Name: detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

המחקר נתמך על ידי כספים פדרליים של המכון הלאומי לסרטן, מכוני הבריאות הלאומיים, תחת חוזה HHSN261200800001E. התוכן של פרסום זה אינן משקפות בהכרח את ההשקפות או מדיניות של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של, ולא הזכיר של שמות מסחריים, מוצרים מסחריים, או ארגונים מעיד על ממשלת ארה ב.

1. הכנת דוגמאות ננו-חלקיק
<ol><li>הכנת המדגם במחקר ב- LAL כיתה מים.</li>
	<li>אם ה-pH הדגימה מחוץ לטווח 6-8, להתאים את ה-pH באמצעות pyrogen ללא סודה קאוסטית או חומצה הידרוכלורית.</li>
	<li>באמצעות LAL כיתה מים להכין מספר דילולים המדגם במחקר. ודא כי דילול הגבוה ביותר לא יעלה על דילול מרבי חוקי (MVD). עיין בסעיף ' דיון ' ל...

<ol>
	<li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses.">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li><li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans:+an+overview.">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll+receptors,+CD14,+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS.">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li><li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Endotoxins Test. , (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).</li><li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+70+years+of+pyrogen+detection:+Current+state+and+future+perspectives.">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li><li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection.">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li><li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms:+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+(LAL).">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li><li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples.">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li><li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test.">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li><li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs:+Challenges,+considerations+and+strategy.">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations.">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation.">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations.">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li><li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System.">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li><li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry.">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li><li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry.">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li><li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin:+evaluation+of+different+test+methods.">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).</li><li>. NCL assay cascade Available from: <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015)</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity.">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li><li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices:+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test.">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li><li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+pyrogenicity+testing:+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+(MAT).">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li><li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines.">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxil(R)--the+first+FDA-approved+nano-drug:+lessons+learned.">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays.">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).</li><li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent:+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking.">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li><li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition.">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles.">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+(lipopolysaccharide)+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles,+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation.">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li></ol>

במידע הנמסר פרוטוקול זה תואר קודם15,26 ומסתמך על מספר מסמכי רגולציה שפורסם על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA או ה-FDA) ואת ארצות הברית פרמקופיאה (USP)4 , 5 , 6 , 27, והוא גם זמין באתר NCL<sup class="xre...

