Name: detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

الدراسة تدعمها الأموال الفيدرالية من المعهد الوطني للسرطان، "المعاهد الوطنية للصحة"، وبموجب العقد HHSN261200800001E. محتوى هذا المنشور لا تعكس بالضرورة وجهات نظر أو سياسات لوزارة الصحة والخدمات الإنسانية، ولا أذكر الأسماء التجارية، والمنتجات التجارية، أو المنظمات يعني موافقة "الحكومة الأمريكية".

1-إعداد العينات نانوحبيبات
<ol><li>إعداد عينة الدراسة في ال المياه الصف.</li>
	<li>إذا كان الرقم الهيدروجيني عينة خارج نطاق 6-8، ضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم خالية من مولد أو حمض الهيدروكلوريك.</li>
	<li>استخدام ال الصف المياه يعد تخفيف العديد من عينة الدراسة. تأكد من أن إضعاف أعل...

<ol>
	<li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses.">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li><li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans:+an+overview.">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll+receptors,+CD14,+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS.">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li><li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Endotoxins Test. , (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).</li><li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+70+years+of+pyrogen+detection:+Current+state+and+future+perspectives.">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li><li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection.">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li><li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms:+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+(LAL).">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li><li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples.">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li><li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test.">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li><li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs:+Challenges,+considerations+and+strategy.">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations.">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation.">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations.">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li><li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System.">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li><li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry.">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li><li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry.">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li><li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin:+evaluation+of+different+test+methods.">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).</li><li>. NCL assay cascade Available from: <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015)</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity.">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li><li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices:+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test.">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li><li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+pyrogenicity+testing:+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+(MAT).">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li><li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines.">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxil(R)--the+first+FDA-approved+nano-drug:+lessons+learned.">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays.">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).</li><li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent:+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking.">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li><li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition.">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles.">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+(lipopolysaccharide)+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles,+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation.">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li></ol>

المعلومات الواردة في هذا البروتوكول قد وصفت قبل15،26 وتعتمد على العديد من الوثائق التنظيمية التي نشرتها لنا الغذاء والدواء (إدارة الأغذية والعقاقير الأمريكية أو إدارة الأغذية والعقاقير) ودستور الأدوية الأمريكية (USP)4 , 5 ,</sup...

