Name: detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00
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調査は国立がん研究所から連邦政府の資金によってサポートされた国立衛生研究所、契約 HHSN261200800001E の下で。この文書のコンテンツ ビューまたは政策の保健社会福祉省、必ずしも反映しないも言及されている商号、商品、または組織は、米国政府によって裏書を意味します。

1. ナノ粒子サンプルの準備
<ol><li>ラルの研究サンプルのグレードの水を準備します。</li>
	<li>サンプルの pH は、6-8 の範囲外は、パイロジェン フリー水酸化ナトリウムや塩酸を用いて pH を調整します。</li>
	<li>ラルを使用してグレード水は研究サンプルのいくつかの希釈液を準備します。最高の希釈が最大有効希釈 (MVD) を超えていないことを確認します。MVD 推定の詳細についての議論を参?...

<ol>
	<li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses.">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li><li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans:+an+overview.">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll+receptors,+CD14,+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS.">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li><li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Endotoxins Test. , (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).</li><li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+70+years+of+pyrogen+detection:+Current+state+and+future+perspectives.">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li><li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection.">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li><li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms:+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+(LAL).">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li><li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples.">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li><li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test.">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li><li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs:+Challenges,+considerations+and+strategy.">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations.">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation.">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations.">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li><li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System.">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li><li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry.">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li><li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry.">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li><li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin:+evaluation+of+different+test+methods.">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).</li><li>. NCL assay cascade Available from: <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015)</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity.">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li><li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices:+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test.">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li><li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+pyrogenicity+testing:+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+(MAT).">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li><li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines.">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxil(R)--the+first+FDA-approved+nano-drug:+lessons+learned.">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays.">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).</li><li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent:+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking.">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li><li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition.">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles.">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+(lipopolysaccharide)+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles,+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation.">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li></ol>

このプロトコルで提供される情報は15,26の前に記述され、米国食品医薬品局 (US FDA または FDA) や米国薬局方 (USP)4刊規制のいくつかの文書に依存しています。,5,6,27、プロトコル STE1.2 (濁度ラル)、STE1.3 (ゲル血栓ラル) の NCL のウェブサイト20<...

