Name: detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

L’étude a été financée par des fonds fédéraux de l’Institut National du Cancer, National Institutes of Health, sous contrat HHSN261200800001E. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les vues ou les politiques du département de Health and Human Services, ni mentionne des noms commerciaux, des produits commerciaux, ou organisations impliquent l’approbation par le gouvernement américain.

1. préparation des échantillons de nanoparticules
<ol><li>Préparer l’échantillon étudié dans LAL l’eau de qualité.</li>
	<li>Si le pH de l’échantillon est en dehors de la gamme de 6-8, ajuster le pH à l’aide d’hydroxyde de sodium apyrogène ou l’acide chlorhydrique.</li>
	<li>À l’aide de LAL l’eau qualité préparer plusieurs dilutions de l’échantillon de l’étude. Assurez-vous que la dilution la plus élevée n’excède pas la dilution valide maximale (MVD). Reportez-vous à la section ...

<ol>
	<li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses.">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li><li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans:+an+overview.">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll+receptors,+CD14,+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS.">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li><li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Endotoxins Test. , (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).</li><li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+70+years+of+pyrogen+detection:+Current+state+and+future+perspectives.">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li><li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection.">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li><li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms:+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+(LAL).">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li><li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples.">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li><li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test.">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li><li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs:+Challenges,+considerations+and+strategy.">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations.">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation.">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations.">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li><li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System.">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li><li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry.">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li><li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry.">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li><li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin:+evaluation+of+different+test+methods.">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).</li><li>. NCL assay cascade Available from: <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015)</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity.">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li><li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices:+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test.">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li><li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+pyrogenicity+testing:+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+(MAT).">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li><li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines.">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxil(R)--the+first+FDA-approved+nano-drug:+lessons+learned.">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays.">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).</li><li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent:+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking.">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li><li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition.">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles.">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+(lipopolysaccharide)+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles,+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation.">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li></ol>

Les informations fournies dans le présent protocole a été décrit avant15,26 et s’appuie sur plusieurs documents de réglementation publiées par la US Food, Drug Administration (US FDA ou FDA) et United States Pharmacopoeia (USP)4 , 5 , 6 , 27et est également disponible sur le site Web NCL20 protocoles STE...