الذيفان لبنة من جدار الخلية البكتيريا سلبية الغرام1،2. يمكن تنشيط الخلايا المناعية في جداً منخفضة (حلول) تركيزات1،2. الوسطاء proinflammatory (السيتوكينات، اليوكوترين، ايكوسانويدس، إلخ) التي تنتجها الخلايا في الاستجابة إلى الذيفان المسؤولة عن الحمى وانخفاض ضغط الدم، وارتفاع ضغط الدم، وأشد المشاكل الصحية بما في ذلك فشل الجهاز متعددة 1 , 2 , 3-شدة المناعي بوساطة الآثار الجانبية الناجمة عن الذيفان يعتمد على فاعلية ما يحدده تكوين الذيفان وهيكل ويقاس في الذيفان الدولية وحدات (IUs أو أوروبا)3. عدد هذه الوحدات للكيلوغرام الواحد من وزن الجسم يستخدم لتعيين عتبة ﻻنبعاثات جرعة الذيفان. هذه الجرعة من الاتحاد الأوروبي 5/كغ للمنتجات الدوائية التي تديرها عبر جميع الطرق لكن الطريق إينتراثيكال. الأدوية مداوي كل متر مربع من سطح الجسم والسوائل اللاصقة والمواد المشعة والمنتجات التي تدار عن طريق توجيه intrathecal لها جرعة •انبوب عتبة مختلفة، وهو 100 الاتحاد الأوروبي/م2، 0.2 مليلتر الاتحاد الأوروبي، الاتحاد الأوروبي 175/V (حيث الخامس حجم المنتج المقصود للإدارة)، والاتحاد الأوروبي 0.2/كغ على التوالي4. مزيد من التفاصيل حول الجرعة ﻻنبعاثات عتبة لمختلف المنتجات الدوائية والأجهزة ومناقشتها في مكان آخر4،،من56.
الحيوانات تختلف على نطاق واسع في حساسيتها لردود الفعل بوساطة الذيفان. البشر والرئيسيات غير البشرية والأرانب من بين الأنواع الأكثر بالغة الحساسية إلى اندوتوكسينس3. لتجنب الآثار الجانبية بوساطة الذيفان في المرضى ومنع استنتاجات غير دقيقة للسمية الإكلينيكية والدراسات فعالية، من الضروري لدقة كشف وتحديد endotoxins في صياغات الصف السريرية وقبل السريرية على حد سواء. العديد من الأساليب المتاحة حاليا ويمكن تحقيق هذه المهمة. واحد منهم هو الإنزيم ليمولوس أموبوسيتي ليستي (ال)، الذي يستخدم عادة في جميع أنحاء العالم للمنتجات الطبية الحيوية الشاشة للتلوث الذيفان المحتملة، فضلا عن الكشف عن الإصابات البكتيرية7،،من89. مستعدة من أموبوسيتيس، والخلايا الموجودة في دم سرطان حدوة الحصان ليمولوس بوليفيموس يقيمون في الساحل الشرقي لقارة أمريكا الشمالية7. من المثير للاهتمام، وهناك عدد قليل من أنواع مختلفة من سرطان حدوة الحصان (تاتشيبليوس gigas و تريدينتاتوس تاتشيبليوس) في آسيا10. ليستي أموبوسيتي تاتشيبليوس (تل) يستخدم في العديد من البلدان الآسيوية للكشف عن الذيفان مماثلة لكيفية استخدام ال في أخرى [كونتريس10. ليساتيس (لل وتل) تحتوي على مجموعة من البروتينات التي تمنح النشاط حوزتي عند التنشيط. يتم تنشيط واحدة من هذه البروتينات، وعامل ما يسمى ج عند الاتصال مع الذيفان. تنشيط "عامل ج" كليفس "عامل ب"، الذي بدوره أيضا يصبح حوزتي وكليفس إنزيم تخثر الموالية لإنتاج إنزيم تخثر. ونتيجة لهذا السلسلة من ردود الفعل هو تكوين هلام، زيادة في تعكر عينة، وحضور الركازة اللونية، مظهر المنتج الملونة، التي تكون بمثابة أساس لجل-كلوت والتعكر وفحوصات اللونية، على التوالي. بينما لا يوجد أي شكل لل إلزامية، يشرح "لنا الغذاء" والدواء (FDA) في التوجيه بشأن الوثيقة الصناعة، أنه في حالة الاختلاف في نتائج الاختبار بين صيغ مختلفة لل، هو اتخاذ القرار استناداً إلى المقايسة هلام-كلوت5 .
كثير يشيع استخدام المواد الكيميائية المختبرية (على سبيل المثال-، يدتا) وفحوصات المخدرات المعروفة المنتجات (مثل البنسلين) تتداخل مع ال11. عادة ما يتم تعريفه التدخل بتقييم انتعاش الذيفان الموحدة ارتفعت بتركيز معلوم في محلول يحتوي على مادة الاختبار. إذا كان الانتعاش سبايك أقل من 50% أو أكثر من 200%، ثم نتيجة لل الاعتداء لمواد الاختبار المعطى غير صحيح بسبب تثبيط أو تعزيزها، على التوالي4. صيغ على أساس تكنولوجيا النانو غالباً ما تكون معقدة وتتداخل مع ال من خلال مجموعة متنوعة من الآليات12،،من1314. وقد وصف العديد من النهج للتغلب على التدخل: إعادة تشكيل عينة في مخازن محددة والتوتر السطحي، المنظمة البروتين بالتدفئة، تدمير القاعدة الدهنية المواد جوفاء بالتدفئة والمكمل للعينة مع فائض الكاتيونات ديفالينت5،12،13،،من1415. كما وقد وصف أساليب بديلة لحالات عندما لا يمكن التغلب على التدخل لل: أليسا, خط خلية مراسل HEK TLR4 المقايسة، والطيف الكتلي16،،من1718، 19.
هنا، يتم وصف الإجراءات التجريبية لإجراء هلام-كلوت والتعكر واللونية لل فحوصات. هذه الاختبارات متاحة أيضا على موقع مختبر توصيف تكنولوجيا النانو (نكل)20 في البروتوكولات STE1.2 (التعكر لل)، STE1.3 (لل جل-كلوت) و STE1.4 (لل اللونية). من المستحسن القيام بشكلين مختلفين على الأقل لوصف نفس النانو-الصيغة. عندما اختلف نتائج التعكر وال اللونية، تعتبر النتائج تجلط جل5. عندما اختلف نتائج صيغتين لل، أجرى إضافية النتائج التي توصلت إليها الدراسات باستخدام اختبار التنشيط الوحيدات (حصيرة) أو اختبار مولد أرنب (RPT) للتحقق من ال21. من المهم أن نلاحظ أن كل أسلوب يستخدم للكشف عن الذيفان وتقييم بيروجينيسيتي له مزايا وقيود21،22،،من2324. إذ تسلم بالقيود المفروضة على الإجراءات المستخدمة لوصف صيغة معينة تقنية النانو ضروري للحصول على مبرر علمي للاستخدام الإجراء الأمثل لذلك النانو-الصياغة.
في هذه الدراسة، استخدمت ميتوتريكسات الاسمافرون سي كصيغة نانوحبيبات نموذجي. هذه الصيغة تم وافق "لنا إدارة الأغذية والعقاقير" في عام 1995 وتستخدم لعلاج مرضى السرطان في جميع أنحاء العالم25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Turbidity LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>T0051</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity assay only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogenic LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrochrome LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>CG1500-5</td>
			<td>This reagent is specific to the Chromogenic Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>EC010</td>
			<td>This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-Clot LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>G5003</td>
			<td>This reagent is specific to the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TS050</td>
			<td>These tubes are for use with the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays

عندما تكون موجودة في المنتجات الصيدلانية، الذيفان مكون جدار الخلية البكتيريا سلبية الغرام (يسمى غالباً أيضا lipopolysaccharide) يمكن أن يسبب التهاب وحمى وقصور-أو ارتفاع ضغط الدم، وفي الحالات القصوى، يمكن أن يؤدي إلى تلف الجهاز والأنسجة التي قد تصبح قاتلة. ولذلك، كميات الذيفان في المنتجات الصيدلانية، دقة تخضع. بين الطرق المتاحة لكشف الذيفان والتقدير الكمي، ويشيع استخدام الإنزيم ليمولوس أموبوسيتي ليستي (ال) في جميع أنحاء العالم. بينما أي منتج الأدوية يمكن أن تتداخل مع المقايسة لل، نانو-تركيبات تمثل تحديا خاصا بسبب تعقيدها. والغرض من هذه الورقة تقديم دليل عملي للباحثين عديمي الخبرة في تقدير اندوتوكسينس في هندسة المواد النانوية وصاغت نانوحبيبات المخدرات. وتناقش هذه الوثيقة، توصيات عملية لأداء ثلاث صيغ لل بما في ذلك التكدر، اللونية وفحوصات تجلط هلام. يمكن استخدام هذه الاختبارات لتحديد التلوث الذيفان في المنتجات المستندة إلى تقنية النانو العقاقير واللقاحات والمواد المساعدة.

على سبيل المثال البيانات التي تم إنشاؤها بعد اختبار هذه الصيغة في فحوصات ال يرد في الجدول 1. وتدخلت ميتوتريكسات الاسمافرون سي ال اللونية في تمييع 5. ومع ذلك، تم التغلب على هذا التدخل بتخفيف أكبر. كان الانتعاش ارتفاع يتراوح بين 50 و 200 في المائة عندما تم اختبار هذه ال...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

الكشف عن اندوتوكسينس في المواد النانوية المهندسة يمثل أحد التحديات الكبرى في مجال لطب النانوي. نقدم هنا، دراسة حالة يصف إطار يتألف من ثلاثة أشكال لل مختلفة لتقدير احتمال تلوث الذيفان في جسيمات نانوية.

