Name: detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Lo studio è stato sostenuto da fondi federali dal National Cancer Institute, National Institutes of Health, sotto contratto HHSN261200800001E. Il contenuto di questa pubblicazione non riflettono necessariamente le opinioni o le politiche del dipartimento di salute e servizi umani, né fa menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali, o organizzazioni implicano l'approvazione dal governo statunitense.

1. preparazione dei campioni di nanoparticelle
<ol><li>Preparare il campione di studio in LAL acqua di grado.</li>
	<li>Se il pH del campione è fuori dell'intervallo di 6-8, regolare il pH utilizzando apirogena di idrossido di sodio o acido cloridrico.</li>
	<li>LAL l'utilizzo di acqua di qualità per preparare diverse diluizioni del campione di studio. Assicurarsi che la diluizione più alta non superi la massima diluizione valida (MVD). Fare riferimento alla sezione "discussione" per informazioni dettagliate sulla s...

<ol>
	<li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses.">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li><li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans:+an+overview.">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. 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S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection.">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li><li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms:+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+(LAL).">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li><li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples.">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li><li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test.">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li><li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs:+Challenges,+considerations+and+strategy.">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations.">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation.">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations.">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li><li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System.">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li><li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry.">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li><li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry.">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li><li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin:+evaluation+of+different+test+methods.">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).</li><li>. NCL assay cascade Available from: <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015)</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity.">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li><li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices:+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test.">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li><li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+pyrogenicity+testing:+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+(MAT).">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li><li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines.">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxil(R)--the+first+FDA-approved+nano-drug:+lessons+learned.">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays.">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).</li><li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent:+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking.">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li><li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition.">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles.">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+(lipopolysaccharide)+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles,+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation.">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li></ol>

Le informazioni fornite in questo protocollo sono stato descritto prima15,26 e si basa su diversi documenti normativi pubblicati da la US Food and Drug Administration (FDA o FDA) e farmacopea statunitense (USP)4 , 5 , 6 , 27ed è anche disponibile sul sito Web NCL20 nei protocolli STE1.2 (torbidità LAL), STE1.3 ...