Une endotoxine est un bloc de construction de la paroi cellulaire bactérienne Gram négative1,2. Il peut activer les cellules immunitaires à très faible (picogramme) concentrations1,2. Les médiateurs pro-inflammatoires (cytokines, leucotriènes, eicosanoïdes, etc.) produites par les cellules en réponse à une endotoxine sont responsables de la fièvre, hypotension, hypertension et plus graves problèmes de santé, notamment une défaillance multiviscérale 1 , 2 , 3. la gravité des médiation immunitaire-effets secondaires provoqués par l’endotoxine dépend de sa puissance déterminée par la composition de l’endotoxine et structure et mesurée en unités d’endotoxine international (IUs ou EUs)3. Le nombre de ces unités par kilogramme de poids corporel est utilisé pour définir la dose seuil d’endotoxine pyrogène. Cette dose est que 5 EU/kg pour les médicaments administrés par toutes les voies, mais la voie intrathécale. Les médicaments dosés par mètre carré de surface corporelle, liquides intraoculaires, radiopharmaceutiques et produits administrés via intrathécale route ont une dose seuil différent pyrogène, c'est-à-dire 100 EU/m2, 0,2 UE/mL, EU 175/V (où V est la volume du produit destiné à l’administration) et 0,2 EU/kg, respectivement4. Plus de détails sur la dose seuil de pyrogène pour divers produits pharmaceutiques et dispositifs sont fournies et traitées ailleurs4,5,6.
Animaux varie grandement dans leur sensibilité aux réactions induite par l’endotoxine. Les humains, les primates non humains et les lapins sont parmi les espèces de plus extrêmement sensibles aux endotoxines3. Pour éviter les induite par l’endotoxine des effets secondaires chez les patients et éviter des conclusions inexactes de toxicité préclinique et les études d’efficacité, il est essentiel de correctement détecter et quantifier les endotoxines dans les deux formulations de grade clinique et préclinique. Plusieurs méthodes actuellement disponibles peuvent réaliser cette tâche. L’un d’eux est le test de Limulus Amébocytes Lysate (LAL), qui est couramment utilisé dans le monde entier à l’écran des produits biomédicaux pour l’éventuelle contamination d’endotoxine ainsi quant à détecter des infections bactériennes7,8,9. Le lysat est préparé à partir des amoebocytes, les cellules présentent dans le sang du limule Limulus polyphemus résidant sur la rive est du continent de l’Amérique du Nord,7. Fait intéressant, il y a quelques espèces différentes de limules (Tachypleus gigas et tridentatus Tachypleus) en Asie,10. Le lysat Tachypleus des Amébocytes (TAL) est utilisé dans plusieurs pays d’Asie pour la détection de l’endotoxine semblable à comment la LAL est utilisé dans une autre série de10. Les lysats (LAL et TAL) contiennent un groupe de protéines qui, lors de leur activation, confèrent une activité protéase. Une de ces protéines, le facteur de ce que l'on appelle C est activée au contact de l’endotoxine. C facteur activée Clive facteur B, qui à son tour devient une protéase et fend une enzyme coagulation pro afin de produire une enzyme de la coagulation. Le résultat de cette chaîne de réactions est la formation d’un gel, une augmentation de la turbidité de l’échantillon et, en présence d’un substrat chromogène, l’apparence d’un produit coloré, qui servent de base pour gel-caillot, turbidité et épreuves chromogènes, respectivement. Alors qu’il n’y a aucun format obligatoire de LAL, la Food and Drug Administration (FDA) explique les directives relatives à l’industrie, qu’en cas de divergence dans les résultats entre différents formats LAL, la décision est prise fondé sur l’essai de gel-caillot5 .
Beaucoup utilisés couramment des produits chimiques de laboratoire (p. ex.., EDTA) et essais de médicament connu produits (par exemple, la pénicilline) interfèrent avec la LAL11. L’interférence est habituellement identifiée en évaluant la récupération de l’endotoxine standard dopé à une concentration connue dans une solution contenant la substance d’essai. Si le recouvrement de spike est inférieure à 50 % ou plus de 200 %, puis le résultat de la LAL assay pour la substance d’essai donnée n’est pas valide en raison de l’inhibition ou le développement, respectivement4. Formulations à base de nanotechnologie sont souvent complexes et interfèrent avec la LAL au moyen de divers mécanismes12,13,14. Plusieurs approches ont été décrites pour surmonter l’interférence : reconstitution d’échantillon en tampons spécifiques et des agents tensio-actifs, inactivation des protéines en chauffant, la destruction des lipides à base de matériaux creux en chauffage et en complétant l’échantillon avec excès les cations divalents5,12,13,14,15. Méthodes alternatives pour les situations où l’interférence LAL ne puisse être surmonté ont également été décrits : ELISA, une cellule de journaliste HEK-TLR4 line test et spectrométrie de masse16,17,18, 19.
Dans les présentes, les procédures expérimentales pour tenue de gel-caillot, turbidité et chromogénique LAL dosages sont décrites. Ces tests sont également disponibles sur le laboratoire de caractérisation de nanotechnologie (NCL) site Web20 protocoles STE1.2 (turbidité LAL), STE1.3 (gel-caillot LAL) et STE1.4 (chromogénique LAL). Il est recommandé d’effectuer au moins deux différents formats afin de caractériser la même formulation-nano. Lorsque les résultats de la turbidité et chromogénique LAL sont en désaccord, les résultats de gel-caillot sont considérés5. Lorsque les résultats des deux formats LAL sont en désaccord, autres études utilisant un test d’activation des monocytes (MAT) ou sur lapin pyrogène (RPT) pour vérifier les LAL constatations sont effectué21. Il est important de noter que chaque méthode utilisée pour la détection d’endotoxines et évaluation de pyrogénicité a avantages et limites21,22,23,24. Reconnaissant les limites de la méthode utilisée pour caractériser une formulation donnée nanotechnologie est essentiel pour obtenir une justification scientifique pour l’utilisation de la procédure optimale pour cette nano-formulation.
Dans cette étude, doxorubicine liposomale pégylé a été utilisé comme une préparation de nanoparticules de modèle. Cette formulation a été approuvée par la FDA en 1995 et utilisée pour le traitement du cancer patients dans le monde entier25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Turbidity LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>T0051</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity assay only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogenic LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrochrome LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>CG1500-5</td>
			<td>This reagent is specific to the Chromogenic Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>EC010</td>
			<td>This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-Clot LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>G5003</td>
			<td>This reagent is specific to the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TS050</td>
			<td>These tubes are for use with the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays

Lorsqu’ils sont présents dans les produits pharmaceutiques, une endotoxine de composant de paroi cellulaire bactérienne Gram négative (souvent aussi appelée lipopolysaccharide) peut provoquer une inflammation, fièvre, hypo - ou hypertension et, dans certains cas extrêmes, peut conduire à des dommages des tissus et des organes qui peuvent devenir fatale. Les montants de l’endotoxine dans les produits pharmaceutiques, par conséquent, sont strictement réglementés. Parmi les méthodes disponibles pour l’endotoxine détection et la quantification, le dosage de Limulus Amébocytes Lysate (LAL) est couramment utilisé dans le monde entier. Alors que tous les produits pharmaceutiques peuvent interférer avec le test LAL, nano-formulations représentent un défi particulier en raison de leur complexité. Le but de cet article est de fournir un guide pratique aux chercheurs inexpérimentés dans l’estimation des endotoxines en nanomatériaux et nanoparticules-formulé des médicaments. Dans les présentes, des recommandations pratiques pour l’exécution de trois formats LAL, y compris la turbidité, épreuve à développement chromogène et essais de gel-caillot sont discutées. Ces tests peuvent servir à déterminer la contamination d’endotoxines dans les médicaments basés sur la nanotechnologie, des vaccins et des adjuvants.

L’exemple de données générées après avoir testé cette formulation lors d’essais de LAL est présenté au tableau 1. Doxorubicine liposomale pégylé a interféré avec chromogénique LAL à dilution 5. Toutefois, cette interférence a été compensée par une plus grande dilution. Récupération de Spike était entre 50 et 200 % lorsque cette formulation a été testée à des dilutions 50 et 500 de turbidité et chromogénique LAL, ainsi qu’à dilution 5 turb...

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Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Détection d’endotoxines dans les nanomatériaux représente un des grands défis dans le domaine de la nanomédecine. Nous présentons ici une étude de cas décrivant le cadre composé de trois formats différents de LAL pour évaluer la contamination potentielle d’endotoxines dans les nanoparticules.

