Name: detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Die Studie wurde unterstützt durch Bundesmittel aus dem National Cancer Institute, National Institutes of Health, vertraglich HHSN261200800001E. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health And Human Services, noch erwähnt von Handelsnamen, kommerzielle Produkte oder Organisationen die Billigung der US-Regierung.

1. Vorbereitung der Nanopartikel-Proben
<ol><li>Die Studie Probe in LAL Grade Wasser vorbereiten.</li>
	<li>Wenn der pH-Wert der Probe außerhalb des Bereichs von 6-8 ist, passen Sie den pH-Wert mit pyrogenfreie-freie Natronlauge oder Salzsäure an.</li>
	<li>Mit LAL Grade Wasser bereiten mehrere Verdünnungen der Studie Probe. Stellen Sie sicher, dass die höchsten Verdünnung maximal gültigen Verdünnung (MVD) nicht überschreitet. Siehe Abschnitt "Diskussion" Einzelheiten zum MVD Schätzung.</li>
</ol><p class="jov...

<ol>
	<li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses.">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li><li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans:+an+overview.">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll+receptors,+CD14,+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS.">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li><li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Endotoxins Test. , (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).</li><li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+70+years+of+pyrogen+detection:+Current+state+and+future+perspectives.">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li><li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection.">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li><li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms:+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+(LAL).">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li><li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples.">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li><li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test.">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li><li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs:+Challenges,+considerations+and+strategy.">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations.">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation.">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations.">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li><li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System.">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li><li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry.">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li><li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry.">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li><li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin:+evaluation+of+different+test+methods.">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).</li><li>. NCL assay cascade Available from: <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015)</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity.">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li><li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices:+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test.">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li><li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+pyrogenicity+testing:+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+(MAT).">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li><li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines.">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxil(R)--the+first+FDA-approved+nano-drug:+lessons+learned.">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays.">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).</li><li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent:+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking.">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li><li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition.">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles.">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+(lipopolysaccharide)+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles,+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation.">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li></ol>

Die Informationen in diesem Protokoll ist beschrieben worden, vor15,26 und stützt sich auf mehrere regulatorischer Dokumente, herausgegeben von der US Food and Drug Administration (FDA oder FDA) und Vereinigte Staaten Arzneibuch (USP)4 , 5 , 6 , 27, und ist auch auf den NCL Webseite20 Protokolle STE1.2 (Trübung...

