Name: detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Studien ble støttet av føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, kontrakt HHSN261200800001E. Innholdet i denne publikasjonen reflekterer ikke nødvendigvis synspunkter eller politikken av Department of Health and Human Services, eller nevner av varenavn, kommersielle produkter, eller organisasjoner endossering av den amerikanske regjeringen.

1. forberedelse av hydrogenion prøver
<ol><li>Forberede studie eksemplet i LAL klasse vann.</li>
	<li>Hvis prøven pH er utenfor 6-8, justere pH ved hjelp pyrogen-fri natriumhydroksid eller saltsyre.</li>
	<li>Bruke LAL klasse vann forberede flere fortynninger av studien prøven. Kontroller at høyeste fortynning ikke overstiger maksimal gyldig fortynning (MVD). Se drøftingen for detaljer om MVD estimering.</li>
</ol>2. forberedelse av reagenser felles mellom LAL formater
<ol><li>Fortynne ko...

<ol>
	<li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses.">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li><li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans:+an+overview.">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll+receptors,+CD14,+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS.">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li><li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Endotoxins Test. , (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).</li><li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+70+years+of+pyrogen+detection:+Current+state+and+future+perspectives.">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li><li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection.">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li><li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms:+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+(LAL).">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li><li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples.">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li><li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test.">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li><li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs:+Challenges,+considerations+and+strategy.">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations.">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation.">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations.">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li><li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System.">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li><li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry.">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li><li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry.">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li><li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin:+evaluation+of+different+test+methods.">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).</li><li>. NCL assay cascade Available from: <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015)</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity.">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li><li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices:+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test.">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li><li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+pyrogenicity+testing:+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+(MAT).">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li><li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines.">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxil(R)--the+first+FDA-approved+nano-drug:+lessons+learned.">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays.">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).</li><li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent:+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking.">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li><li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition.">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles.">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+(lipopolysaccharide)+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles,+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation.">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li></ol>

Informasjonen i denne protokollen har blitt beskrevet før15,26 og bruker flere lovpålagte dokumenter publisert av US Food, Drug Administration (oss FDA eller FDA) og USA farmakopé (USP)4 , 5 , 6 , 27, og er også tilgjengelig på NCL nettsted20 i protokoller STE1.2 (turbiditet LAL), STE1.3 (gel-blodpropp LAL) ...