Un'endotossina è un blocco di costruzione della parete cellulare batterica gram-negativi1,2. Può attivare le cellule immunitarie a molto bassa (picogrammo) concentrazioni1,2. I mediatori proinfiammatori (eicosanoidi, leucotrieni, citochine, ecc.) prodotti dalle cellule in risposta a un'endotossina sono responsabili di febbre, ipotensione, ipertensione e problemi di salute più gravi tra cui guasto multiplo dell'organo 1 , 2 , 3. la gravità di immune-mediata effetti collaterali innescati l'endotossina dipende dalla sua potenza determinata dalla struttura e composizione dell'endotossina e misurato in unità internazionali dell'endotossina (IUs o EUs)3. Il numero di queste unità per chilogrammo di peso corporeo viene utilizzato per impostare una soglia dose pirogeno dell'endotossina. Questa dose è di che 5 EU/kg per i prodotti di farmaco somministrato per via tutte le rotte ma la via intratecale. Farmaci dosati per metro quadrato di superficie corporea, liquidi intraoculari, radiofarmaci e prodotti amministrato via intratecale hanno una dose di pirogeno soglia diversa, ovvero 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (dove V è la volume del prodotto destinato alla somministrazione) e 0,2 EU/kg, rispettivamente4. Più particolari circa la dose soglia pirogeno per vari prodotti farmaceutici e dispositivi sono forniti e discussi altrove4,5,6.
Animali variano ampiamente nella loro sensibilità alle reazioni dell'endotossina-mediata. Gli esseri umani, primati non umani e i conigli sono tra le specie più estremamente sensibili alle endotossine3. Per evitare l'endotossina-mediata effetti collaterali nei pazienti ed evitare conclusioni inesatte di tossicità preclinica e studi di efficacia, è essenziale rilevare e quantificare le endotossine in entrambe le formulazioni grado clinico e preclinico accuratamente. Diversi metodi attualmente disponibili possono realizzare questo compito. Uno di loro è il dosaggio di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), che è comunemente usato in tutto il mondo a schermo prodotti biomedicali per la potenziale contaminazione di endotossina pure per rilevare infezioni batteriche7,8,9. Il lisato viene preparato da amoebocytes, le cellule presenti nel sangue dei granchi a ferro di cavallo del Limulus polyphemus che risiedono nella sponda orientale del continente Nord America7. Interessante, ci sono alcune specie di granchi a ferro di cavallo (Tachypleus gigas e Tachypleus tridentatus) in Asia10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) è utilizzato in diversi paesi asiatici per la rilevazione dell'endotossina simile a come il Leone è usato in altri Pinti10. I lisati (LAL e TAL) contengono un gruppo di proteine che, al momento dell'attivazione, conferiscono l'attività della proteasi. Una di queste proteine, il cosiddetto fattore C viene attivata in caso di contatto con l'endotossina. C attivata fattore fende il fattore B, che a sua volta anche diventa una proteasi e si unirà un enzima pro-coagulazione per la produzione di un enzima coagulazione. Il risultato di questa catena di reazioni è la formazione di un gel, un aumento della torbidità del campione e, in presenza di un substrato cromogenico, l'aspetto di un prodotto colorato, che servono come base per gel-clot, torbidità e le analisi cromogeniche, rispettivamente. Mentre non esiste un formato obbligatorio di LAL, la US Food and Drug Administration (FDA) spiega la guida per a documento di industria, che in caso di discrepanza nei risultati del test tra diversi formati LAL, la decisione è presa basato sul dosaggio di gel-clot5 .
Molti prodotti chimici di laboratorio comunemente usati (ad es., EDTA) e farmaci noti prodotti (ad es., penicillina) interferire con LAL test11. L'interferenza viene di solito identificato valutando il recupero dell'endotossina standard a spillo a una concentrazione nota in una soluzione contenente il materiale di prova. Se il recupero dei picchi è inferiore al 50% o più del 200%, quindi il risultato del LAL test per il materiale di prova specificato non è valido a causa della inibizione o miglioramento, rispettivamente4. Formulazioni a base di nanotecnologia sono spesso complesse e interferiscano con la LAL attraverso una varietà di meccanismi12,13,14. Sono stati descritti molti approcci per superare l'interferenza: ricostituzione di campione in buffer specifici e tensioattivi, inattivazione della proteina da riscaldamento, distruzione di materiali cavi basata sui lipidi riscaldamento e integrando il campione con eccesso cationi bivalenti5,12,13,14,15. Inoltre sono stati descritti metodi alternativi per situazioni in cui l'interferenza di LAL non può essere superato: ELISA, una cella di reporter HEK-TLR4 linea dosaggio e spettrometria di massa16,17,18, 19.
Vengono descritte procedure sperimentali per lo svolgimento di gel-clot, torbidità e cromogenico LAL saggi. Queste analisi sono anche disponibili sul sito Web laboratorio di caratterizzazione di nanotecnologia (NCL)20 nei protocolli STE1.2 (torbidità LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) e STE1.4 (cromogenico LAL). Si consiglia di effettuare almeno due diversi formati per caratterizzare la stessa formulazione di nano. Quando risultati della torbidità e cromogenico LAL in disaccordo, i risultati di gel-coagulo sono considerati5. Quando in disaccordo risultati due formati di LAL, ulteriori studi utilizzando prova di attivazione di monociti (MAT) o test di coniglio pirogeni (RPT) per verificare LAL risultati sono condotti21. È importante notare che ogni metodo utilizzato per il rilevamento di endotossina e valutazione pirogenicità ha vantaggi e limitazioni21,22,23,24. Riconoscere i limiti della procedura utilizzata per caratterizzare una formulazione di nanotecnologia dato è essenziale per ottenere la giustificazione scientifica per l'uso della procedura ottima per quel nano-formulazione.
In questo studio, doxorubicina liposomiale pegilata è stato usato come una formulazione di nanoparticelle di modello. Questa formulazione è stata approvata dalla FDA nel 1995 e utilizzata per il trattamento di pazienti di cancro in tutto il mondo25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Turbidity LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>T0051</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity assay only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogenic LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrochrome LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>CG1500-5</td>
			<td>This reagent is specific to the Chromogenic Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>EC010</td>
			<td>This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-Clot LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>G5003</td>
			<td>This reagent is specific to the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TS050</td>
			<td>These tubes are for use with the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays

Quando sono presenti in prodotti farmaceutici, un'endotossina di componente la parete cellulare batterica gram-negativi (spesso anche chiamato lipopolisaccaride) può causare infiammazione, febbre, IPO - o ipertensione e, in casi estremi, può portare a danni del tessuto e dell'organo che può diventare fatale. Gli importi dell'endotossina in prodotti farmaceutici, pertanto, sono strettamente regolamentati. Tra i metodi disponibili per il rilevamento di endotossina e quantificazione, il dosaggio di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) è comunemente usato in tutto il mondo. Mentre qualsiasi prodotto farmaceutico può interferire con il dosaggio LAL, nano-formulazioni rappresentano una sfida particolare per la loro complessità. Lo scopo di questa carta è quello di fornire una guida pratica ai ricercatori inesperti nella stima endotossine nei nanomateriali ingegnerizzati e formulato in nanoparticelle di farmaci. Nel presente documento, consigli pratici per l'esecuzione di tre formati LAL tra cui torbidità, cromogenico e gel-clot saggi sono discussi. Queste analisi possono essere utilizzate per determinare la contaminazione da endotossine adiuvanti, vaccini e farmaci basati sulle nanotecnologie.

L'esempio di dati generati dopo aver testato questa formulazione in LAL test è mostrato in tabella 1. Doxorubicina liposomiale pegilata interferito con LAL cromogenico alla diluizione 5. Tuttavia, questa interferenza è stata superata per diluizioni superiori. Recupero dei picchi è stato compreso tra 50 e 200% quando questa formulazione è stata provata a diluizioni 50 e 500 nella torbidità e cromogenico LAL, così come alla diluizione 5 torbidità LAL. Quando regolato...

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Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Rilevamento di endotossine in nanomateriali ingegnerizzati rappresenta una delle grandi sfide nel campo della nanomedicina. Qui, presentiamo un caso di studio che descrive il quadro composto da tre diversi formati LAL per stimare il potenziale contaminazione di endotossina in nanoparticelle.