Ein Endotoxin ist ein Baustein der gramnegativen bakteriellen Zellwand1,2. Es kann aktivieren Immunzellen auf sehr niedrige (Picogram) Konzentrationen1,2. Die proinflammatorischen Mediatoren (Zytokine, Leukotrienen, Eikosanoide, etc.) produziert von den Zellen als Reaktion auf ein Endotoxin sind verantwortlich für Fieber, Hypotonie, Hypertonie und schweren gesundheitlichen Problemen einschließlich Multiorganversagen 1 , 2 , 3. immunvermittelte Nebenwirkungen ausgelöst durch das Endotoxin Schweregrad auf seine Potenz durch die Endotoxin-Zusammensetzung und Struktur bestimmt und in internationalen Endotoxin Units (IUs oder EUs)3gemessen. Die Anzahl dieser Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht wird verwendet, um eine pyrogene Schwellendosis von Endotoxin festgelegt. Diese Dosis ist 5 EU/kg für Arzneimittel über alle Routen aber die intrathekale Route verabreicht. Pro Quadratmeter Körperoberfläche, intraokulare Flüssigkeiten, radioaktive Arzneimittel und Produkte verabreicht über intrathekale Route dosiert Medikamente haben eine unterschiedliche pyrogene Schwellendosis, die 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (wo V ist die Volumen des Produktes für die Verwaltung), und 0,2 EU/kg, bzw.4. Weitere Details über die pyrogene Schwellendosis für verschiedene Medikamente und Geräte werden zur Verfügung gestellt und4,5,6an anderer Stelle erläutert.
Tiere sind sehr unterschiedlich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin-vermittelten Reaktionen. Menschen, nicht-menschlichen Primaten und Kaninchen sind unter den meisten extrem empfindlich auf Endotoxine3Arten. Endotoxin-vermittelte Nebenwirkungen bei Patienten zu vermeiden und zu verhindern, dass falsche Schlussfolgerungen der präklinischen Toxizität und Wirksamkeitsstudien, ist es wichtig, genau zu erkennen und zu quantifizieren, Endotoxine in beiden klinischen und präklinischen Grade Formulierungen. Einige derzeit verfügbare Methoden können diese Aufgabe erreichen. Eine davon ist die Probe, Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), die häufig, weltweit zu Bildschirm biomedizinische Produkte für die mögliche Endotoxin Verunreinigung sowie verwendet wird zu bakteriellen Infektionen7,8,9zu erkennen. Die lysate aus Amöbozyten bereit ist, die Zellen im Blut von Pfeilschwanzkrebse Limulus Polyphemus präsentieren mit Wohnsitz in der Ostküste des Kontinents Nordamerika7. Interessanterweise gibt es ein paar verschiedene Arten von Pfeilschwanzkrebse (Tachypleus Gigas und Tachypleus Tridentatus) in Asien10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) wird in mehreren asiatischen Ländern verwendet, für den Nachweis von Endotoxin ähnlich wie die LAL in anderen Cuntries10verwendet wird. Die Lysaten (LAL und TAL) enthalten eine Gruppe von Proteinen, die bei Aktivierung Protease-Aktivität zu verleihen. Eines dieser Proteine, die so genannte Faktor C wird bei Kontakt mit Endotoxin aktiviert. Aktivierten Faktor C spaltet Faktor B, die wiederum auch wird eine Protease und bindet sich ein Pro-gerinnende Enzym zu einer Blutgerinnung Enzym herzustellen. Das Ergebnis dieser Kette von Reaktionen ist die Bildung eines Gels, eine Erhöhung der in der Probe Trübung und in Anwesenheit von einem chromogenen Substrat, das Erscheinungsbild der ein farbiges Produkt, das als Grundlage für Gel-Clot, Trübung und chromogenen Tests dienen, bzw.. Zwar gibt es keine verbindlichen LAL-Format, die US Food and Drug Administration (FDA) erklärt in der Anleitung für Papier, Industrie, daß im Falle von Abweichungen in den Testergebnissen zwischen verschiedenen LAL-Formaten, die Entscheidung getroffen wird anhand der Gel-Clot-Assay5 .
Viele gängigen Laborchemikalien (zB., EDTA) und bekannte Droge Produkte (z. B. Penicillin) LAL stören assays11. Der Eingriff wird in der Regel durch Beurteilung der Erholung von der Endotoxin standard versetzt in einer bekannten Konzentration in einer Lösung, die das Testmaterial identifiziert. Wenn die Spitze Erholung weniger als 50 % oder mehr als 200 %, dann das Ergebnis der LAL assay für ist die gegebenen Testmaterial durch Hemmung oder Verstärkung, bzw.4ungültig. Nanotechnologie-basierte Formulierungen sind oft komplex und stören die LAL durch eine Vielzahl von Mechanismen12,13,14. Viele Ansätze sind beschrieben worden, um die Störungen zu überwinden: Probe Rekonstitution in speziellen Puffer und Tensiden, Protein-Inaktivierung durch Erhitzen, Vernichtung von Lipid-basierte hohl Material durch Erhitzen und Ergänzung der Probe mit Selbstbeteiligung zweiwertigen kationen5,12,13,14,15. Alternative Methoden für Situationen, in denen LAL Störungen überwunden werden kann sind auch beschrieben worden: ELISA, ein HEK-TLR4 Reporter Cell line Assay und Massenspektrometrie16,17,18, 19.
Experimentelle Verfahren für die Durchführung von Gel-Clot, Trübung und chromogenen LAL-Assays sind hier beschrieben. Diese Tests sind auch auf die Nanotechnologie Charakterisierung Lab (NCL) Webseite20 in Protokollen STE1.2 (Trübung LAL), STE1.3 (Gel-Clot LAL) und STE1.4 (chromogene LAL). Es wird empfohlen, mindestens zwei verschiedene Formate zur Charakterisierung der gleichen Nano-Formulierung durchzuführen. Wenn Ergebnisse der Trübung und chromogenen LAL nicht einverstanden sind, gelten die Gel-Clot Ergebnisse5. Wenn die Ergebnisse von zwei LAL Formaten nicht einverstanden sind, durchgeführt21zusätzliche Studien mit Monocyte Aktivierung Test (MAT) oder Kaninchen Pyrogentest (RPT), um LAL zu überprüfen sind. Es ist wichtig zu beachten, dass jede Methode Endotoxin-Erkennung und Pyrogenität Bewertung Vorteile und Einschränkungen21,22,23,24 hat. Grenzen des Verfahrens verwendet, um eine gegebene Nanotechnologie Formulierung charakterisieren zu erkennen ist wichtig, wissenschaftliche Rechtfertigung für die Anwendung des Verfahrens für die Nano-Formulierung optimal erhalten.
In dieser Studie wurde pegylierte liposomale Doxorubicin als Modell Nanopartikel Formulierung verwendet. Diese Formulierung wurde 1995 von der US-Zulassungsbehörde FDA genehmigt und zur Behandlung von Krebs-Patienten weltweit25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Turbidity LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>T0051</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity assay only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogenic LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrochrome LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>CG1500-5</td>
			<td>This reagent is specific to the Chromogenic Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>EC010</td>
			<td>This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-Clot LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>G5003</td>
			<td>This reagent is specific to the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TS050</td>
			<td>These tubes are for use with the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays

Wenn Sie in pharmazeutischen Produkten, eine gramnegative bakterielle Zellwand Komponente Endotoxin (oft auch als Lipopolysaccharid) kann dazu führen, dass Entzündungen, Fieber, Hypo- oder Hypertonie, und, in extremen Fällen kann zu führen Gewebe und Organ-Schäden, die möglicherweise werden Sie tödlich. Die Beträge von Endotoxin in pharmazeutischen Produkten sind daher streng geregelt. Unter den Methoden für die Endotoxin-Erkennung und Quantifizierung ist der Test Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) weltweit verbreitet. Während der LAL-Test Arzneimittel stören kann, stellen Nano-Formulierungen aufgrund ihrer Komplexität eine besondere Herausforderung dar. Dieses Papier soll eine praktische Anleitung zum Forscher unerfahrenen bei der Abschätzung der Endotoxine in Nanomaterialien und Nanopartikel formuliert Drogen zu bieten. Hier werden praktische Empfehlungen für die Durchführung von drei LAL-Formate einschließlich Trübung, chromogenen und Gel-Clot Assays diskutiert. Diese Tests können zur Endotoxin-Kontamination in Nanotechnologie-basierte Medikamente, Impfstoffe und Adjuvantien herangezogen werden.

Das Beispiel von Daten nach der Prüfung dieser Formulierung in LAL-Tests ist in Tabelle 1dargestellt. Pegyliertem liposomalen Doxorubicin mischte sich mit chromogenen LAL bei Verdünnung 5. Jedoch wurde diese Störungen durch höhere Verdünnungen überwinden. Spike Erholung war zwischen 50 und 200 %, wenn diese Formulierung bei Verdünnungen 50 und 500 in Trübung und chromogenen LAL sowie bei Verdünnung 5 Trübung LAL getestet wurde. Wenn durch den Verdünnungsfaktor ...

