Name: detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

De studie werd ondersteund door federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder contract HHSN261200800001E. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het Department of Health and Human Services, noch vermeldt van handelsnamen, commerciële producten, of organisaties impliceren goedkeuring door de Amerikaanse overheid.

1. bereiding van Nanoparticle monsters
<ol><li>Voorbereiding van het monster studie in LAL rang water.</li>
	<li>Als de pH van de steekproef buiten het bereik van 6-8 is, breng de pH met behulp van natriumhydroxide pyrogeen-vrije of zoutzuur.</li>
	<li>Met behulp van LAL rang water Maak verschillende verdunningen van het monster studie. Zorg ervoor dat de hoogste verdunning maximale geldige verdunning (MVD) niet overschrijdt. Raadpleeg de sectie discussie voor meer informatie over MVD schatting.</li>
</ol><p class="jov...

<ol>
	<li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses.">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li><li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans:+an+overview.">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll+receptors,+CD14,+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS.">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li><li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Endotoxins Test. , (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).</li><li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+70+years+of+pyrogen+detection:+Current+state+and+future+perspectives.">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li><li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection.">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li><li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms:+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+(LAL).">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li><li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples.">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li><li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test.">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li><li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs:+Challenges,+considerations+and+strategy.">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations.">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation.">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations.">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li><li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System.">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li><li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry.">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li><li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry.">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li><li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin:+evaluation+of+different+test+methods.">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).</li><li>. NCL assay cascade Available from: <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015)</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity.">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li><li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices:+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test.">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li><li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+pyrogenicity+testing:+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+(MAT).">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li><li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines.">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxil(R)--the+first+FDA-approved+nano-drug:+lessons+learned.">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays.">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).</li><li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent:+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking.">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li><li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition.">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles.">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+(lipopolysaccharide)+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles,+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation.">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li></ol>

De informatie in dit protocol is beschreven voor15,26 en vertrouwt op verschillende regelgevende documenten gepubliceerd door de Amerikaanse Food en Drug Administration (US FDA of FDA), Amerikaanse Farmacopee (USP)4 , 5 , 6 , 27, en is tevens beschikbaar op de website NCL20 in protocollen STE1.2 (troebelheid LAL)...

