Name: detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

연구는 국립 암 연구소에서 연방 기금에 의해 지원 되었다 건강의 국가 학회, HHSN261200800001E 계약. 이 발행물의 콘텐츠 뷰 또는 정책의는 부의 보건 및 인적 서비스, 반드시 반영 하지 않습니다도 무역 이름, 상용 제품의 언급지 않습니다 또는 조직 미국 정부에 의해 승인을 의미 합니다.

1입니다. 나노 샘플의 준비
<ol><li>준비 랄에 연구 샘플 학년 물.</li>
	<li>샘플 pH 범위를 6-8 인 경우에, pyrogen 무료 수산화 나트륨 또는 염 산을 사용 하 여 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>랄을 사용 하 여 학년 물 연구 샘플의 여러 희석을 준비 합니다. 높은 희석은 최대 유효 희석 (MVD)를 초과 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. MVD 추정에 대 한 자세한 토론 섹션을 참조 하십시오.</li>
</ol><p class="jove_title"...

<ol>
	<li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses.">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li><li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans:+an+overview.">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll+receptors,+CD14,+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS.">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li><li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Endotoxins Test. , (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).</li><li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+70+years+of+pyrogen+detection:+Current+state+and+future+perspectives.">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li><li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection.">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li><li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms:+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+(LAL).">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li><li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples.">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li><li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test.">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li><li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs:+Challenges,+considerations+and+strategy.">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations.">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation.">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations.">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li><li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System.">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li><li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry.">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li><li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry.">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li><li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin:+evaluation+of+different+test+methods.">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).</li><li>. NCL assay cascade Available from: <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015)</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity.">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li><li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices:+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test.">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li><li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+pyrogenicity+testing:+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+(MAT).">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li><li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines.">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxil(R)--the+first+FDA-approved+nano-drug:+lessons+learned.">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays.">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).</li><li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent:+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking.">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li><li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition.">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles.">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+(lipopolysaccharide)+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles,+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation.">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li></ol>

이 프로토콜에서 제공 하는 정보15,26 전에 설명 하고있다 고는 미국 식품 의약품 안전 청은 미국 식약청 (FDA) 및 미국 약전 (USP)4 에 의해 게시 된 여러 규제 문서 , 5 , 6 , 27, 그리고 또한 NCL 웹사이트20 프로토콜 STE1.2 (탁도 랄), STE1.3 (젤 응고...