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Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Erkennung von Endotoxinen in Nanomaterialien stellt eine der großen Herausforderungen im Bereich der Nanomedizin. Hier präsentieren wir Ihnen eine Fallstudie, die beschreibt den Rahmen, bestehend aus drei verschiedenen LAL-Formaten, mögliche Endotoxin-Kontamination in Nanopartikel zu schätzen.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Diese Methode kann helfen, im medizinischen Bereich über die Sicherheit von Nanoarzneimitteln zu antworten. Der Vorteil dieser Technik ist, dass es Standard ist, und wird weltweit für die Bewertung von Produkten verwendet, Um Nano-Medikamente. Demonstration des Verfahrens, wird Barry Neun, im Nano Technology Characterization Lab sein.Verwenden Sie für die Kalibrierungsstandardvorbereitung 900 Mikroliter Limulus-Amebocytlysat oder LAL-Wasser. Und 100 Mikroliter Kontrollstandard Endotoxin, um so viele Zwischenverdünnungen wie nötig vorzubereiten, um die Herstellung eines Kalibrierstandards mit einer Konzentration von einer Endotoxineinheit pro Milliliter zu ermöglichen. Mit 900 Mikroliter LAL-Wasser und 100 Mikrolitern der einheit pro Milliliter Kalibrierstandard erstellen Sie einen zweiten Kalibrierstandard bei einer Konzentration von 0,1 Endotoxineinheit pro Milliliter.Wiederholen Sie dann die serielle Verdünnung um das Zehnfache, um zwei niedrigere Kalibrierstandards vorzubereiten. Um insgesamt vier Kalibrierstandards zu erhalten, die von 0001 bis zu einer Endotoxineinheit pro Milliliter reichen. Zur Herstellung einer 05 Endotoxineinheit pro Milliliter Qualitätskontrolle, kombiniert 50 Mikroliter der einen Endotoxineinheit pro Milliliter der Kontrollstandard-Endotoxin-Lösung, mit 950 Mikroliter LAL-Wasser.Wählen Sie als Nächstes in der Software die Geräteeinstellungen aus, und erstellen Sie die Vorlage. Wählen Sie Daten sammeln aus, und geben Sie die Test-ID und die Datengruppe auf der Registerkarte Allgemein ein. Wählen Sie auf der Registerkarte Hardware den Gerätetyp und die LAL-Methode aus, und stellen Sie sicher, dass eine Seriennummer, die System-ID und die Informationen zum seriellen Anschluss auf dem Bildschirm angezeigt werden.Klicken Sie zwei Mal auf okay, um die Instrumentenauswahl und die Kommunikation mit dem Instrument zu bestätigen, und geben Sie die Beispiel-IDs in der gleichen Reihenfolge ein, in der die Samples getestet werden. Verwenden Sie dann die Standardschaltflächen, um die Negative-Steuer-Standardkurve einzugeben, und testen Sie Beispiele. Fügen Sie das entsprechende Volumen negativer Kontrollkalibrierungsstandards und Qualitätskontrolle in doppelte vorbeschriftete Glasröhren ein.Und fügen Sie das entsprechende Volumen von LAL zum ersten Test-Abscheu hinzu. Wirbeln Sie den Teufel kurz, und legen Sie die Durchstechflasche in die entsprechenden Testschlitze im Instrumentenkarussell. Führen Sie vor dem Beladen der Proben mehrere Verdünnungen des Test-Nanomaterials innerhalb der maximal gültigen Verdünnung durch, wie gezeigt.Um eine 05 Endotoxineinheit pro Milliliter Hemmungsverbesserungskontrolle vorzubereiten, kombinieren Sie 25 Mikroliter der einen Endotoxineinheit pro Milliliter Kontrollstandard-Endotoxinlösung, mit 475 Mikrolitern des Test-Nanomaterials bei einer gegebenen Verdünnung. Laden Sie nach dem Wirbeln die entsprechenden Steuerelemente für die Innovationsverbesserung und die nicht gespickten Studienproben in das Gerät. Dann aliquot unspiked und die gespickten Nano-Materialien bei einer bestimmten Verdünnung in vorbeschriftete Rohre.Vor dem Wirbeln und Laden in das Instrumentenkarussell. Um ein Gel-Clot LAL durchzuführen, bereiten Sie die Kontrollstandard-Endotoxin auf eine endgültige Konzentration von vier Lambda vor und kombinieren Sie 100 Mikroliter Standard mit 100 Mikroliter Wasser oder Eine Testprobe, um eine endgültige Konzentration des Kontrollstandards Endotoxin zwei Lambda zu erreichen. Fügen Sie 100 Mikroliter Lysin zu jeder Lambda-Verdünnung hinzu.Wirbeln Sie die Rohre kurz, und legen Sie das Rack der Rohre in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für eine Stunde. Am Ende der Inkubation, invertieren Sie die Rohre mit einer glatten Bewegung, und zeichnen Sie die Ergebnisse manuell mit Plus für ein festes Gerinnsel, und Minus für kein Gerinnsel, oder ein loses Gerinnsel. In dieser repräsentativen Analyse störte PEGylatd liposomale doxorubicin mit chromogenem LAL bei Verdünnung fünf, jedoch wurde diese Interferenz bei höheren Verdünnungen überwunden.Die Spike-Wiederherstellung lag zwischen 50 und 200%, als die Formulierung an den Verdünnungen 50 und 500 in der Trübung und chromogenen LAL sowie bei Verdünnung 5 in der Trübung LAL getestet wurde. Bereinigt um den Verdünnungsfaktor waren die Ergebnisse zwischen den Wahnvorstellungen in beiden Aufsätzen konsistent. Darüber hinaus waren die Ergebnisse zwischen den drei Essayformaten konsistent.Denken Sie daran, dass jede Probe ihren eigenen Bereich von Verdünnungen hat, jedes LAL-Format verwendet seinen Kontrollstandard im Doxin und Lysat, und dass die Rohre verwendet werden, um die Verdünnungen vorzubereiten, und eine Reaktion mit unterschiedlichen für jeden LAL-Essay durchzuführen. Für dieses Verfahren andere Methoden wie Kann durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über Material zu beantworten Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Nähte und den Bereich der Nanomedizin, um die medizinischen Anwendungen der Nanotechnologie formulierte Medikamente beim Menschen zu erforschen, und klinische Modelle einschließlich, aber nicht beschränkt auf nicht menschliche Primaten, Kaninchen, Hunde und Ratten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Doxin extrem gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Forschung

Biotechnik

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Erkennung und Isolierung von zirkulierenden Melanomzellen mit Photoakustische Flowmetrie

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Biegesteifigkeit Maße von Biopolymeren mit Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomische Rekonstruktionen des menschlichen Cardiac Venensystem mit Kontrast-Computertomographie Perfusion-fixierten Proben

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...