Een Endotoxine is een bouwsteen van de gram-negatieve bacteriële celwand1,2. Het kan activeren de immuuncellen bij zeer lage (picogram) concentraties1,2. De proinflammatoire bemiddelaars (cytokines leukotriënen, eicosanoïden, etc.) geproduceerd door de cellen in reactie op een endotoxine zijn verantwoordelijk voor koorts, hypotensie, hypertensie en meer ernstige gezondheidsproblemen met inbegrip van meerdere orgaanfalen 1 , 2 , 3. de ernst van de immuun-gemedieerde bijwerkingen veroorzaakt door het Endotoxine is afhankelijk van de sterkte bepaald door de endotoxine samenstelling en structuur en gemeten in internationale endotoxine eenheden (IUs of EUs)3. Het nummer van deze eenheden per kilogram lichaamsgewicht wordt gebruikt om een drempel pyrogene dosis van endotoxinen. Deze dosis is dat 5 EU/kg voor geneesmiddelen toegediend via alle routes maar de intrathecale weg. Drugs toegediend per vierkante meter lichaamsoppervlak, intraoculaire vloeistoffen, radiofarmaceutica en producten door de overheid gereguleerde via de route van de intrathecale hebben een verschillende drempel pyrogene dosis, oftewel 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V (waar V is de volume van het product dat bestemd is voor beheerdoeleinden), en 0.2 EU/kg, respectievelijk4. Meer details over de drempel pyrogene dosis voor verschillende geneesmiddelen en apparaten worden geleverd en elders besproken4,5,6.
Dieren verschillen sterk in hun gevoeligheid voor endotoxine-gemedieerde reacties. Mens, niet-menselijke primaten en konijnen behoren tot de meest gevoelige endotoxines3soorten. Om te vermijden endotoxine-gemedieerde bijwerkingen bij patiënten en voorkomen dat onjuiste conclusies van preklinische toxiciteit en werkzaamheid studies, is het essentieel om nauwkeurig detecteren en kwantificeren van endotoxines in beide formuleringen van de klinische en preklinische rang. Deze taak kunnen worden bereikt door verschillende beschikbare methoden. Een van hen is de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay, waarmee vaak wereldwijd scherm biomedische producten voor de potentiële endotoxine verontreiniging alsmede over het detecteren van bacteriële infecties7,8,9. De lysate wordt bereid uit amoebocytes, de cellen in het bloed van horseshoe krabben Limulus polyphemus presenteren die woonachtig zijn in de oostelijke oever van het continent van Noord-Amerika7. Interessant, er zijn een paar verschillende soorten van horseshoe krabben (Tachypleus gigas en Tachypleus tridentatus) in Asia10. Het Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) wordt gebruikt in verscheidene Aziatische landen voor de detectie van endotoxinen vergelijkbaar met hoe de LAL wordt gebruikt in andere cuntries10. De lysates (LAL en TAL) bevatten een groep eiwitten die na activatie protease-activiteit verlenen. Één van deze eiwitten, de zogenaamde Factor C wordt geactiveerd bij contact met endotoxine. Geactiveerd Factor C cleaves Factor B, die op zijn beurt ook een protease wordt en een pro-stolling enzym te produceren een bloedstolling enzym cleaves. Het resultaat van deze keten van reacties is de vorming van een gel, een toename van de troebelheid van het monster en, in de aanwezigheid van een chromogenic substraat, het uiterlijk van een gekleurd product, die dienen als basis voor gel-clot, troebelheid en chromogenic testen respectievelijk. Terwijl er geen verplichte LAL notatie, is de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) wordt uitgelegd in het richtsnoer voor de industrie document, dat in geval van discrepantie in de testresultaten tussen verschillende LAL formaten, de beslissing is gemaakt op basis van de gel-clot assay5 .
Veel gebruikte laboratorium chemische stoffen (bijv., EDTA) en bekende drug producten (bijvoorbeeld penicilline) met LAL interfereren testen11. De storing wordt meestal aangeduid met de beoordeling van het herstel van het endotoxine standaard verrijkt met een bekende concentratie in een oplossing die met het testmateriaal. Als het herstel van de spike is minder dan 50% of meer dan 200%, dan het resultaat van de LAL assay voor is het gegeven testmateriaal ongeldig zijn wegens de remming of verbetering, respectievelijk4. Nanotechnologie gebaseerde formuleringen zijn vaak complex en interfereren met de LAL via allerlei mechanismen12,13,14. Vele benaderingen zijn beschreven om te overwinnen de interferentie: monster reconstitutie in specifieke buffers en oppervlakteactieve stoffen, eiwit geïnactiveerd door Verwarming, vernietiging van lipide gebaseerde holle materialen door verwarming en tot aanvulling van het monster met overmaat divalente kationen5,12,13,14,15. Alternatieve methoden voor situaties wanneer LAL interferentie niet overwonnen kan worden zijn ook beschreven: ELISA, een HEK-TLR4 verslaggever cel lijn assay en massaspectrometrie16,17,18, 19.
Hierin, worden experimentele procedures voor het uitvoeren van de gel-clot, troebelheid en chromogenic LAL testen beschreven. Deze tests zijn ook beschikbaar op de nanotechnologie karakterisering Lab (NCL) website20 in protocollen STE1.2 (troebelheid LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) en STE1.4 (chromogenic LAL). Het wordt aanbevolen om ten minste twee verschillende formaten dezelfde nano-formulering karakteriseren. Wanneer de resultaten van de turbiditeit en chromogenic LAL oneens zijn, zijn de resultaten van de gel-clot5beschouwd. Wanneer de resultaten van twee LAL formaten oneens, aanvullende studies met ofwel monocyt activering test (MAT) of konijn pyrogeen (RPT) om te controleren of de LAL bevindingen zijn uitgevoerd21. Het is belangrijk op te merken dat elke methode voor de detectie van endotoxinen gebruikt en pyrogene beoordeling voordelen en beperkingen21,22,23,24 heeft. Herkennen van beperkingen van de procedure die is gebruikt voor het karakteriseren van de formulering van een bepaalde nanotechnologie is essentieel voor het verkrijgen van wetenschappelijke rechtvaardiging voor het gebruik van de procedure die optimaal is voor die nano-formulering.
In deze studie, werd gepegyleerde Liposomale Doxorubicine gebruikt als een model nanoparticle formulering. Deze formulering is in 1995 goedgekeurd door de US FDA en gebruikt voor de behandeling van kanker patiënten wereldwijd25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Turbidity LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>T0051</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity assay only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogenic LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrochrome LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>CG1500-5</td>
			<td>This reagent is specific to the Chromogenic Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>EC010</td>
			<td>This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-Clot LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>G5003</td>
			<td>This reagent is specific to the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TS050</td>
			<td>These tubes are for use with the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays

Indien aanwezig in farmaceutische producten, een gramnegatieve celwand component endotoxinen (vaak ook genoemd lipopolysaccharide) kan leiden tot ontsteking, koorts, hypo- of hypertensie, en, in extreme gevallen, kan leiden tot weefsel- en orgaanbanken schade die kan fataal geworden. De bedragen van endotoxinen in farmaceutische producten, zijn daarom streng gereglementeerd. Onder de beschikbare methoden voor endotoxine detectie en kwantificering, is de bepaling Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) gebruikte wereldwijd. Terwijl een farmaceutisch product met de LAL-test interfereren kan, vormen nano-formuleringen een bijzondere uitdaging vanwege hun complexiteit. Het doel van deze paper is om een praktische gids voor onderzoekers onervaren bij het schatten van endotoxines in technisch vervaardigde nanomaterialen en nanoparticle geformuleerde drugs. Praktische aanbevelingen voor het uitvoeren van drie LAL formaten met inbegrip van de troebelheid, chromogenic en gel-clot vitrotests worden hierin besproken. Deze tests kunnen worden gebruikt om te bepalen van endotoxine besmetting in nanotechnologie gebaseerde geneesmiddelen, vaccins en hulpstoffen.

Het voorbeeld van gegevens die zijn gegenereerd na het testen van deze formulering in LAL assays wordt weergegeven in tabel 1. Gepegyleerde Liposomale Doxorubicine bemoeid met chromogenic LAL bij verdunning 5. Echter, deze bemoeienis werd overwonnen door grotere verdunningen. Spike herstel was tussen 50 en 200% wanneer deze formulering werd getest in de verdunningen 50 en 500 in turbiditeit en chromogenic LAL, evenals bij verdunning 5 in turbiditeit LAL. Wanneer aangepast...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detectie van endotoxines in technisch vervaardigde nanomaterialen vertegenwoordigt een van de grote uitdagingen op het gebied van de nanogeneeskunde. Hier, presenteren we een case-studie die het kader bestaat uit drie verschillende LAL formaten beschrijft te schatten van potentiële endotoxine besmetting in nanodeeltjes.

Detectie van endotoxinen in Nano-formuleringen gebruiken Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) testen