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Questo metodo può aiutare a rispondere in campo medico sulla sicurezza dei nano medicinali. Il vantaggio di questa tecnica è che è standard, e viene utilizzato in tutto il mondo per la valutazione dei prodotti, ai nano medicinali. Dimostrazione della procedura, sarà Barry Neun, presso il Nano Technology Characterization Lab.Per la preparazione standard di calibrazione, utilizzare 900 microlitri di limulus amebocyte lysate o acqua di grado LAL. E 100 microlitri di endotossina standard di controllo, per preparare tutte le diluizioni intermedie necessarie, per consentire la preparazione di uno standard di calibrazione con una concentrazione di un'unità di endotossina per millilitro. Quindi, utilizzando 900 microlitri di acqua di grado LAL e 100 microlitri di un'unità di endotossine per millilitro standard di calibrazione, preparare un secondo standard di calibrazione, a una concentrazione di 0,1 unità di endotossine per millilitro.Quindi ripetere la diluizione seriale di dieci volte per preparare due standard di calibrazione più bassi. Ottenere un totale di quattro standard di calibrazione, che vanno da 0001 a un'unità di endotossina per millilitro. Per preparare un'unità di endotossina 05 per controllo di qualità millilitro, combina 50 microlitri di un'unità di endotossina per millilitro di soluzione endotossina standard di controllo, con 950 microlitri di acqua di grado LAL.Successivamente nel software selezionare le impostazioni dello strumento e creare il modello. Selezionare Raccogli dati e immettere l'ID test e il gruppo di dati nella scheda generale. Nella scheda hardware selezionare il tipo di strumento e il metodo LAL e verificare che sullo schermo venga visualizzato un numero di serie, l'ID di sistema e le informazioni sulla porta seriale.Fare clic due volte per confermare la selezione dello strumento e la comunicazione con lo strumento e immettere gli ID campione nello stesso ordine in cui i campioni verranno testati. Quindi utilizzare i pulsanti predefiniti per immettere la curva standard di controllo negativo e testare i campioni. Aggiungere il volume appropriato di standard di calibrazione del controllo negativo e il controllo di qualità in tubi di vetro preeticati duplicati.E aggiungere il volume appropriato di LAL al primo vile di prova. Vortice brevemente il vile e posizionare il flaconcino nelle fessure di prova appropriate nel carosello dello strumento. Prima di caricare i campioni, eseguire diverse diluizioni del nano materiale di prova entro la massima diluizione valida come dimostrato.Per preparare un'unità di 05 endotossine per millilitro di controllo del miglioramento dell'inibizione, combinare 25 microlitri dell'unità di endotossina per millilitro della soluzione endotossina standard di controllo, con 475 microlitri del nano materiale in esame a una data diluizione. Dopo il vortice, caricare gli opportuni controlli di miglioramento dell'innovazione e i campioni di studio non spirati nello strumento. Quindi aliquota non spirata e i nano materiali chiodati ad una diluizione specifica in tubi preeticati.Prima di vortice e caricamento nel carosello dello strumento. Per eseguire un Gel-Clot LAL, preparare l'endotossina standard di controllo a una concentrazione finale di quattro lambda e combinare 100 microlitri di serie, con 100 microlitri d'acqua, o campione di prova per ottenere una concentrazione finale di endotossine standard di controllo due lambda. Aggiungere 100 microlitri di Lysine ad ogni diluizione lambda.Vortice brevemente i tubi e posizionare il rack di tubi in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per un'ora. Alla fine dell'incubazione, invertire i tubi con un movimento liscio e registrare manualmente i risultati utilizzando più per un coagulo fermo e meno per nessun coagulo o un coagulo sciolto. In questa analisi rappresentativa, la doxorubicina liposomiale PEGylated interferì con la LAL cromogenica alla diluizione cinque, tuttavia questa interferenza fu superata a diluizioni più elevate.Il recupero dei picchi è stato compreso tra il 50 e il 200% quando la formulazione è stata testata a diluizioni 50 e 500 nella TORBIDITÀ e nel LAL cromogenico, nonché alla diluizione cinque, nel LAL torbidità. Se regolati dal fattore di diluizione, i risultati erano coerenti tra le delusioni in entrambi i saggi. Inoltre, i risultati sono stati coerenti tra i tre formati di saggio.Ricorda che ogni campione ha la sua gamma di diluizioni, ogni formato LAL utilizza il suo standard di controllo nella doxin e nel lisato, e che i tubi utilizzati per preparare le diluizioni e per eseguire una reazione diversa per ogni saggio LAL. Per questa procedura altri metodi come Può essere eseguito per rispondere a domande aggiuntive sul materiale Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada alle suture e al campo della nano medicina, per esplorare le applicazioni mediche dei farmaci formulati dalla nanotecnologia negli esseri umani e modelli clinici tra cui, a titolo usare la soluzione ma non, primati, conigli, cani e ratti non umani. Non dimenticare che lavorare con doxin può essere estremamente pericoloso e le precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Sviluppo di ovaio di criceto cinese-dosaggi delle proteine ​​della cellula ospite con la tecnologia Acoustic microparticelle di membrana

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Ricerca

Bioingegneria

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi Gliding

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Ricostruzioni anatomiche del sistema umano venoso cardiaco utilizzando Contrasto-tomografia computerizzata di campioni di perfusione-fissi

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...