 0,7 журнала10 CFUs/IBC. Красные точки нанесены на пределе обнаружения указывают образцов, для которых нет колонии были восстановлены. Все образцы, содержащие IBC не значительно отличаются (p > 0,05, тест Манна-Уитни); неинфицированным эпителиальные клетки значительно отличаются от данных МКБ (10 мин) (p < 0,001, тест Манна-Уитни). (C) количественной ПЦР бактерий на отдельные КСГМГ и неинфицированных клеток эпителия после 10 минут инкубации в 0,1% тритон-X (*, p < 0,0001, тест Манна-Уитни, n = 4). Предел обнаружения = 1,18 журнала10 бактериальный геном эквиваленты/IBC. Красные точки обозначают образцов, для которых нет колонии были восстановлены на titering в группы B. (D) количественная оценка 16S рРНК, cyoB и frdA генов для различное количество индивидуально изолированных и обобщённые КСГМГ (n = 1 эксперимент; каждый точка указывает среднее 3 технических реплицирует). NC = отрицательный контроль не ДНК. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig5.jpg"> Рисунок 5 : Схема и ее связанные фотографии, представляющие изоляции КСГМГ через рот micropipetting от инфицированных мышей пузыри. Эта цифра воспроизводится Дурайсвами et al.18. (A) A собирают весь мочевого пузыря; (B) Перевернутый весь мочевого пузыря, подвергая GFP, выражая КСГМГ; (C) крупным планом края царапины мочевого пузыря, показаны отдельные КСГМГ в виде суспензии в прилегающих буфер; (D) единый изолированный IBC, накапаны в трубку. Красные стрелки на панели B показывают примеры GFP-позитивных КСГМГ на поверхности Люминал мочевого пузыря. Красная пунктирная линия в группе C указывает правую границу Перевернутый мочевого пузыря (указывается как «BL»); красные стрелки на панели C указывают явно отдельных GFP-позитивных эпителиальные клетки, которые были соскрести поверхности мочевого пузыря. Белой пунктирной линией в группе D указывает micropipetted суб микролитр капли, содержащие изолированных КСГМГ, который обозначен белой стрелкой. Масштаб баров = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig5large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis at JoVE.c

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Этот протокол описывает простой метод изоляции одного, инфицированных пузыря эпителиальных клеток из мышиных модели инфекции мочевыводящих путей.

Изоляция одной внутриклеточных бактериальных сообществ, генерируется из мышиных модели инфекции мочевыводящих путей анализа течению одноклеточного