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Deze methode kan helpen antwoord op medisch gebied over de veiligheid van nano-geneesmiddelen. De voordelen van deze techniek is dat het standaard is, en wereldwijd wordt gebruikt voor de evaluatie van producten, Nano-geneesmiddelen. Demonstratie van de procedure, zal Barry Neun, op de Nano Technology Karakterisering Lab.Gebruik voor de standaardpreparaat van 900 microliter limulus amebocyte lysaat of LAL-water voor het hanteren van standaard. En 100 microliters van de controle standaard endotoxine, om zo veel tussentijdse verdunningen voor te bereiden als nodig is, om de voorbereiding van een kalibratie standaard met een concentratie van een endotoxine-eenheid per milliliter mogelijk te maken. Bereid vervolgens met behulp van 900 microliter water van LAL-kwaliteit en 100 microliter van de endotoxine-eenheid per milliliterkalibratienorm een tweede kalibratienorm voor, bij een concentratie van 0,1 endotoxine-eenheid per milliliter.Herhaal vervolgens de seriële verdunning om twee lagere kalibratienormen voor te bereiden. Om in totaal vier kalibratienormen te verkrijgen, variërend van 0001 tot één endotoxine-eenheid per milliliter. Voor het bereiden van een 05 endotoxine-eenheid per milliliter kwaliteitscontrole, combineert 50 microliter van de endotoxine-eenheid per milliliter van de controle standaard endotoxine oplossing, met 950 microliter water van LAL-kwaliteit.Selecteer vervolgens in de software de instrumentinstellingen en maak de sjabloon. Selecteer Gegevens verzamelen en voer de test-id en gegevensgroep in op het algemene tabblad. Selecteer onder het tabblad hardware het instrumenttype en de LAL-methode en controleer of er een serienummer, de systeem-id en de seriepoortgegevens op het scherm worden weergegeven.Klik twee keer goed om de instrumentselectie en de communicatie met het instrument te bevestigen en voer de voorbeeld-ID's in dezelfde volgorde in als de monsters worden getest. Gebruik vervolgens de standaardknoppen om de standaardcurve voor negatieve besturingselementen in te voeren en monsters te testen. Voeg het juiste volume van de negatieve controle kalibratie normen, en kwaliteitscontrole in dubbele voorgelabelde glazen buizen.En voeg het juiste volume van LAL toe aan de eerste test verachtelijk. Vortex de verachtelijke kort, en plaats het flesje in de juiste tests sleuven in het instrument carrousel. Voer vóór het laden van de monsters verschillende verdunningen van het testnanomateriaal uit binnen de maximaal geldige verdunning zoals aangetoond.Om een 05 endotoxine-eenheid per milliliter remmingsverbeteringscontrole voor te bereiden, combineert u 25 microliter van de endotoxine-eenheid per milliliter van de standaard endotoxineoplossing, met 475 microliter van het testnanomateriaal bij een bepaalde verdunning. Na vortexing, laad de juiste innovatie verbetering controles, en de niet gespikte studie monsters in het instrument. Dan aliquot unspiked en de spiked nano materialen bij een specifieke verdunning in vooraf gelabelde buizen.Voordat vortexing, en laden in de instrumentencarrousel. Om een Gel-Clot LAL uit te voeren, bereid je controlestandaard endotoxine voor op een uiteindelijke concentratie van vier lambda en combineer je 100 microliter standaard, met 100 microliter water, of testmonster om een uiteindelijke concentratie van controlestandaard endotoxine twee lambda te bereiken. Voeg 100 microliter Lysine toe aan elke lambdaverdunning.Vortex de buizen kort, en plaats het rek van buizen in een 37 graden Celsius waterbad voor een uur. Aan het einde van de incubatie, omkeren van de buizen met een gladde beweging, en handmatig opnemen van de resultaten met behulp van plus voor een stevige stolsel, en minus voor geen stolsel, of een losse stolsel. In deze representatieve analyse, PEGylated liposomale doxorubicine interfereerde met chromogene LAL bij verdunning vijf, maar deze interferentie werd overwonnen bij hogere verdunningen.Spike herstel was tussen 50 en 200%, toen de formulering werd getest bij verdunningen 50 en 500 in de troebelheid en chromogene LAL, evenals bij verdunning vijf, in de troebelheid LAL. Wanneer gecorrigeerd door de verdunningsfactor, waren de resultaten consistent tussen wanen in beide essays. Bovendien waren de resultaten consistent tussen de drie essayformaten.Vergeet niet dat elk monster heeft zijn eigen bereik van verdunningen, elk LAL-formaat maakt gebruik van zijn controle standaard in de doxine en lysate, en dat de buizen gebruikt om de verdunningen voor te bereiden, en om een reactie uit te voeren op verschillende voor elke LAL essay. Voor deze procedure andere methoden zoals kan worden uitgevoerd om aanvullende vragen over materiaal te beantwoorden Na de ontwikkeling ervan, deze techniek de weg vrijgemaakt voor de hechtingen en het gebied van nano geneeskunde, om de medische toepassingen van nano-technologie geformuleerde geneesmiddelen bij de mens te verkennen, en klinische modellen, waaronder maar niet beperkt tot niet-menselijke primaten, konijnen, honden en ratten. Vergeet niet dat het werken met doxine zeer gevaarlijk kan zijn en de voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Het ontwikkelen van aangepaste Chinese hamster ovarium-host Cell Protein Testen met behulp van akoestisch vlies micropartikel Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Detectie en isolatie van circulerende melanoom cellen met behulp van Fotoakoestisch Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Buigstijfheid Metingen van Biopolymeren gebruik Zweefvliegen Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomische Reconstructies van de Mens Cardiac veneuze systeem met contrastdetectie computertomografie van perfusie-vaste Monsters

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Kraal Aggregation Testen voor de karakterisering van Vermoedelijke celadhesiemoleculen

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-free Single Molecule Detectie Met behulp microtoroıde optische resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...