En endotoxin er en av Gram-negative bakteriell cellevegg1,2. Det kan aktivere immunceller i svært lav (hører) konsentrasjoner1,2. Proinflammatory meglere (cytokiner, leukotrienes, eicosanoids, etc.) produsert av cellene som svar på en endotoxin er ansvarlig for feber, hypotensjon, hypertensjon og mer alvorlige helseproblemer, inkludert flere organsvikt 1 , 2 , 3. alvorlighetsgraden av immun-mediert bivirkninger utløst av endotoxin avhenger av sin styrke etter endotoxin sammensetning og struktur og målt i internasjonale endotoxin enheter (IUs eller EUs)3. Antall disse enheter per kilo kroppsvekt brukes til å angi en terskel pyrogenic dose endotoxin. Denne dosen er 5 EU/kg for legemidler administreres via alle ruter men intratekal ruten. Narkotika dosert per kvadratmeter av kroppsdeler, intraokulært væsker, radiopharmaceuticals og produkter administreres via intratekal ruten har en annen terskelen pyrogenic dose, som er 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (hvor V er den volumet av produktet beregnet på administrasjon), og 0,2 EU/kg, henholdsvis4. Mer informasjon om terskelen pyrogenic dosen for ulike legemidler og enheter tilbys og diskutert annetsteds4,5,6.
Dyr varierer mye i deres følsomhet for endotoxin-medierte reaksjoner. Mennesker og ikke-menneskelige primater kaniner er blant artene mest følsomme endotoxins3. For å unngå endotoxin-mediert bivirkninger hos pasienter og hindre feil konklusjoner av prekliniske toksisitet og effekt studier, er det viktig å nøyaktig oppdage og kvantifisere endotoxins i både kliniske og pre-klinisk klasse formuleringer. Flere tilgjengelige metoder kan oppnå denne oppgaven. En av dem er Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analysen, som er vanlig brukt verden over skjermen biomedisinsk produkter potensielle endotoxin forurensning også å oppdage bakterieinfeksjoner7,8,9. Den lysate er forberedt fra amoebocytes, cellene presenterer i blodet av hestesko krabbe Limulus Polyfemos bosatt i den østlige bredden av kontinentet i Nord-Amerika7. Interessant, det er noen forskjellige arter av hestesko krabbe (Tachypleus gigas og Tachypleus tridentatus) i Asia10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) brukes i flere asiatiske land for påvisning av endotoxin ligner på hvordan LAL brukes i andre cuntries10. Lysates (LAL og TAL) inneholder en gruppe proteiner som ved aktivering konferere protease aktivitet. En av disse proteinene, den såkalte faktoren C aktiveres ved kontakt med endotoxin. Aktivert faktor C kløyver faktor B, som også blir en protease og innstiftet en pro-clotting enzym å produsere en clotting enzym. Resultatet av denne kjeden av reaksjoner er dannelsen av en gel, en økning i prøven turbiditet og, i nærvær av et kromogent substrat utseendet på et farget produkt, som tjener som grunnlag for gel-blodpropp og turbiditet kromogent analyser, henholdsvis. Mens det er ingen obligatorisk LAL format, US Food and Drug Administration (FDA) forklarer i veiledning for basert bransje dokumentet, at i tilfelle uoverensstemmelser i testresultater mellom ulike LAL formater, vedtaket er gjort på gel-blodpropp analysen5 .
Mange brukte laboratoriekjemikaler (f.eks., EDTA) og kjente stoffet produkter (f.eks penicillin) forstyrre LAL søk11. Forstyrrelser identifiseres ved å vurdere utvinning av endotoxin standard piggete i en kjent konsentrasjon i en løsning som inneholder test materialet. Hvis spisspotensial er mindre enn 50% eller mer enn 200%, så resultatet av LAL analysen er gitt test materialet ugyldig på grunn av hemming eller ekstrautstyr, henholdsvis4. Nanoteknologi prosesseringsoperasjoner er ofte kompliserte og forstyrre LAL gjennom en rekke mekanismer12,13,14. Mange tilnærminger har blitt beskrevet for å overvinne forstyrrelser: eksempel rekonstituering i bestemte buffere og tensider, protein inaktivering av oppvarming, ødeleggelse av lipid-baserte hul materialer ved oppvarming og supplere prøven med overflødig divalent kasjoner5,12,13,14,15. Alternative metoder for situasjoner der LAL forstyrrelser ikke kan overvinne har også blitt beskrevet: ELISA, en HEK-TLR4 reporter celle linje analysen og massespektrometri16,17,18, 19.
Her, er eksperimentelle prosedyrer for å gjennomføre gel-blodpropp og turbiditet kromogent LAL analyser beskrevet. Disse analyser er også tilgjengelig på Nanoteknologi karakterisering Lab (NCL) nettsted20 i protokoller STE1.2 (turbiditet LAL), STE1.3 (gel-blodpropp LAL) og STE1.4 (kromogent LAL). Det anbefales å gjennomføre minst to forskjellige formater som betegner samme nano-utformingen. Når resultatene av turbiditet og kromogent LAL uenig, anses gel-blodpropp resultatene5. Når resultatene fra to LAL formater uenig, gjennomført ekstra studier bruker enten monocytt Aktivisering (MAT) eller kanin pyrogen testen (RPT) for å bekrefte LAL funnene er21. Det er viktig å merke seg at hver metode brukt for endotoxin påvisning og pyrogenicity vurdering har fordeler og begrensninger21,22,23,24. Erkjennelsen begrensninger av prosedyren for å karakterisere gitt nanoteknologi formulering er avgjørende for å få vitenskapelig begrunnelse for bruk av prosedyren optimalt for at nano-formulering.
I denne studien ble pegylert liposomal doksorubicin brukt som modell hydrogenion formulering. Denne formuleringen er godkjent av den amerikanske FDA i 1995 og brukt til behandling av kreft pasienter verden over25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Turbidity LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>T0051</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity assay only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogenic LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrochrome LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>CG1500-5</td>
			<td>This reagent is specific to the Chromogenic Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>EC010</td>
			<td>This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-Clot LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>G5003</td>
			<td>This reagent is specific to the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TS050</td>
			<td>These tubes are for use with the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays

Når finnes i legemidler, en Gram-negative bakteriell cellevegg komponenten endotoxin (også kalt lipopolysakkarid) kan forårsake betennelser, feber, hypo- eller høyt blodtrykk, og, i ekstreme tilfeller kan føre til vev og organ skade som kan bli fatal. Beløpene i endotoxin i legemidler, derfor er strengt regulert. Blant metodene tilgjengelig for endotoxin gjenkjenning og kvantifisering, er Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analysen vanlig over hele verden. Mens farmasøytiske produkter kan påvirke LAL analysen, representerer nano-formuleringer en spesiell utfordring på grunn av sin kompleksitet. Formålet med utredningen er å gi en praktisk guide til forskere uerfaren i estimering endotoxins foretatt nanomaterialer og hydrogenion-formulert narkotika. Praktiske anbefalinger for tre LAL formater, inkludert turbiditet, kromogent og gel-blodpropp analyser diskuteres her. Disse analyser kan brukes til å fastslå endotoxin forurensning i nanoteknologi-baserte legemidler og vaksiner adjuvans.

Eksempel data generert etter testing denne formuleringen i LAL analyser er vist i tabell 1. Pegylert liposomal doksorubicin forstyrret kromogent LAL på fortynning 5. Men ble denne innblandingen overveldet av større fortynninger. Spisspotensial ble mellom 50 og 200% når denne formuleringen ble testet på fortynninger 50 og 500 turbiditet og kromogent LAL, samt på fortynning 5 i turbiditet LAL. Når den justeres ved fortynningsfaktoren, var resultatene samsvar mellom fo...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Deteksjon av endotoxins i utvikling nanomaterialer representerer en av de store utfordringene innen nanomedicine. Her presenterer vi en studie som beskriver rammeverket består av tre ulike LAL formater å beregne potensiell endotoxin forurensning i nanopartikler.