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Внутриклеточные бактериальные сообщества, или IBCs, наблюдались у мышей, которые были даны экспериментальные инфекции мочевыводящих путей, или ИМП. Они также были замечены в отложениях мочи пациентов с ИМП человека. Техника, которую мы описываем сегодня, это способ изолировать одиночные МЦК от экспериментально инфицированных мышей.Техника микропайптинга во рту является единственным доступным в настоящее время методом изоляции внутриклеточных бактерий от инфицированных мочевых пузырей мыши. Для подготовки стеклянных пипеток рот, твердо щепотку обоих концах стеклянной капиллярной трубки и равномерно повернуть середину трубки вперед и назад вдоль своей оси над открытым источником пламени. Когда стекло станет мягким, удалите капилляр из источника тепла и немедленно потяните стекло друг от друга.Идеальная окончательная длина вытащил капилляров на три-пять сантиметров длиннее, чем unpulled капилляров для обеспечения соответствующего внутреннего диаметра для изоляции одного мочевого пузыря эпителиальных клеток. Когда стекло остынет, проверьте, если середина стеклянной капиллярной уже, и что интерьер трубки по-прежнему полые. Подбирая большой конец вытащил капилляров с одной стороны, использовать миппы, чтобы схватить капилляр в самой узкой точке, убедившись, что типсы обладают достаточной силой, чтобы сцепление капилляров твердо, не дробления его.Быстро скрутить типсы, чтобы оснастки вытащил капилляров в самой узкой точке. Затем поместите капилляр размером с капиллет размером с рот в 100-миллиметровую чашку Петри и флуиф стерилизуем блюдо в течение 30 минут. Чтобы собрать мочевой пузырь, поместите мышь в положение на спине и стерилизовать область живота с 70%этанола.Используя этанол-стерилизованные типсы и хирургические ножницы, сделайте первоначальный поперечный разрез поперечной кожи выше уретры открытия и расширьте разрез по диагонали к верхним конечностям мыши, чтобы создать V-образный разрез вдоль всей передней части мыши, которая подвергает содержимое брюшной полости. Используя новые стерилизованные инструменты, осторожно нажмите вниз на жировые прокладки вблизи тазовой области мыши, чтобы вызвать мочевой пузырь выступать и захватить открытый мочевой пузырь на вершине. Сохраняя твердое сцепление с мочевым пузырем, вырезать мочеточители и уретру, чтобы освободить мочевой пузырь и вставить кончик одного вала округлых типсов в отверстие мочевого пузыря, где он был просто инк отрезали.Отпустите типсов захвата вершины и поддержания округлые типсы почти полностью закрыты, использовать вторую пару типсов мягко тянуть внешний конец рта мочевого пузыря от округлых типсов и вокруг и над другой кончик округлых типсов, чтобы превратить мочевой пузырь наизнанку. Затем используйте вторую пару типсов, чтобы мягко уговорить перевернутый мочевой пузырь от кончика типса в один миллилитр холодного PBS. И аккуратно соскребать внутренний эпителиальный слой клеток на внешней стороне перевернутого мочевого пузыря с двумя парами чистых типсов.Когда все клетки были Царапины, вставьте unpulled конце вытащил стеклянный капилляр в резиновую вилку аспиратор трубки и плотно подходят узкий конец одного миллилитров пипетки кончик в другой открытый конец трубки. Плотно подходят узкий конец двух миллилитров аспирирующих пипетки в открытый, более широкий конец одного миллилитров пипетки отзыв и место Царапины подвески клеток под рассечение микроскопа. Используя увеличение от 20 до 40X, определите IBCs как большие флуоресцентные агрегаты и окуните тонкий конец стеклянной капиллярной трубы в свежую трубку PBS на одну секунду, чтобы уменьшить поглощение нежелательного объема через капиллярное действие.Когда IBC интереса был расположен, медленно принести открытый конец капиллярной трубки к IBC и применить очень небольшую силу всасывания для аспирирующих пипетки для руководства МКБ в стеклянной капиллярной. Затем перемести капилляр в пустую 1,5-миллилитровую центрифугу и применить небольшое положительное давление, чтобы изгнать капельку и МКБ в трубку. В дополнение к подтверждению наличия одного изолированного МКБ в трубке коллекции с помощью рассеченного микроскопа, чистота изолированного МКБ может быть подтверждена конфокаленной микроскопией.Изолированные клетки должны окрашиваться как для E.coli, так и для уроплакина и должны быть размером от 50 до 120 микрометров. После изоляции наличие и жизнеспособность бактериальных клеток в отдельном МКБ может быть подтверждено путем формирования единицы колонии количественной или количественной полимеразной цепной реакции для геномных эквивалентов. Примечательно, что неинфицированные эпителиальные клетки, изолированные тем же протоколом, не демонстрируют количественного количества бактерий.Кроме того, количественный анализ обратной транскрипции полимеразной цепной реакции подтверждает наличие бактериальных генов в ряде индивидуально изолированных и объединились IBCs. Всегда убедитесь, что рот micropipette может забрать и изгнать жидкость легко. Не стесняйтесь менять капилляр или весь аппарат, если рот микропипют чувствует себя затуха.Этот метод микропайптинга рта позволяет нам непосредственно и конкретно изучать внутриклеточные популяции, которые образуются во время экспериментального UTI. Без этого метода, эти внутриклеточные популяции будут загрязнены и превосходят по численности внеклеточных бактерий. Некоторые другие инфекционные агенты могут быть более легко аэрозолизированы или переданы, чем E.coli мы использовали в этом приложении.Поэтому в этих случаях могут быть оправданы некоторые дополнительные элементы управления, такие как добавление фильтра или расширение труб в зависимости от используемого приложения. IBCs изолированы с помощью этого рта micropipetting метод может быть использован в других вниз по течению одного анализа клеток, таких как СРТПКР или РНК секвенирования.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Трансуретральная Индукция Мышь инфекции мочевыводящих путей

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

РНК Выделение Синегнойной палочки Колонизация мышей Желудочно-кишечный тракт

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Заражение эмбрионов данио рерио с внутриклеточные бактериальные патогены

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Одноклеточный анализ Сенная Bacillus Биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Выделение и анализ генома Единого Вирионы использованием &quot;Единое геномики Вирус&quot;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Выделение лимфоцитов из половых путей мышь Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Единичных измерений Сотовые вакуолярных разрыв под действием внутриклеточных патогенов

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

Получение одноклеточные подвесок для Cytofluorimetric анализа из различных регионов мышиной кожи

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Инфекции мочевыводящих путей в небольшой животной модели: трансуретральная катетеризация мужские и женские мышей

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Количественная оценка Efferocytosis по микроскопии флуоресцирования одноклеточного

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...