Name: detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Это исследование было поддержано федеральным фондам от национального института рака, национальные институты здравоохранения, по контракту HHSN261200800001E. Содержание этой публикации, не обязательно отражают взгляды или политику Департамента здравоохранения и социальных служб, ни упоминание названия торговых марок, коммерческих продуктов, или организаций означает одобрения правительства США.

1. подготовка проб наночастиц
<ol><li>Подготовьте исследование образца в Лал класс воды.</li>
	<li>Если образец pH находится за пределами диапазона 6-8, настройте pH с помощью пирогена свободного гидроксида натрия или соляной кислоты.</li>
	<li>С помощью Лал класс воды подготовить несколько разведен?...

<ol>
	<li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses.">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li><li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans:+an+overview.">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll+receptors,+CD14,+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS.">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li><li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Endotoxins Test. , (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).</li><li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+70+years+of+pyrogen+detection:+Current+state+and+future+perspectives.">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li><li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection.">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li><li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms:+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+(LAL).">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li><li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples.">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li><li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test.">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li><li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs:+Challenges,+considerations+and+strategy.">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations.">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation.">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations.">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li><li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System.">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li><li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry.">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li><li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry.">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li><li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin:+evaluation+of+different+test+methods.">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).</li><li>. NCL assay cascade Available from: <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015)</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity.">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li><li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices:+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test.">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li><li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+pyrogenicity+testing:+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+(MAT).">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li><li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines.">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxil(R)--the+first+FDA-approved+nano-drug:+lessons+learned.">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays.">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).</li><li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent:+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking.">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li><li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition.">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles.">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+(lipopolysaccharide)+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles,+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation.">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li></ol>

Информация, представленная в настоящем протоколе было описано до15,26 и опирается на ряд нормативных документов, опубликованных в США продуктов питания и медикаментов (FDA, США или FDA) и Фармакопеи США (USP)4 , 5 , 6</s...

Эндотоксина является строительным блоком грамотрицательных бактериальных клеточных стенок1,2. Он может активировать клетки иммунной системы в очень низкой концентрации (пикограмм)1,2. Провоспалительных медиаторов (цитокинов, лейкотриенов, эйкозаноидов, и т.д.) производятся клетками в ответ на эндотоксина отвечают за лихорадка, гипотония, гипертония и более серьезные проблемы здравоохранения, включая несколько полиорганной недостаточности 1 , 2 , 3. тяжесть иммунной опосредованного побочных эффектов, вызванных эндотоксина зависит от его потенции определяется эндотоксина состав и структура и измеряется в международных эндотоксина единиц (IUs или EUs)3. Количество этих единиц на килограмм массы тела используется для задания порога пирогенных дозы эндотоксина. Эта доза является 5 ЕС/кг для лекарственных средств осуществляется через все маршруты но Интратекальное маршрут. Препараты, дозированной на квадратный метр поверхности тела, внутриглазной жидкости, радиофармацевтические препараты и продукты управляемых через Интратекальное маршрута имеют разные порог пирогенных дозу, которая составляет 100 ЕС/м2, 0,2 ЕС/мл, 175 ЕС/V (где V- объем продукта, предназначенные для администрирования) и 0,2 ЕС/кг, соответственно4. Подробнее о порог пирогенных дозы для различных лекарственных средств и устройств предоставляются и обсуждаться в другом месте4,5,6.
Животные отличаются в их чувствительность к эндотоксинов опосредованной реакций. Среди наиболее чрезвычайно чувствительны к эндотоксинов3видов людей, нечеловеческих приматов и кроликов. Чтобы избежать эндотоксинов опосредованной побочных эффектов у пациентов и предотвратить неточные выводы доклинических токсичности и эффективности исследований, важно для точного выявления и количественной оценки эндотоксинов в обе формулировки доклинические и клинические класса. Несколько имеющихся в настоящее время методов можно добиться выполнения этой задачи. Одним из них является assay Limulus Lysate Amoebocyte (Лал), который широко используется во всем мире для экрана биомедицинских продуктов для потенциальных эндотоксина загрязнения, а также относительно выявления бактериальных инфекций7,8,9. Lysate готовится из amoebocytes, клетки присутствует в крови подковы крабов Limulus Полифема проживающих в Восточном берегу континента Северной Америке7. Интересно, что есть несколько различных видов подковы крабов (Tachypleus gigas и Tachypleus tridentatus) в Азии10. Tachypleus Lysate Amoebocyte (Таль) используется в нескольких странах Азии для обнаружения эндотоксинов аналогичны как Лал используется в других cuntries10. Лизатов (Лал и Таль) содержат группы белков, которые после активации предоставляют активности протеаз. Один из этих белков, так называемый фактор C активируется при контакте с эндотоксин. Активированный фактор C расщепляет фактор B, который в свою очередь также становится протеазы и расщепляет про свертывания фермента производить фермент свертывания крови. Результатом этой цепи реакций является формирование гель, увеличение образца мутности и, при наличии Хромогенный субстрат, появление цветных продукта, которые служат основой для гель сгусток, мутность и хромогенных анализов, соответственно. Пока не существует обязательной Лал формата, США продуктов питания и медикаментов (FDA) объясняет в руководстве для промышленности документа, что в случае расхождения в результатах теста между различными форматами Лал, решение принимается на основании гель сгусток assay5 .
Многие часто используемые Лабораторные химикаты (например., ЭДТА) и известных наркотиков продуктов (например, пенициллин) вмешиваться в Лал assays11. Вмешательство обычно определяется путем оценки восстановления стандартных эндотоксина шипами в известных концентрациях в решение, содержащее тестовый материал. Если Спайк восстановления менее чем 50% или более чем на 200%, то в результате Лал проба для данного испытания материал является недопустимым из-за торможения или повышение, соответственно4. Составы на основе нанотехнологий часто сложны и мешать Лал через различные механизмы12,,1314. Были описаны многие подходы для преодоления вмешательства: пример воссоздания в конкретных буферов и ПАВ, инактивация белка путем нагревания, уничтожение липидов-материалов на основе полых путем нагрева и дополняющего образца с избытком двухвалентной катионов5,12,13,14,15. Также были описаны альтернативные методы для ситуаций, когда Лал вмешательство не может преодолеть: ELISA, мобильный репортер ГЭС-TLR4 линия пробирного и масс-спектрометрии16,,1718, 19.
Здесь описаны экспериментальной процедуры для проведения гель сгусток, мутность и хромогенных Лал анализов. Эти анализы также доступны на веб-сайт Лаборатории характеристика нанотехнологий (NCL)20 в протоколах STE1.2 (мутность Лал), STE1.3 (гель сгусток Лал) и STE1.4 (хромогенных Лал). Рекомендуется проводить по крайней мере два различных форматов характеризовать же нано разработке. Когда результаты мутность и хромогенных Лал согласны, гель сгусток результаты считаются5. Когда результаты двух форматов Лал согласны, дополнительные исследования с использованием Моноцит активации тест (мат) или кролик пирогена тест (RPT) для проверки Лал выводы, провел21. Важно отметить, что каждый метод, используемый для обнаружения эндотоксинов и pyrogenicity оценки имеет свои преимущества и недостатки21,,2223,24. Признавая ограничения процедуры, используемые для характеристики данного нанотехнологии формулировка имеет важное значение для получения научного обоснования оптимального для этого нано разработки процедуры для использования.
В этом исследовании Пегилированный липосомальных доксорубицин был использован как формулировка наночастиц модели. Эта формулировка был одобрен FDA США в 1995 году и используется для лечения раковых больных во всем мире25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Turbidity LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>T0051</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity assay only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogenic LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrochrome LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>CG1500-5</td>
			<td>This reagent is specific to the Chromogenic Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>EC010</td>
			<td>This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-Clot LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>G5003</td>
			<td>This reagent is specific to the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TS050</td>
			<td>These tubes are for use with the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays

Когда присутствует в фармацевтической продукции, грамотрицательных бактериальных клеточных стенок компонент эндотоксина (часто также называют липополисахарида) может вызвать воспаление, лихорадка, гипо - или гипертензия и, в крайних случаях, может привести к повреждения тканей и органов, которые может стать смертельным. Таким образом, количество эндотоксина в фармацевтической продукции, строго регламентированы. Среди методов, доступных для обнаружения эндотоксинов и количественной оценки пробирного Limulus Lysate Amoebocyte (Лал) широко используется во всем мире. Хотя любой фармацевтический продукт может мешать Лал assay, нано составы представляют собой особую проблему из-за их сложности. Этот документ призван служить практическим руководством для исследователей неопытных в оценке эндотоксинов в инженерии наноматериалов и сформулированы наночастиц наркотиков. Здесь обсуждаются практические рекомендации для выполнения трех Лал форматов, включая мутность, Хромогенный и гель сгусток анализов. Эти анализы могут использоваться для определения эндотоксина загрязнения на основе нанотехнологий лекарственных препаратов, вакцин и адъювантов.

В таблице 1приведен пример данных, сформированное после тестирования эта формулировка в Лал анализов. Пегилированный липосомальных доксорубицин вмешивались хромогенных Лал при разбавлении 5. Однако это вмешательство было преодолено больше разведений. Спай?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Обнаружения эндотоксинов в инженерии наноматериалов представляет собой один из Гранд вызовы в области наномедицины. Здесь мы представляем тематическое исследование, которое описывает платформу, состоящий из трех различных форматов Лал оценить потенциальное загрязнение эндотоксина в наночастиц.

Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Этот метод может помочь ответить в медицинской области о безопасности нано лекарств. Преимущества этого метода является то, что он является стандартным, и используется во всем мире для оценки продуктов, нано лекарства. Демонстрация процедуры, будет Барри Нойн, на Nano технологии Характеристика лаборатории.Для стандартной калибровки используется 900 микролитров лимулус-амибоцитов лизатата, или воды класса LAL. И 100 микролитров контрольного стандартного эндотоксина, чтобы подготовить как можно больше промежуточных разбавлений по мере необходимости, чтобы обеспечить подготовку стандарта калибровки с концентрацией одного эндотоксина единицы на миллилитр. Затем с помощью 900 микролитров воды класса LAL и 100 микролитров одного эндотоксина на миллилитр калибровки стандарта, подготовить второй стандарт калибровки, в концентрации 0,1 эндотоксина единицы на миллилитр.Затем повторите серийное десятикратное разбавление, чтобы подготовить два более низких стандарта калибровки. Чтобы получить в общей сложности четыре стандарта калибровки, начиная от 0001 до одного эндотоксина единицы на миллилитр. Для подготовки 05 эндотоксин единицы на миллилитр контроля качества, сочетает в себе 50 микролитр одного эндотоксина единицы на миллилитр контрольного стандартного эндотоксина раствора, с 950 микролитров воды класса LAL.Далее в программном обеспечении выберите настройки инструмента и создайте шаблон. Выберите сбор данных и введите тестовый идентификатор и группу данных в общей вкладке. Под аппаратной вкладкой выберите тип инструмента и метод LAL и убедитесь, что на экране появляется серийный номер, идентификатор системы и информация о серийном порту.Нажмите хорошо два раза, чтобы подтвердить выбор инструмента, и связь с инструментом, и ввести образец ID в том же порядке, что образцы будут протестированы. Затем используйте кнопки по умолчанию, чтобы ввести стандартную кривую отрицательного управления и протестировать образцы. Добавьте соответствующий объем отрицательных стандартов калибровки контроля и контроля качества в дублирующие предварительно помеченные стеклянные трубки.И добавить соответствующий объем LAL к первому тесту мерзкий. Vortex мерзкий кратко, и поместите флакон в соответствующие слоты испытаний в приборной карусели. Перед загрузкой образцов выполните несколько разбавления испытательного наноматериала в пределах максимально допустимого разбавления, как это было продемонстрировано.Для подготовки 05 эндотоксин единицы на миллилитр контроля повышения ингибирования, объединить 25 микролитров одного эндотоксина единицы на миллилитр контрольного стандартного эндотоксина раствора, с 475 микролитров тест нано материала при данном разбавлении. После вихрей загрузите соответствующие элементы управления усовершенствования инноваций и неспикуювые образцы исследования в прибор. Затем aliquot unspiked и шипами нано материалов при определенном разбавлении в предварительно помеченных труб.Перед вихрем, и загрузка в инструмент карусели. Для выполнения Гель-Клот LAL, подготовить контроль стандартный эндотоксин для окончательной концентрации четырех lambda, и объединить 100 микролитров стандарта, с 100 микролитров воды, или тестовый образец для достижения окончательной концентрации контроля стандартного эндотоксина два lambda. Добавьте 100 микролитров лизина к каждому разбавлению лямбды.Vortex трубки кратко, и место стойки труб в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение одного часа. В конце инкубации, инвертировать трубы с плавным движением, и вручную записывать результаты, используя плюс для твердого сгустка, и минус для не сгусток, или свободный сгусток. В этом репрезентативном анализе, PEGylated липосомальный доксорубицин мешали хромогенного LAL при разбавлении пять, однако это вмешательство было преодолено при более высоких разбавлениях.Восстановление Спайка было между 50 и 200%, когда формула была протестирована при разбавлении 50 и 500 в мутности и хромогенном LAL, а также при разбавлении пяти, в мутности LAL. При корректировке фактором разбавления, результаты были последовательны между заблуждениями в обоих эссе. Кроме того, результаты согласуются между тремя форматами эссе.Помните, что каждый образец имеет свой собственный диапазон разбавлений, каждый формат LAL использует свой стандарт управления в доксином и лисаде, и что трубки, используемые для подготовки разбавления, и для выполнения реакции на различных для каждого эссе LAL. Для этой процедуры другие методы, такие как может быть выполнена, чтобы ответить на дополнительные вопросы о материале После его развития, этот метод проложил путь для швов и области нано медицины, для изучения медицинских применений нано-технологий, сформулированных препаратов в организме человека, и клинических моделей, включая, но не ограничиваясь не человеческих приматов, кроликов, собак и крыс. Не забывайте, что работа с доксином может быть чрезвычайно опасной и такие меры предосторожности, как ношение средства индивидуальной защиты, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Разработка пользовательских яичника китайского хомячка, клетки-хозяина белка Анализы использованием Акустические технологии, микрочастицы Мембранные

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Изготовление Электрохимические ДНК-биосенсоры для Безреагентная Обнаружение нуклеиновых кислот, белков и малых молекул

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Обнаружение и изоляция циркулирующих клеток меланомы использованием Фотоакустическая флоуметрии

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Бактериальные обнаружения и идентификации с использованием электрохимических датчиков

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Жесткость на изгиб измерений биополимеров Использование Gliding Анализы

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Анатомические реконструкций сердца человека венозной системы использованием контраста Компьютерная томография перфузии фиксированных экземпляров

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Бусы агрегации Анализы для характеристики Предполагаемые клеточной адгезии молекул

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Этикетка без одной молекулы обнаружения, используя Microtoroid оптических резонаторов

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Многоцветная флуоресценция обнаружения для дроплета Microfluidics Использование оптических волокон

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...