내 그람 음성 세균 세포 벽1,2의 빌딩 블록 이다. 그것은 매우에 면역 세포를 활성화할 수 있습니다 (picogram) 농도1,2낮은. 셀 한도에 대 한 응답에 의해 생성 된 proinflammatory 중재자 (cytokines, leukotrienes, eicosanoids, 등) 발열, 저 혈압, 고혈압, 그리고 여러 기관 실패를 포함 하 여 더 심각한 건강 문제에 대 한 책임은 1 , 2 , 3. 면역 중재 측면-효과도 의해 실행의 심각도 내 구성과 구조에 의해 결정 고도 국제 단위 (IUs 또는 EUs)3에서 측정 된 힘에 따라 달라 집니다. 이러한 단위 몸 무게의 킬로그램 당 수는 내 화성 복용량을 임계값을 설정 하는 데 사용 됩니다. 이 복용량은 EU/5kg 약 제품에 대 한 관리 를 통해 intrathecal 경로 하지만 모든 노선. 몸 표면, 안구 내부 체액, 방사성 의약품, 및 intrathecal 경로 관리 를 통해 제품의 평방 미터 당 약을 복용 하는 약 있다 다른 임계값 화성 복용량은 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V (V가는 볼륨 관리를 위한 제품의), 그리고 0.2 EU/kg, 각각4. 다양 한 약품 및 장치에 대 한 임계값 화성 복용량에 대 한 자세한 내용은 제공 되 고 다른4,,56논의.
동물도 중재 반응에 그들의 감도에서 넓게 변화 한다. 인간, 비 인간 영장류, 그리고 토끼 독3가장 매우 민감한 종족 중입니다. 환자에도 중재 부작용을 피하기 위해 고의 전 임상 독성 및 효능 연구의 부정확 한 결론을 방지, 정확 하 게 감지 하 고 두 임상 및 전 임상 등급 정립에서 독을 계량 필수적 이다. 현재 사용할 수 있는 여러 가지 방법을이 작업을 달성할 수 있다. 그들 중 하나는 일반적으로 화면 생물 의학 제품에 잠재적인 내 오염 뿐만 아니라 세균 감염7,,89감지로 세계 전반 사용 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 이다. 셀 말굽 게 Limulus polyphemus 의 혈액에 존재 하는 lysate amoebocytes에서 준비 북미7대륙의 동쪽 해 안에 거주. 흥미롭게도, 말굽 게의 몇 가지 다른 종이 있다 (Tachypleus gigas 및 Tachypleus tridentatus) 아시아10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (탈)도 다른 cuntries10에 랄을 사용 하는 방법을 유사한의 검출에 대 한 여러 아시아 국가에서 사용 됩니다. (랄 및 탈) lysates 포함 단백질 활성화 시 부여 하는 프로 테아 제 활동의 그룹. 이러한 단백질, 소위 요소 C 중 하나 내와 접촉 시 활성화 됩니다. 활성화 인자 C 앞 요소 B는 또한 차례 차례로 되는 효소 응고 효소를 생산 하는 프로 응고 효소를 앞. 반응의이 체인의 결과 젤, 샘플 탁도 하 고, 비 기질, 젤 응고, 탁도, 그리고 비 분석 실험을 위한 기초 역할을, 착 색된 제품의 외관의 존재 증가의 형성 각각. 산업 문서, 다른 랄 포맷 간의 테스트 결과에 주문서, 결정은 한다 젤 응고 분석 결과5 기반은 필수 랄 형식이, 미국 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)에 대 한 지침에 설명 합니다. .
일반적으로 사용 되는 많은 실험실 화학 물질 (예., EDTA) 및 제품 (예: 페니실린) 방해 랄 알려진된 마약 분석 실험11. 방해는 일반적으로 테스트 자료를 포함 하는 솔루션으로 알려진된 농도에 아군도 표준의 복구를 평가 하 여 식별 됩니다. 스파이크 복구 50% 미만 또는 200% 이상에 대 한 분석 결과 LAL의 결과 다음 경우 주어진된 시험 체 억제 또는 향상, 각각4유효 하지 않습니다. 나노기술 기반 정립은 종종 복잡 하 고 메커니즘12,,1314의 다양 한 통해 랄을 방해. 많은 접근 방해를 극복 하기 위해 설명 되었습니다: 난방, 난방 및 과잉을 가진 샘플을 보완 하 여 지질 기반 투명 재료의 파괴에 의해 단백질 비활성화 특정 버퍼에 계면 활성 제, 샘플 재구성 divalent 양이온5,12,13,,1415. LAL 방해를 극복할 수 없을 때 상황에 대 한 대체 방법을 또한 설명 되었습니다: ELISA, HEK TLR4 기자 셀 라인 분석 결과, 및 질량 분석16,,1718, 19.
여기, 젤 응고, 탁도, 및 비 랄 분석 실험 수행에 대 한 실험 절차에 설명 되어 있습니다. 이 분석 실험 프로토콜 STE1.2 (탁도 랄), STE1.3 (젤 응고 랄)에 나노기술 특성화 연구소 (NCL) 웹사이트20 에서 사용할 수 있습니다 및 STE1.4 (비 랄). 같은 나노 제제의 특성을 두 개 이상 다른 포맷을 수행 하는 것이 좋습니다. 탁도 및 비 랄의 결과 동의 하지 않을 때 젤 응고 결과5를간주 됩니다. 두 랄 형식의 결과 동의 하는 경우21랄 확인 monocyte 활성화 테스트 (매트) 또는 토끼 pyrogen 테스트 (RPT)을 사용 하 여 연구 결과 추가 실시. 각 방법도 검색에 사용 되 고 pyrogenicity 평가 장점과 한계21,,2223,24에 중요 하다. 주어진된 나노기술 정립 하는 데 사용 하는 프로시저의 한계를 인식 그 나노 제제에 대 한 최적의 절차의 사용에 대 한 과학적 정당성을 얻기 위해 필수적 이다.
이 연구에서는 PEGylated 자주 독 소 루비 모델 나노 배합으로 사용 되었다. 이 1995 년에 미국 FDA에 의해 승인 하 고 암 환자 전세계25치료를 위해 사용.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Turbidity LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>T0051</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity assay only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogenic LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrochrome LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>CG1500-5</td>
			<td>This reagent is specific to the Chromogenic Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>EC010</td>
			<td>This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-Clot LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>G5003</td>
			<td>This reagent is specific to the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TS050</td>
			<td>These tubes are for use with the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays

제약 제품에 존재 하는 경우 (종종 라고도 lipopolysaccharide) 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소 내 염증, 발열, 저자 또는 고혈압, 발생할 수 있습니다. 그리고, 극단적인 경우에 수 있습니다. 조직 및 장기 손상으로 이어질 수 있습니다. 치명적 된다. 따라서, 제약 제품에도의 양은 엄격 하 게 통제 된다. 도 탐지 및 정량화에 대 한 사용할 수 있는 방법, 중 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 주로 세계적으로 사용 됩니다. 어떤 제약 제품 랄 분석 결과 방해할 수 있습니다, 하는 동안 나노-공식 그들의 복잡으로 인해 특정 도전을 나타냅니다. 이 문서의 목적은 연구 설계 나노 소재 및 나노 공식화 약물 독 추정에 미숙한 실용적인 가이드를 제공 하. 여기, 탁도, 발을 포함 한 세 랄 포맷 응고 젤 분석 실험을 수행 하기 위한 실질적인 권장 사항은 설명 합니다. 이 분석 실험 나노기술 기반 약물 제품, 백신, 그리고 adjuvants 내 오염 확인을 사용할 수 있습니다.

LAL 분석 실험에서이 테스트 한 후 생성 된 데이터의 예는 표 1에 표시 됩니다. PEGylated 자주 독 소 루비 5 희석에서 비 랄와 방해. 그러나,이 간섭 큰 희석에 의해 극복 됐다. 50과 200% 사이 스파이크 복구 때이 희석 탁 랄에에서 5에서 뿐만 아니라 희석 50 및 탁도 및 비 랄, 500에서 테스트 되었습니다. 희석 비율 조정, 결과 두 분석 실험에 희석 사이 일관 했다. 또한...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

조작된 nanomaterials에 독의 검출 nanomedicine 분야에서 대상 과제 중 하나를 나타냅니다. 여기, 우리는 나노 입자에서 잠재적인 내 오염 추정 세 가지 다른 랄 형식으로 구성 된 프레임 워크를 설명 하는 사례 연구를 제시.