エンドトキシンは、グラム陰性細菌の細胞壁1,2の建物ブロックです。それは非常に免疫細胞をアクティブにすることができます (picogram) 濃度1,2を低します。発熱、低血圧、高血圧、多臓器不全を含むより深刻な健康上の問題のため、エンドトキシンに応答細胞によって生成される炎症性メディエーター (サイトカイン、ロイコトリエン、エイコサノイド等)は、します。1,2,3.、免疫介在性の副作用のエンドトキシンによって引き起こされる重大度エンドトキシンの組成と構造によって決定され、国際エンドトキシン単位 (IUs または EUs)3単位、その効力に依存します。体重の 1 キログラムあたりこれらの単位数を使用して、しきい値発熱性エンドトキシン投与量を設定します。この線量は、医薬品 5 EU/kg 投与による髄腔内のルートがすべてのルートです。髄腔内投与によるルートの製品、放射性医薬品、眼内液ボディ表面の平方メートル当たり投与薬がある 100 EU/m2、0.2 EU/mL、175 EU/V は、異なるしきい値の発熱量 (V は、管理するためのもの製品の容積)、および 0.2 EU/kg、それぞれ4。さまざまな医薬品やデバイス、発熱性しきい値線量の詳細については提供され、他の場所で説明した4,5,6。
動物は、エンドトキシン反応への感度が大きく異なります。人間、非ひと霊長類、ウサギ、大原3に最も敏感の種。患者におけるエンドトキシンを介した副作用を回避し、非臨床毒性評価と有効性の研究の不正確な結論を防ぐため、正確に検出し、両方の臨床および前臨床グレードの製剤でエンドトキシンを定量化することが不可欠です。現在利用可能ないくつかのメソッドは、このタスクを実現できます。それらの 1 つは、カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金、広く世界中潜在的なエンドトキシン汚染だけでなく細菌感染症7,8,9を検出するため画面バイオメディカル製品に使われています。ライセートは amoebocytes から作製した、カブトガニカブトガニ ポリュフェモスの血液に存在するセル7北アメリカ大陸の東海岸に存在します。興味深いことに、いくつかの異なる種のカブトガニがある (日本のマガキとカブトガニ)アジア10で。日本リムラス ライセート (TAL) は、アジア数カ国でその他に関する史的10で、ラルを使用する方法と同様のエンドトキシンの検出に使用されます。(タル ・ ラル) 溶解液には、活性化プロテアーゼ活性を付与する蛋白質のグループが含まれています。これらの蛋白質、いわゆる係数 C の 1 つは、エンドトキシンとの接触時にアクティブになります。活性化因子 C 切断係数 B は、順番にも、プロテアーゼとなり凝固酵素を生産するプロ凝固酵素を裂きます。この反応の連鎖の結果はサンプル濁度と、発色基質ゲル血栓、濁度、および発色アッセイのための基盤として、色の製品の外観の存在下で増加、ゲルの形成それぞれ。米国食品医薬品局 (FDA) のガイダンスで説明必須のラール形式はありません、ゲル血栓分析5 に基づいて業界ドキュメント、ラルの異なるフォーマット間のテストの結果に相違がある場合決定が行われます.
一般的に使用される多くの研究所化学薬品 (e.g。、EDTA) 製品 (例えば、ペニシリン) がラールを妨げる知られていた薬剤の試金の11と。干渉は、通常試験材料を含む溶液に濃度既知のスパイク エンドトキシン標準のリカバリを評価することによって識別されます。スパイクの回復が 50% 未満、または 200% 以上、ラルの結果分析の場合特定のテスト材料が阻害や促進、それぞれ4のため正しくありません。ナノテクノロジーに基づく製剤は、しばしば複雑、メカニズム12,13,14のさまざまなラルを妨げます。干渉を克服するために多くの方法を記載されている: サンプル溶解特定のバッファーと界面活性剤で加熱し、加熱し、過剰なサンプルを補うことによって脂質中空材の破壊タンパク質不活性化二価陽イオン5,12,13,14,15。ラル干渉を克服することができない場合の代替方法も記載されている: ELISA、HEK TLR4 レポーター細胞ライン試金および質量16,17,18, 19。
ここで、ゲル血栓、濁度、および発色のラール アッセイを実施の実験プロシージャを示します。これらの試金はプロトコル STE1.2 (濁度ラル)、STE1.3 (ゲル血栓ラル) ナノテクノロジー キャラクタリゼーション ラボ (NCL) ウェブサイト20利用頂けますと STE1.4 (発色ラル)。同じナノ処方を特徴付けるために少なくとも 2 つの異なる形式を実施することをお勧めします。濁度と発色のラルの結果に反対、ゲル血栓結果は5が考慮されます。ラルの 2 つの形式の結果が一致しない場合ラルを確認する単球活性化テスト (マット) またはウサギ発熱性物質試験 (RPT) を用いた研究の結果、その他は21を実施しました。エンドトキシン検出の各メソッドを使用し、pyrogenicity 評価、利点と制限21,22,23,24に注意することが重要です。指定されたナノテクノロジーの定式化を特徴付けるために使用プロシージャの制限を認識しそのナノ定式化に最適のプロシージャの使用のための科学的根拠を得るために不可欠です。
本研究では、ペグ化リポソーム封入ドキソルビシンはモデル ナノ粒子製剤として使用されました。この定式化を 1995 年に米国 FDA に承認されており、癌患者世界25の治療に使用します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Turbidity LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>T0051</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity assay only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogenic LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrochrome LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>CG1500-5</td>
			<td>This reagent is specific to the Chromogenic Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>EC010</td>
			<td>This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-Clot LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>G5003</td>
			<td>This reagent is specific to the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TS050</td>
			<td>These tubes are for use with the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays

グラム陰性細菌の細胞壁コンポーネント内毒素 (リポ多糖とも呼ばれます) は、炎症、発熱、低刺激や高血圧を引き起こすことができ、極端な場合、可能性があります組織・臓器の損傷につながることができます医薬品に存在、する場合致命的になります。したがって、医薬品中のエンドトキシン量は規制厳しく。エンドトキシンの検出と定量に使用できる方法の中でカブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金、世界中に使用されます。一方、医薬品は、ラール アッセイに干渉できる、ナノ処方はその複雑さのための特定の挑戦を表しています。本稿の目的は、ナノ、ナノ粒子配合薬で大原の推定に経験の浅い研究者に実用的なガイドを提供することです。ここで、濁度、発色性を含む 3 つのラール形式やゲル血栓アッセイを行うため実用的な推奨事項を説明します。これらのアッセイは、ナノテクノロジーに基づく医薬品、ワクチン、アジュバントのエンドトキシン汚染を決定する使用できます。

ラルの試金でこの定式化をテストした後に生成されるデータの例は表 1に示します。希釈 5 で発色のラルとペグ化リポソーム封入ドキソルビシンの干渉。ただし、この干渉は、大きい希薄によって克服されました。この製剤は希釈 50 と濁度と発色ラル、500 および濁度ラルで希釈 5 テストされたとき、スパイク回復は 50 と 200% の間だった。希釈倍率によっ...