Deteksjon av Endotoxin i Nano-formuleringer bruker Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Denne metoden kan bidra til å svare på det medisinske feltet om sikkerhet for nanomedisiner. Fordelene med denne teknikken er at den er standard, og brukes over hele verden til evaluering av produkter, Til nanomedisiner. Demonstrasjon av prosedyren, vil være Barry Neun, på Nano Technology Characterization Lab.For kalibrering standard forberedelse, bruk 900 mikroliter limulus amebocyte lysate, eller LAL klasse vann. Og 100 mikroliter kontroll standard endotoksin, for å forberede så mange mellomliggende fortynninger etter behov, for å muliggjøre fremstilling av en kalibreringsstandard med en konsentrasjon av en endotoksinenhet per milliliter. Deretter bruker 900 mikroliter lal grade vann, og 100 mikroliter av den ene endotoksin enhet per milliliter kalibrering standard, forberede en andre kalibrering standard, med en konsentrasjon på 0,1 endotoksin enhet per milliliter.Gjenta deretter den serielle tidoblet fortynning for å forberede to lavere kalibreringsstandarder. For å oppnå totalt fire kalibreringsstandarder, fra 0001 til en endotoksinenhet per milliliter. For å forberede en 05 endotoksinenhet per milliliter kvalitetskontroll, kombinerer 50 mikroliter av den ene endotoksinenheten per milliliter kontrollstandard endotoksinløsning, med 950 mikroliter LAL-grade vann.Deretter velger du instrumentinnstillingene i programvaren, og opprett malen. Velg samle inn data, og skriv inn test-ID-en og datagruppen i kategorien Generelt. Velg instrumenttypen og LAL-metoden under kategorien maskinvare, og kontroller at et serienummer, system-ID-en og den serielle portinformasjonen vises på skjermen.Klikk ok to ganger for å bekrefte instrumentvalget, og kommunikasjonen med instrumentet, og skriv inn prøve-ID-en i samme rekkefølge som prøvene skal testes. Bruk deretter standardknappene til å angi den negative kontrollstandardkurven, og teste eksempler. Legg til riktig volum av standarder for negativ kontrollkalibrering, og kvalitetskontroll i dupliserte forhåndsmerkede glassrør.Og legg til riktig volum av LAL til den første testen sjofel. Vortex den onde kort, og plasser hetteglasset i de riktige testslots i instrumentkarusellen. Før du laster prøvene, utfør flere fortynninger av testnanomaterialet innenfor maksimal gyldig fortynning som vist.For å forberede en 05 endotoksinenhet per milliliter hemmingsforbedringskontroll, kombiner 25 mikroliter av den ene endotoksinenheten per milliliter kontrollstandard endotoksinløsning, med 475 mikroliter av testnanomaterialet ved en gitt fortynning. Etter vortexing, last de riktige innovasjonsforbedringskontrollene, og de upikede studieprøvene inn i instrumentet. Deretter aliquot unspiked og piggete nano materialer på en bestemt fortynning i pre merket rør.Før vortexing, og lasting inn i instrumentkarusellen. For å utføre en Gel-Clot LAL, forberede kontroll standard endotoksin til en endelig konsentrasjon av fire lambda, og kombinere 100 mikroliter av standard, med 100 mikroliter vann, eller testprøve for å oppnå en endelig konsentrasjon av kontroll standard endotoksin to lambda. Tilsett 100 mikroliter lysin til hver lambda fortynning.Vortex rørene kort, og plasser stativet av rør i en 37 grader Celsius vannbad i en time. På slutten av inkubasjonen, inverter rørene med en jevn bevegelse, og registrer resultatene manuelt ved hjelp av pluss for en fast blodpropp, og minus for ingen blodpropp, eller en løs blodpropp. I denne representative analysen forstyrret PEGylated liposomal doksorubicin kromatogen LAL ved fortynning fem, men denne forstyrrelsen ble overvunnet ved høyere fortynninger.Spike utvinning var mellom 50 og 200%når formuleringen ble testet ved fortynninger 50 og 500 i turbiditet og kromogen LAL, samt ved fortynning fem, i turbiditet LAL. Når justert av fortynningsfaktoren var resultatene konsistente mellom vrangforestillinger i begge essayene. Videre var resultatene konsistente mellom de tre essayformatene.Husk at hver prøve har sitt eget utvalg av fortynninger, hvert LAL-format bruker sin kontrollstandard i doxin og lysate, og at rørene som brukes til å forberede fortynningene, og for å utføre en reaksjon på forskjellige for hvert LAL essay. For denne prosedyren andre metoder som Kan utføres for å svare på flere spørsmål om materiale Etter utviklingen, denne teknikken banet vei for suturer og feltet av nanomedisin, for å utforske medisinske anvendelser av nano teknologi formulert narkotika hos mennesker, og kliniske modeller inkludert, men ikke begrenset til ikke menneskelige primater, kaniner, hunder, og rotter. Ikke glem at arbeid med doxin kan være ekstremt farlig og forholdsregler som bruk av personlig verneutstyr, bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Deteksjon og Isolering av Sirkulerende Melanom Cells bruke photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriell Detection &amp; Identification hjelp elektrokjemiske sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomiske rekonstruksjoner av Human Cardiac venøse systemet ved hjelp av kontrast-computertomografi av Perfusjons-fast Prøver

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Perle aggregering Analyser for karakterisering av Antatte celleadhesjonsmolekyler

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Etikett-free enkelt molekyl Detection Bruke Microtoroid Optiske resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Bruke optiske fibre

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...