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة في المجال الطبي حول سلامة الأدوية نانو. مزايا هذه التقنية هو أنه هو المعيار، ويستخدم في جميع أنحاء العالم لتقييم المنتجات، إلى الأدوية نانو. مظاهرة من الإجراء، وسوف يكون باري نويون، في مختبر توصيف تكنولوجيا النانو.لإعداد معيار المعايرة، استخدم 900 ميكرولترات من limulus amebocyte lysate، أو LAL LAL الصف المياه. و 100 ميكرولترات من التحكم في إندوتوكين القياسية، لإعداد العديد من التخفيفات المتوسطة حسب الحاجة، لتمكين إعداد معيار المعايرة مع تركيز وحدة واحدة من endotoxin لكل ملليلتر. ثم باستخدام 900 ميكرولترات من LAL الصف المياه، و 100 ميكرولترات من وحدة واحدة endotoxin لكل ملليلتر معايرة القياسية، وإعداد معيار معايرة الثانية، في تركيز وحدة 0.1 endotoxin لكل ملليلتر.ثم كرر تخفيف المسلسل عشرة أضعاف لإعداد اثنين من معايير معايرة أقل. للحصول على ما مجموعه أربعة معايير معايرة، تتراوح بين 0001 وحدة إندوكسيين لكل ملليلتر. لإعداد وحدة 05 endotoxin لكل ملليلتر مراقبة الجودة، يجمع بين 50 ميكرولتر من وحدة endotoxin واحد لكل ملليلتر من التحكم محلول endotoxin القياسية، مع 950 ميكرولترات من المياه الصف LAL.المقبل في البرنامج حدد إعدادات الصك ، وإنشاء القالب. حدد تجميع البيانات، وأدخل معرف الاختبار ومجموعة البيانات في علامة التبويب عام. ضمن علامة التبويب الأجهزة، حدد نوع الجهاز، والأسلوب LAL، وتحقق من ظهور رقم تسلسلي ومعرف النظام ومعلومات المنفذ التسلسلي على الشاشة.انقر فوق موافق مرتين لتأكيد اختيار الصك، والاتصال مع الصك، وأدخل معرف العينة في نفس الترتيب الذي سيتم اختبار العينات. ثم استخدم الأزرار الافتراضية لإدخال منحنى التحكم القياسي السالب، واختبار العينات. إضافة حجم مناسب من معايير معايرة التحكم السلبية، ومراقبة الجودة في أنابيب الزجاج قبل مكررة المسمى.وإضافة حجم مناسب من LAL إلى أول اختبار حقير. دوامة الخسيس لفترة وجيزة، ووضع القارورة في فتحات الاختبارات المناسبة في العداد الصك. قبل تحميل العينات، تنفيذ عدة عمليات تخفيف من المواد نانو اختبار ضمن الحد الأقصى لتخفيف صالحة كما هو موضح.لإعداد وحدة 05 endotoxin لكل ملليلتر من التحكم في تعزيز تثبيط، والجمع بين 25 ميكرولترات من وحدة endotoxin واحد لكل ملليلتر من التحكم محلول endotoxin القياسية، مع 475 ميكرولترات من مادة نانو اختبار في تخفيف معين. بعد الدوامة، تحميل ضوابط تعزيز الابتكار المناسبة، وعينات الدراسة غير المنفقة في الصك. ثم aliquot unspiked والمواد النانوية ارتفعت في تخفيف محددة في أنابيب قبل المسمى.قبل دوامة، وتحميل في العداد الصك. لتنفيذ جل جل- تجلط LAL، وإعداد التحكم في endotoxin القياسية لتركيز النهائي من أربعة لامدا، والجمع بين 100 ميكرولترات من المعيار، مع 100 ميكرولترات من الماء، أو عينة اختبار لتحقيق تركيز نهائي من التحكم في endotoxin القياسية اثنين من لامدا. إضافة 100 ميكرولترات من ليسين إلى كل تخفيف لامدا.دوامة الأنابيب لفترة وجيزة، ووضع رف من الأنابيب في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة، عكس الأنابيب مع حركة ناعمة، وتسجيل النتائج يدويا باستخدام زائد لجلط شركة، وناقصا لعدم وجود جلطة، أو جلطة فضفاضة. في هذا التحليل التمثيلي، تدخلت doxorubicin ليبوسومات البيجية PEGylated مع LAL CHROMOGENIC عند التخفيف خمسة، ولكن تم التغلب على هذا التداخل في التخفيفات أعلى.وكان الانتعاش سبايك بين 50 و 200٪ عندما تم اختبار صياغة في التخفيفات 50 و 500 في LAL العكر وchromogenic، وكذلك في التخفيف خمسة، في LAL العكر. عندما تم تعديلها من قبل عامل التخفيف ، كانت النتائج متسقة بين الأوهام في كلتا المقالتين. وعلاوة على ذلك، كانت النتائج متسقة بين أشكال المقالات الثلاثة.تذكر أن كل عينة لها مجموعة خاصة بها من التخفيفات، كل تنسيق LAL يستخدم معيار التحكم في doxin وlysate، وأن الأنابيب المستخدمة لإعداد التخفيفات، وأداء رد فعل في مختلفة لكل مقال LAL. لهذا الإجراء يمكن تنفيذ أساليب أخرى مثل الإجابة على أسئلة إضافية حول المواد بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للخياطة ومجال الطب نانو، لاستكشاف التطبيقات الطبية لتكنولوجيا النانو وضعت الأدوية في البشر، والنماذج السريرية بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الرئيسيات غير البشرية والأرانب والكلاب والجرذان. لا تنسى أن العمل مع doxin يمكن أن تكون خطرة للغاية والاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية، وينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

مخصص الصينية النامية الهامستر بروتين الخلية المبيض في استضافة فحوصات باستخدام التكنولوجيا الصوتية Microparticle الغشائية

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

تصنيع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الدنا للكشف Reagentless من الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

كشف وعزل خلايا الميلانوما تعميم استخدام Flowmetry الضوئي

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

قياسات جمود العاطفة من البوليمرات الحيوية باستخدام فحوصات الانزلاق

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

إعادة بناء تشريحية من الجهاز الوريدي للقلب البشري باستخدام التباين-المقطعي العينات الإرواء ثابت

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

حبة تجميع فحوصات لتوصيف المزعومين خلية التصاق جزيئات

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

تسمية خالية واحدة كشف الجزيئة عن طريق Microtoroid البصرية الرنين

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

متعدد الألوان كشف الإسفار عن القطرة على microfluidics عن طريق الألياف البصرية

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...