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Cette méthode peut aider à répondre dans le domaine médical sur la sécurité des nanomédicinaux. Les avantages de cette technique est qu’il est standard, et est utilisé dans le monde entier pour l’évaluation des produits, Aux nanomédicinaux. Démonstration de la procédure, sera Barry Neun, au Laboratoire de caractérisation nano technologie.Pour une préparation standard d’étalonnage, utilisez 900 microlitres de lysate d’amebocyte limulus ou d’eau de qualité LAL. Et 100 microlitres d’endotoxine standard de contrôle, pour préparer autant de dilutions intermédiaires que nécessaire, pour permettre la préparation d’une norme d’étalonnage avec une concentration d’une unité d’endotoxine par millilitre. Ensuite, à l’aide de 900 microlitres d’eau de qualité LAL, et 100 microlitres de l’unité d’endotoxine par millilitre étalonnage standard, préparer une deuxième norme d’étalonnage, à une concentration de 0,1 unité d’endotoxine par millilitre.Répétez ensuite la dilution décuplée en série pour préparer deux normes d’étalonnage inférieures. Pour obtenir un total de quatre normes d’étalonnage, allant de 0001 à une unité d’endotoxine par millilitre. Pour préparer un contrôle de qualité de 05 endotoxines par millilitre, combine 50 microlitres de l’unité d’endotoxine par millilitre de solution d’endotoxine standard de contrôle, avec 950 microlitres d’eau de qualité LAL.Ensuite, dans le logiciel sélectionnez les paramètres de l’instrument, et de créer le modèle. Sélectionnez collecter des données et entrez l’ID de test et le groupe de données dans l’onglet général. Sous l’onglet matériel, sélectionnez le type d’instrument et la méthode LAL, et vérifiez qu’un numéro de série, l’ID du système et les informations du port de série apparaissent à l’écran.Cliquez bien deux fois pour confirmer la sélection des instruments, et la communication avec l’instrument, et entrez l’iD de l’échantillon dans le même ordre que les échantillons seront testés. Utilisez ensuite les boutons par défaut pour entrer dans la courbe standard de contrôle négatif et testez des échantillons. Ajoutez le volume approprié de normes d’étalonnage de contrôle négatif et de contrôle de la qualité dans des tubes en verre préétiquetés en double.Et ajouter le volume approprié de LAL au premier test vile. Vortex le vil brièvement, et placez le flacon dans les fentes de test appropriées dans le carrousel d’instrument. Avant de charger les échantillons, effectuer plusieurs dilutions du matériau nano d’essai dans la dilution maximale valide comme démontré.Pour préparer une unité d’endotoxine de 05 par millilitre de contrôle d’amélioration de l’inhibition, combinez 25 microlitres de l’unité d’endotoxine par millilitre de solution d’endotoxine standard de contrôle, avec 475 microlitres du matériau nanométrique d’essai à une dilution donnée. Après le vortex, chargez les contrôles appropriés d’amélioration de l’innovation et les échantillons d’étude non prélevés dans l’instrument. Puis aliquot décombre et les nanomatériaux à pointes à une dilution spécifique dans les tubes pré-étiquetés.Avant le vortex, et le chargement dans le carrousel d’instrument. Pour effectuer un Gel-Clot LAL, préparer l’endotoxine standard de contrôle à une concentration finale de quatre lambda, et combiner 100 microlitres de norme, avec 100 microlitres d’eau, ou échantillon d’essai pour atteindre une concentration finale d’endotoxine standard de contrôle deux lambda. Ajouter 100 microlitres de Lysine à chaque dilution lambda.Vortex les tubes brièvement, et placer la grille de tubes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’incubation, inverser les tubes avec un mouvement lisse, et enregistrer manuellement les résultats en utilisant plus pour un caillot ferme, et moins pour aucun caillot, ou un caillot lâche. Dans cette analyse représentative, la doxorubicine liposomale PEGylated a interféré avec le LAL chromogenic à la dilution cinq, cependant cette interférence a été surmontée aux dilutions plus élevées.La récupération de pointe était entre 50 et 200%quand la formulation a été examinée aux dilutions 50 et 500 dans la turbidité et le LAL chromogenic, aussi bien qu’à la dilution cinq, dans la turbidité LAL. Une fois ajustés par le facteur de dilution, les résultats étaient cohérents entre les illusions dans les deux essais. En outre, les résultats étaient cohérents entre les trois formats d’essai.Rappelez-vous que chaque échantillon a sa propre gamme de dilutions, chaque format LAL utilise sa norme de contrôle dans la doxine et le lysate, et que les tubes utilisés pour préparer les dilutions, et d’effectuer une réaction à différents pour chaque essai LAL. Pour cette procédure, d’autres méthodes comme peut être effectuée pour répondre à des questions supplémentaires sur le matériel Après son développement, cette technique a ouvert la voie pour les sutures et le domaine de la nanomédia, d’explorer les applications médicales de la nano-technologie formulé des médicaments chez l’homme, et des modèles cliniques, y compris, mais pas limité aux primates non humains, lapins, chiens et rats. N’oubliez pas que le travail avec la doxine peut être extrêmement dangereux et les précautions telles que le port d’équipement de protection individuelle, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Développement de ovaire de hamster chinois-hôte dosages de protéines cellulaires utilisant la technologie acoustique microparticules membranaires

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Détection et isolement des cellules du mélanome de circulation à l&#39;aide Débitmétrie photoacoustique

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Bacterial Detection &amp; identification au moyen de capteurs électrochimiques

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