אנדוטוקסין היא אבן בניין של הקיר תא החיידק גראם שליליים1,2. זה יכול להפעיל את התאים החיסוניים ב מאוד נמוכה (picogram) ריכוזים1,2. המתווכים proinflammatory (ציטוקינים, לאוקוטריאנים, eicosanoids, וכו ') המיוצר על ידי תאי בתגובה אנדוטוקסין אחראים קדחת, תת לחץ דם, יתר לחץ דם, בעיות בריאות חמורות יותר, כולל אי ספיקת איברים מרובים 1 , 2 , 3. חומרת בתיווך החיסון תופעות המופעלות על-ידי אנדוטוקסין תלוי מחריפותו נקבעים על-ידי אנדוטוקסין הרכב ואת מבנה ומדד אנדוטוקסין הבינלאומי יחידות (IUs או EUs)3. המספר של יחידות אלה לכל קילוגרם של משקל גוף משמשת להגדרת מנה פירוגני הסף של אנדוטוקסין. מינון זה הוא ש-5 האיחוד האירופי לק"ג למוצרים סמים מנוהל באמצעות כל נתיבי אבל המסלול במחלה. סמים עצומות למטר מרובע של פני השטח של הגוף, נוזלים תוך-עיני, radiopharmaceuticals מוצרים מנוהל באמצעות מסלול במחלה יש מנה פירוגני סף שונות, אשר הוא 100 האיחוד האירופי/m2, האיחוד האירופי 0.2/mL, האיחוד האירופי 175/V (איפה V נפח של המוצר מיועד עבור ניהול), ו- 0.2 האיחוד האירופי לק"ג, בהתאמה4. פרטים נוספים אודות המנה פירוגני מסף סמים מוצרים והתקנים שונים הינם מסופקים, נדון במקום אחר4,5,6.
חיות להשתנות באופן נרחב את רגישותם בתיווך אנדוטוקסין תגובות. בני אדם, קופים, ארנבים הם בין המינים רגישים ביותר ביותר endotoxins3. כדי למנוע תופעות לוואי בתיווך אנדוטוקסין בחולים ולמנוע המסקנות לא מדויק של רעילות פרה ולימודי היעילות, זה חיוני כדי לזהות ולכמת endotoxins ניסוחים כיתה-קליניים ומחקרים קליניים מראש שני במדויק. מספר שיטות זמין כרגע ניתן להשיג משימה זו. אחד מהם הוא וזמינותו Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), אשר נמצא בשימוש נפוץ ברחבי העולם מוצרים ביו מסך עבור פוטנציאל אנדוטוקסין לזיהום גם באשר לזהות זיהומים חיידקיים7,8,9. Lysate הוא מוכן מן amoebocytes, התאים הנוכחי בדם של הפרסה סרטנים Limulus פוליפמוס המתגוררים לחוף המזרחי של יבשת צפון אמריקה7. מעניין, יש כמה מינים שונים של סרטנים פרסה (Tachypleus גיגס , Tachypleus tridentatus) ב אסיה10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (טל) משמש במספר מדינות אסיה איתור אנדוטוקסין הדומה איך LAL משמש cuntries10. Lysates (LAL וטל) מכילים קבוצה של חלבונים המקנים בעת הפעלת פרוטאז פעילות. אחד החלבונים האלה, הגורם כביכול C מופעל בעת מגע עם אנדוטוקסין. C גורם שהופעל cleaves Factor B, אשר בתורו גם הופך פרוטאז ודבק אנזים קרישת pro כדי לייצר אנזים קרישת דם. התוצאה של תגובות שרשרת הזאת היא היווצרות של ג'ל, עלייה של עכירות מדגם ו, בנוכחות מצע הדפסות כסף, המראה של מוצר צבעוניים, אשר לשמש בסיס ג'ל-קריש דם, עכירות, מבחני הדפסות כסף, בהתאמה. אמנם יש תבנית LAL אין חובה, של מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) מסביר ההדרכה עבור תעשיית המסמך, כי במקרה של אי-התאמה בתוצאות הבדיקה בין פורמטים שונים לל, ההחלטה בהתבסס על וזמינותו ג'ל-קריש5 .
רבים נפוץ כימיקלים המעבדה (למשל., EDTA), סמים ידוע מוצרים (לדוגמה פניצילין) להפריע LAL מבחני11. ההפרעות מזוהה בדרך כלל על-ידי הערכת ההתאוששות של אנדוטוקסין תקן עלה בריכוז ידוע לתוך פתרון המכיל את החומר. אם השחזור ספייק הוא פחות מ- 50% או יותר מאשר 200%, אז התוצאה של LAL assay עבור החומר מבחן נתון אינו חוקי עקב עיכוב או שיפור, בהתאמה4. ניסוחים המבוסס על ננו-טכנולוגיה מורכבים לעיתים קרובות ומשבשים LAL באמצעות מגוון רחב של מנגנונים12,13,14. גישות רבות תוארו להתגבר על ההפרעות: שיחזור מדגם מאגרים ספציפיים, פיתחה, חלבון איון על ידי חימום, הרס של חומרי חלול מבוססי השומנים על ידי חימום ומשלימות את הדגימה. עם עודף קטיונים דו ערכיים5,12,13,14,15. שיטות אלטרנטיביות במצבים כאשר לא ניתן להתגבר על הפרעות LAL גם תוארו: אליסה, תא כתב HEK-TLR4 קו assay, ספקטרומטר מסה16,17,18, 19.
במסמך זה, מתוארים הליכים ניסיוני לעריכת ג'ל-קריש דם, עכירות, מבחני LAL הדפסות כסף. מבחני אלה הינם גם זמינים על אתר ננוטכנולוגיה אפיון מעבדה (NCL)20 בפרוטוקולים STE1.2 (עכירות LAL), STE1.3 (LAL ג'ל-clot) ו STE1.4 (LAL הדפסות כסף). מומלץ לבצע לפחות שתי תבניות שונות לאפיון הננו-ניסוח זהה. כאשר תוצאות של עכירות, הדפסות כסף LAL מסכימים, התוצאות ג'ל-קריש דם נחשבים5. כאשר התוצאות של שתי תבניות LAL מסכימים, נוספים הם ממצאי מחקרים באמצעות מונוציט הפעלת מבחן (MAT) או ארנב pyrogen מבחן (RPT) כדי לוודא LAL ערכו21. חשוב לציין כי כל שיטה המשמש לצורך זיהוי אנדוטוקסין לפירוגניות הערכה יש יתרונות ומגבלות21,22,23,24. הכרה במגבלות של ההליך שימוש כדי לאפיין את ניסוח ננוטכנולוגיה נתון חיוני להשגת הצדקה מדעית לשימוש של האופטימלית עבור הננו-ניסוח זה ההליך.
במחקר זה, שימש PEGylated liposomal דוקסורוביצין ניסוח nanoparticle מודל. ניסוח זה אושר על ידי FDA בארה ב בשנת 1995 ומשמשת לטיפול סרטן מטופלים ברחבי העולם25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Turbidity LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>T0051</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity assay only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogenic LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrochrome LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>CG1500-5</td>
			<td>This reagent is specific to the Chromogenic Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>EC010</td>
			<td>This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-Clot LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>G5003</td>
			<td>This reagent is specific to the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TS050</td>
			<td>These tubes are for use with the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays

כאשר נוכח מוצרים פרמצבטיים, אנדוטוקסין רכיב הקיר תא החיידק גראם שליליים (הנקרא לעתים קרובות גם ליפופוליסכריד) יכול לגרום דלקת, חום, היפו - או יתר לחץ דם, במקרים קיצוניים, יכול לגרום נזק לרקמות ו עוגב זה ייתכן להיות קטלני. כמויות אנדוטוקסין במוצרי תרופות, לכן, הם מווסתים. בין השיטות הזמינות אנדוטוקסין זיהוי, כימות, וזמינותו Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) הוא נפוץ ברחבי העולם. בעוד כל מוצר התרופות עלולות להפריע וזמינותו לל, ננו-ניסוחים מייצגים אתגר מסוים עקב המורכבות שלהם. מטרת מאמר זה היא לספק מדריך מעשי חוקרים מנוסים באומדן endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים וסמים ניסח ננו-חלקיק. במסמך זה, המלצות מעשיות לביצוע שלוש תבניות LAL כולל עכירות, הדפסות כסף, ג'ל-קריש מבחני נידונות. מבחני אלה יכול לשמש כדי לקבוע אנדוטוקסין זיהום מוצרים מבוססי ננו-טכנולוגיה תרופות, חיסונים, adjuvants.

הדוגמה של נתונים שנוצרו לאחר בדיקות ניסוח זה מבחני LAL מוצג בטבלה 1. PEGylated liposomal דוקסורוביצין התערב עם הדפסות כסף LAL-דילול 5. עם זאת, הפרעה זו הוכרע על ידי דילולים רבתי. שחזור ספייק היה בין 50 ל- 200%, כאשר ניסוח זה נבחנה ב דילולים 50 ו-500 עכירות ו לל הדפסות כסף, כמו גם דילול 5 ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