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Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

ナノのエンドトキシンの検出は、ナノメディシン分野の難問の 1 つを表します。ナノ粒子の潜在的なエンドトキシン汚染を推定する 3 種類のラール フォーマットで構成されるフレームワークを説明する事例を紹介します。

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

この方法は、ナノ医薬品の安全性に関する医療分野での回答に役立ちます。この技術の利点は、それが標準であり、製品の評価のために世界的に使用されている、ナノ医薬品に。この手順のデモンストレーションは、ナノテクノロジー特性評価ラボのバリー・ネウンです。キャリブレーション標準調製には、900マイクロリットルのリムルス・アメボサイト・ライセートまたはLAL等級水を使用してください。100マイクロリットルの対照標準のendotoxinを、必要に応じて多くの中間希釈液を調製し、ミリリットル当たり1個の内毒素単位の濃度を有する校正規格の調製を可能とする。次に、900マイクロリットルのLAL等級水を使用し、1ミリリットルキャリブレーション基準あたり1つの内毒素単位の100マイクロリットルを使用して、ミリリットル当たり0.1の内毒素単位の濃度で、第2の校正基準を調製する。次に、シリアル10倍希釈を繰り返して、2つの低いキャリブレーション基準を準備します。0001から1ミリリットル当たり1個の内毒素単位までの範囲の合計4つの校正基準を得た。ミリリットル品質管理あたり05内毒素単位を調製するために、コントロール標準のエンドトキシン溶液のミリリットル当たりの1つの内毒素単位の50マイクロリットルを、950マイクロリットルのLAL等級水と組み合わせます。ソフトウェアの次の設定を選択し、テンプレートを作成します。[データの収集] を選択し、[一般] タブにテスト ID とデータ グループを入力します。ハードウェアタブで、計測器の種類と LAL 方式を選択し、シリアル番号、システム ID、およびシリアル ポート情報が画面に表示されることを確認します。[大丈夫]を2回クリックして、機器の選択と計測器との通信を確認し、サンプルをテストする順序と同じ順序でサンプルIDを入力します。次に、デフォルトのボタンを使用して、負の制御標準曲線とテストサンプルを入力します。適切な量の負の制御校正基準を追加し、品質管理を重複した事前ラベル付きガラス管に追加します。そして、最初のテストの下品にLALの適切な量を追加します。短い間に下品を渦し、バイアルを計器カルーセルの適切なテストスロットに入れる。サンプルをロードする前に、実証したように、テストナノ材料の希釈を最大有効希釈内で行います。05 エンドトキシン単位を 1 ミリリットルの阻害増強制御を調製するには、対照標準エンドトキシン溶液のミリリットル当たり 1 つのエンドトキシン単位の 25 マイクロリットルを、所定の希釈時に 475 マイクロリットルの試験ナノ材料と組み合わせます。ボルテックスの後、適切なイノベーションエンハンスメントコントロールと、スパイクされていないスタディサンプルを機器にロードします。その後、アリコートアンスパイクとスパイクナノ材料は、事前に標識されたチューブに特定の希釈で。渦を起たし、計器カルーセルにロードする前に。ゲルクロットLALを実行するには、制御標準の内毒素を4つのラムダの最終濃度に調製し、100マイクロリットルの標準を100マイクロリットルの水と組み合わせるか、サンプルをテストして対照標準のエンドトキシン2つのラムダの最終濃度を達成する。各ラムダ希釈液にリジンの100マイクロリットルを加えます。チューブを短時間渦に入れ、チューブのラックを摂氏37度の水浴に1時間置きます。インキュベーションの最後に、滑らかな動きでチューブを反転し、固い血栓のプラス、血栓なし、または緩い血栓の場合はマイナスを使用して結果を手動で記録します。この代表的な分析では、PEGylateedリポソームドキソルビシンは希釈5で発癌性LALを妨害したが、この干渉は高い希釈で克服された。スパイク回収は、濁度および発色性LALにおける希釈50および500、ならびに希釈5において、濁度LALにおいて製剤が試験された場合に50〜200%であった。希釈係数によって調整した場合、結果は両方のエッセイにおける妄想間で一貫していた。さらに、結果は3つのエッセイ形式の間で一貫していました。各サンプルには独自の希釈液の範囲があり、各LALフォーマットはドキシンおよびライセートの制御標準を使用し、希釈液を調製するために使用される管を使用し、各LALエッセイごとに異なる反応を行うことを覚えておいてください。この手順では、材料に関する追加の質問に答えるために行うことができるような他の方法は、その開発後、この技術は、縫合糸およびナノ医学の分野への道を開き、ヒトにおけるナノ技術製剤の医療応用を探求し、非ヒト霊長類、ウサギ、犬、ラットを含むがこれらに限定されない臨床モデルを示した。ドキシンで作業することは非常に危険であり、個人的な保護具を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

アコースティック膜の微粒子技術を使用してカスタムチャイニーズハムスター卵巣-宿主細胞タンパク質のアッセイを開発する

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

核酸、タンパク質と低分子のReagentless検出用電気化学DNAバイオセンサーの作製

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

光音響流量測定法を用いて循環メラノーマ細胞の検出と分離

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

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灌流固定標本のコントラストコンピュータ断層撮影を用いた人間の心臓静脈系の解剖学的再建

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

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Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

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再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

光ファイバを用いて、液滴マイクロフルイディクスのための多色蛍光検出

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

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