나노 제형에도 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 실험을 사용 하 여

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

이 방법은 나노 의약품의 안전에 대한 의료 분야에서 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 표준이며, 나노 의약품에 제품의 평가를 위해 전 세계적으로 사용된다는 것입니다. 절차의 데모, 배리 Neun 될 것입니다, 나노 기술 특성화 연구소에서.교정 표준 준비를 위해 리무저 아메보시테 용액 또는 LAL 급수 의 900 마이크로 리터를 사용하십시오. 그리고 100 마이크로리터의 제어 표준 내독소, 필요에 따라 많은 중간 희석제를 제조하고, 밀리리터당 하나의 내독소 단위의 농도로 교정 표준의 준비를 가능하게 한다. 그런 다음 LAL 급수 900 마이크로리터와 밀리리터 교정 표준당 하나의 내독소 단위의 100 마이크로리터를 사용하여 밀리리터당 0.1 엔도독신 단위의 농도로 두 번째 교정 표준을 준비한다.그런 다음 두 개의 낮은 교정 표준을 준비하기 위해 직렬 열배도 희석을 반복합니다. 밀리리터당 0001에서 1개의 내독소 단위에 이르기까지 총 4개의 교정 표준을 얻으려면. 밀리리터 품질 관리당 05 엔도독신 유닛을 준비하기 위해, 제어 표준 엔도독신 용액의 밀리리터 당 하나의 엔도독소 유닛 의 50 마이크로리터와 LAL 급 수의 950 마이크로리터를 결합합니다.다음으로 소프트웨어에서 계측기 설정을 선택하고 템플릿을 만듭니다. 데이터 수집을 선택하고 일반 탭에서 테스트 ID 및 데이터 그룹을 입력합니다. 하드웨어 탭에서 계측기 유형 및 LAL 메서드를 선택하고 일련 번호, 시스템 ID 및 직렬 포트 정보가 화면에 나타나는지 확인합니다.기기 선택 및 계측기와의 통신을 확인하기 위해 두 번 확인을 클릭하고 샘플 ID를 테스트하는 것과 동일한 순서로 샘플 ID를 입력합니다. 그런 다음 기본 단추를 사용하여 음수 제어 표준 곡선을 입력하고 샘플을 테스트합니다. 음의 제어 교정 표준의 적절한 볼륨을 추가하고 품질 관리를 중복 사전 표지 유리 튜브에 추가합니다.그리고 첫 번째 테스트 사악한에 LAL의 적절한 볼륨을 추가합니다. 사악한 것을 간략하게 소용돌이치게 하고, 유리병을 악기 회전 목마의 적절한 테스트 슬롯에 넣습니다. 시료를 적재하기 전에 입증된 바와 같이 최대 유효 희석 내에서 테스트 나노 물질의 여러 희석을 수행합니다.억제 강화 제어의 밀리리터 당 05 엔도독신 유닛을 제조하려면, 주어진 희석에서 테스트 나노 물질의 475 마이크로리터와 대조표준 엔도독신 용액의 밀리리터 당 하나의 엔도독소 단위의 25 마이크로리터를 결합한다. 소용돌이 후 적절한 혁신 향상 컨트롤과 비스파이크 스터디 샘플을 계측기에 적재합니다. 그런 다음 알리쿼트 가시가 없는 나노 물질을 특정 희석에서 미리 표지된 튜브로 분리합니다.소용돌이하기 전에 계측기 회전 목마에 적재하십시오. Gel-Clot LAL을 수행하기 위해 제어 표준 내독소를 4개의 람다의 최종 농도로 준비하고 100마이크로리터의 물 또는 테스트 샘플을 결합하여 제어 표준 내독신 2개의 람다의 최종 농도를 달성한다. 각 람다 희석에 100 마이크로리터의 리신을 추가합니다.튜브를 잠시 소용돌이쳐 튜브 랙을 섭씨 37도의 수조에 1시간 동안 넣습니다. 인큐베이션의 끝에서, 부드러운 움직임으로 튜브를 반전하고, 수동으로 단단한 응고에 대한 플러스를 사용하여 결과를 기록하고, 응고, 또는 느슨한 응고에 대한 마이너스. 본 대표적인 분석에서, PEGylated 리포소루비신은 희석 5에서 염색체 LAL을 방해했지만, 그러나 이 간섭은 더 높은 희석에서 극복되었다.스파이크 회수는 식도 및 염색체 LAL에서 50 및 500의 희석성 및 희석 5에서, 그리고 탁도 LAL에서 제형이 시험되었을 때 50과 200% 사이였다. 희석 계수에 의해 조정될 때, 결과는 두 에세이의 망상 사이에서 일치했습니다. 또한, 결과는 세 가지 에세이 형식 사이에 일치했다.각 샘플에는 자체 희석 범위가 있으며, 각 LAL 형식은 독신및 용해에서 제어 표준을 사용하고, 희석을 준비하고 각 LAL 에세이마다 다른 반응을 수행하는 데 사용되는 튜브를 사용한다는 것을 기억하십시오. 이 절차의 경우 그 개발 후 물질에 대한 추가 질문에 답하기 위해 수행 될 수 있으며,이 기술은 인간에서 제조 된 나노 기술의 의료 응용 프로그램을 탐구하고, 비 인간 영장류, 토끼, 개 및 쥐를 포함하되 이에 국한되지 않는 임상 모델을 모색하기 위해 봉합사 및 나노 의학 분야에 대한 길을 열어주었습니다. 독신을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

어쿠스틱 막 Microparticle 기술을 사용하여 개발 사용자 지정 중국어 햄스터 난소 - 숙주 세포의 단백질 Assays

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

연구

생체공학

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

핵산, 단백질과 작은 분자의 Reagentless 감지를위한 전기 -의 DNA Biosensors의 제작

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Photoacoustic Flowmetry를 사용하여 순환 흑색증 전지의 탐지 및 격리

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

글라이딩 Assays를 사용 Biopolymers의 굽힘 강성 측정

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

콘트라스트 계산하기 관류 고정 시편의 단층 촬영을 이용하여 인간의 심장 정맥 시스템의 해부학 적 재건

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

상상 속의 세포 부착 분자의 특성에 대한 비드 집계 분석 실험

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Microtoroid 광 공진기를 사용하여 라벨이없는 단일 분자 검출

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...