זיהוי של endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים מייצג אחד האתגרים הגדול ביותר בתחום של ננו-רפואה. כאן, אנו מציגים חקר מקרה המתארת את המסגרת המורכבת LAL שלושה פורמטים שונים כדי להעריך את פוטנציאל זיהום אנדוטוקסין בחלקיקים.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות בתחום הרפואי על בטיחות של תרופות ננו. היתרונות של טכניקה זו היא כי הוא סטנדרטי, והוא משמש ברחבי העולם להערכת מוצרים, כדי ננו תרופות. הדגמה של ההליך, יהיה בארי נוין, במעבדה לאפיון טכנולוגי ננו.להכנת תקן כיול, השתמש ב- 900 מיקרוליטרים של לימולוס אמבוציטים ליסאט, או מים ברמה LAL. ו-100 מיקרוליטרים של אנדוטוקסין סטנדרטי לבקרה, כדי להכין כמה דילול ביניים לפי הצורך, כדי לאפשר הכנת תקן כיול עם ריכוז של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר. לאחר מכן, באמצעות 900 מיקרוליטרים של מים בדרגת LAL, ו-100 מיקרוליטרים של יחידת אנדוטוקסין אחת לכל תקן כיול מיליליטר, הכינו תקן כיול שני, בריכוז של יחידת אנדוטוקסין 0.1 למיליליטר.לאחר מכן חזור על הדילול הסידורי פי עשרה כדי להכין שני תקני כיול נמוכים יותר. כדי להשיג בסך הכל ארבעה תקני כיול, החל מ- 0001 ליחידת אנדוטוקסין אחת לכל מיליליטר. כדי להכין יחידת אנדוטוקסין 05 לבקרת איכות מיליליטר, משלב 50 מיקרוליטר של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר של פתרון אנדוטוקסין סטנדרטי בקרה, עם 950 microliters של מים בדרגה LAL.הבא בתוכנה בחר את הגדרות הכלי וצור את התבנית. בחר לאסוף נתונים והזן את מזהה הבדיקה ואת קבוצת הנתונים בכרטיסיה כללי. תחת הכרטיסיה חומרה, בחר את סוג הכלי ואת פעולת השירות LAL וודא שמספר סידורי, מזהה המערכת ומידע היציאה הטורית מופיעים על המסך.לחץ על אישור פעמיים כדי לאשר את בחירת המכשיר, ואת התקשורת עם המכשיר, והזן את מזהה הדגימה באותו סדר שבו הדגימות ייבדקו. לאחר מכן השתמש בלחצני ברירת המחדל כדי להזין את העקומה הסטנדרטית של הפקד השלילי ולבדוק דגימות. הוסף את עוצמת הקול המתאימה של תקני כיול בקרה שליליים, ואת בקרת האיכות לצינורות זכוכית כפולים המסווים מראש.ולהוסיף את הנפח המתאים של LAL למבחן הנתעב הראשון. Vortex הנתעב בקצרה, ומ מניחים את הבקבוקון לתוך חריצי הבדיקות המתאימים בקרוסלה המכשיר. לפני טעינת הדגימות, לבצע מספר דילולים של חומר ננו הבדיקה בתוך דילול תקף מקסימלי כפי שהוכח.כדי להכין יחידת אנדוטוקסין 05 למיליליטר של בקרת שיפור עיכוב, לשלב 25 microliters של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר של פתרון אנדוטוקסין סטנדרטי שליטה, עם 475 microliters של חומר ננו הבדיקה בדילול נתון. לאחר המערבולת, לטעון את פקדי שיפור החדשנות המתאימים, ואת דגימות המחקר unspiked לתוך המכשיר. ואז aliquot unspiked וחומרי ננו ממוסקרים בדילול מסוים לתוך צינורות מסומנים מראש.לפני המערבולת, וטעינה לתוך קרוסלה המכשיר. כדי לבצע LAL ג'ל קריש, להכין אנדוטוקסין תקן בקרה לריכוז סופי של ארבעה lambda, ולשלב 100 microliters של תקן, עם 100 microliters של מים, או מדגם בדיקה כדי להשיג ריכוז סופי של אנדוטוקסין סטנדרטי שליטה שני lambda. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של לי לסין לכל דילול למדה.Vortex הצינורות לזמן קצר, ולה מניחים את מתלה של צינורות לתוך 37 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, להפוך את הצינורות עם תנועה חלקה, באופן ידני להקליט את התוצאות באמצעות פלוס עבור קריש מוצק, ומינוס ללא קריש, או קריש רופף. בניתוח מייצג זה, PEGylated ליפוזומלי דוקסורוביצין הפריע LAL כרומוגני בדילול חמש, אולם הפרעה זו התגברה בדילול גבוה יותר.התאוששות ספייק היה בין 50 ל 200% כאשר הניסוח נבדק בדילול 50 ו 500 ב LAL turbidity וכרומוגנית, כמו גם בדילול חמש, ב LAL turbidity. כאשר הותאמו על ידי גורם הדילול, התוצאות היו עקביות בין הזיות בשני החיבורים. יתר על כן, התוצאות היו עקביות בין שלושת פורמטים החיבור.זכור כי לכל מדגם יש מגוון משלו של דילולים, כל פורמט LAL משתמש בתקן הבקרה שלו ב- doxin ו- lysate, ושצינורות המשמשים להכנת הדילולים, ולבצע תגובה שונה עבור כל חיבור LAL. עבור הליך זה שיטות אחרות כמו ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות על חומר לאחר התפתחותו, טכניקה זו סללה את הדרך עבור התפרים ואת התחום של ננו רפואה, לחקור את היישומים הרפואיים של ננו טכנולוגיה ניסח תרופות בבני אדם, מודלים קליניים כולל אך לא מוגבל פרימטים שאינם אנושיים, ארנבות, כלבים, וחולדות. אל תשכח כי עבודה עם דוקסין יכול להיות מסוכן מאוד ואת אמצעי הזהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי, תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

פיתוח התאמה אישית הסינית השחלות-מארח אוגר Cell חלבון מבחני באמצעות טכנולוגיה אקוסטית microparticle ממברנה

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

איתור בידוד של תאים מלנומה במחזור באמצעות Flowmetry photoacoustic

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

מדידות קשיחות כפיפה של Biopolymers שימוש במבחני דאייה

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

שחזורים אנטומיים של מערכת ורידי לב האנושית באמצעות ניגודיות, טומוגרפיה ממוחשבת של דגימות זלוף-קבועות

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...